Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Хроническая болезнь почек как важная медицинская и социальная проблема (обзор литературы) 5
1.1. Морфогенетические белки FGF-23, Klotho и гликопротеин склеростин – новые маркеры кардиоренальных взаимоотношений при ХБП 14
1.2. Роль FGF-23, Klotho в регуляции гомеостаза фосфора, кальция, витамина D и минерализации костной ткани при ХБП 21
1.3. Изменение соотношения FGF-23/Klotho/склерости при хронической болезни почек 24 1.4.Роль FGF-23 в развитии уремической кардиомиопатии, эктопической кальцификации при ХБП 26
1.5. FGF-23, Klotho и склеростин - прогностические маркеры при ХБП... 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 390
2.1 Дизайн исследования 39
2.2. Характеристика обследованных больных 40
2.3.Специальные методы исследования
2.3.1. Определения сывороточной концентрации FGF-23, s-Klotho и склеростина 45
2.3.2. Электрокардиография 47
2.3.3.Эхокардиография 47
2.3.3. Определение центрального давления и скорости распространения 49
пульсовой волны с помощью прибора «СфигмаКор» (Австралия)
2.3.4.Методы статистической обработки данных 50
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 52
3.1. Показатели морфогенетических белков - FGF-23, sKlotho и
гликопротеина склеростина в сыворотке крови больных ХБП 52
3.1.1. Взаимосвязь показателей FGF-23, s-Klotho и с клеростина с уровнем фосфора, кальция, ПТГ в сыворотке крови и экскрецией фосфора 56
3.1.2. Роль FGF-23, s-Klotho и склеростина в развитии жесткости сосудов и ремоделировании сердца при ХБП 64
4. Связь морфогенетических белков FGF-23, s-Klotho и гликопротеина склеростина с традиционными факторами почечного повреждения и развития ССО 80
4.1. Изменение сывороточного уровня FGF-23, Klotho и гликопротеина склеростина в зависимости от наличия и тяжести артериальной гипертонии у больных ХБП 80
4.2. Изменение сывороточного уровня морфогенетических белков -FGF-23, Klotho и гликопротеина склеростина в зависимости от наличия и тяжести анемии у больных ХБП 84
4.3. Изменение сывороточных концентраций FGF-23, Klotho и склеростина в зависимости от уровня суточной протеинурии, белково энергетической недостаточности (БЭН) и факторов не иммунного воспаления 85
5. Влияние нефропротективной терапии на коррекцию сывороточного уровня морфогенетических белков - FGF-23, s-Klotho и гликопротеина склеростина у больных ХБП 95
5.1. Значение кетоаналогов незаменимых аминокислот и ограничения белка в диете напродукцию FGF-23 и s-Klottho у больных ХБП 95
5.2. Значение анатигипертензивной терапии с применением ингибиторов АПФ, блокаторов рецепторов ангиотензина напродукцию сывороточного уровня Klotho у больных ХБП 99
5.3. Значение сывороточного уровня FGF-23 как маркера эффективности лечения гиперфосфатемии фосфатбиндерами при ХБП.. 102
5.4. Значение коррекции анемии и дефицита железа стимуляторами эритропоэза (эпоэтин + железо) на сывороточный уровень Klotho у больных 3Б-4 стадиями ХБП с анемией 104
5.5. Влияние гемодиализа и режима диализной терапии на
продукцию сывороточного уровня FGF-23 и склеростина 106
Заключение 109
Выводы 115
Практические рекомендации 117
Список литературы
- Роль FGF-23, Klotho в регуляции гомеостаза фосфора, кальция, витамина D и минерализации костной ткани при ХБП
- Определения сывороточной концентрации FGF-23, s-Klotho и склеростина
- Взаимосвязь показателей FGF-23, s-Klotho и с клеростина с уровнем фосфора, кальция, ПТГ в сыворотке крови и экскрецией фосфора
- Изменение сывороточных концентраций FGF-23, Klotho и склеростина в зависимости от уровня суточной протеинурии, белково энергетической недостаточности (БЭН) и факторов не иммунного воспаления
Введение к работе
Актуальность темы
Среди актуальных задач внутренней медицины, ведущее место по-прежнему занимают профилактика и лечение сердечно-сосудистых заболеваний, которые составляют основную причину смерти среди населения [Sarnak M.J. et al., 2003; McCullough P.A., Assad H., 2012]. В этом отношении Хроническая болезнь почек (ХБП) как одно из распространенных популяционных заболеваний, имеющих не только общемедицинское, но и социально-экономическое значение, привлекает пристальное внимание исследователей с точки зрения частоты сердечно-сосудистых осложнений (ССО). По данным Foley и нашим собственным данным, летальность от ССО среди больных с ХБП в 10 раз, а среди лиц молодого возраста в 100 и более раз выше, чем в общей популяции [Foley R. et al., 2005; Милованова Л.Ю., 2010].
Ремоделирование миокарда сердца и кальцификация сосудов лежат в основе развития ССО при ХБП, являясь мощными независимыми факторами риска смерти больных [Wright J., Hutchison A., 2009].
Понимание основных механизмов, ведущих к артериальной кальцификации и гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ) при ХБП важно для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на снижение ССО, уменьшение экономических затрат на заместительную почечную терапию (ЗПТ), госпитальное лечение и в целом на увеличение общей выживаемости больных ХБП.
Поиск возможных ранних маркеров развития ССО обусловил интерес к изучению идентифицированных в последние годы факторов - морфогенетических белков - фактору роста фибробластов-23 (FGF-23) и Klotho (sКлото), которые изучались первоначально только с точки зрения их участия в регуляции костно-минерального обмена при ХБП [Saito Y. et. Al., Cha S.K. et al., 2008; Brandenburg V.M., 2013]. К настоящему времени стала понятной более широкая функциональная роль FGF-23 и sКлото, в том числе как гуморальных факторов, вовлеченных в процессы ремоделирования сердца и сосудов при ХБП [Lavi-Moshayoff V., 2010]. Кроме того, недавно открытый гликопротеин склеростин, секретируемый остеоцитами, стали оценивать, наряду с FGF-23 и sKlotho, как возможного
участника внекостной кальцификации, включая сердце и сосуды, при ХБП [ Drechsler C. Et al., 2015].
В то же время, большинство исследований, посвященных проблеме сердечнососудистого ремоделирования и кальцификации при ХБП, с позиции роли в этом процессе морфогенетических белков и склеростина, было проведено преимущественно в эксперименте, в клинических условиях - главным образом на диализной популяции больных. У больных с додиализными стадиями ХБП эта проблема наименее изучена.
Цель исследования
Установить значение изменений сывороточного уровня морфогенетических белков (FGF-23, sKlotho) и функционально тесно связанного с ними, гликопротеина склеростина для оценки почечного и кардиального прогноза при ХБП и эффективности кардио-нефропротективной стратегии
Задачи исследования
У больных ХБП 1 - 5D стадий:
1.Определить роль морфогенетических белков – FGF-23, sKlotho, и гликопротеина склеростина, среди традиционно изучаемых регуляторов минерально-костного обмена - паратиреоидного гормона (ПТГ) и витамина D, возможность использования этих белков в качестве ранних диагностических маркеров костно-минеральных нарушений и риска развития вторичного гиперпаратиреоза (ВГПТ).
2. Изучить связь между изменениями в системе морфогенетических белков FGF-23, sKlotho и склеростина и формированием ремоделирования сердца [увеличение индекса массы миокарда левого желудочка (ИММЛЖ), конечного диастолического объема (КДО), конечного систолического объема (КСО) и др., по данным эхокардиографии (Эхо-КГ)] и сосудов (увеличение индекса аугментации, скорости пульсовой волны - методом сфигмографии), кальциноза клапанов сердца
(по данным Эхо-КГ) и магистральных артерий (при рентгенографии брюшной аорты по методу Kauppila).
3. Оценить возможное прямое влияние повышения в сыворотке крови уровня FGF-
23 на морфофункциональные показатели миокарда (ИММЛЖ,
субэндокардиальный кровоток, уровень тропонина I (у больных без клинической
манифестации ОИМ и ОКС)
-
Изучить характер изменения сывороточных показателей FGF-23, sKlotho и склеростина у больных, получающих терапию различными видами диализа (гемодиализ, гемодиафильтрация), уточнить возможность использования этих показателей для мониторирования эффективности диализа, ранней диагностики развития осложнений (ВГПТ, белково-энергетической недостаточности (БЭН), MIA- синдрома и др.)
-
Определить влияние на нарушения соотношения FGF-23/sKlotho/склеростин лекарственных средств, используемых для кардионефропротекции: ингибиторов АПФ, сартанов, фосфатбиндеров, селективных активаторов рецепторов к витамину D, препаратов эпоэтина и железа, малобелковой диеты (МБД), дополненной кетоаналогами аминокислот.
-
Изучить возможность практического использования определения в сыворотке крови FGF-23, sKlotho и склеростина для оценки прогноза ХБП и совершенствования персонифицированного подхода к выбору кардионефропротективной терапии, начиная с ранних стадий ХБП
Научная новизна исследования
Впервые в отечественной научно-клинической медицине проведена комплексная сравнительная оценка сывороточного уровня морфогенетических белков – фактора роста фибробластов FGF-23, циркулирующей формы белка Klotho (sKlotho) и гликопротеина склеростина - как факторов риска развития ССО, на основе изучения больных ХБП. Показано, что сывороточные показатели FGF-5
23, sKlotho и склеростина являются ранними маркерами формирования ССО и
прогрессирования ХБП. Обнаружена статистически значимая взаимосвязь
снижения сывороточного уровня sKlotho с повышением АД, частотой выявления
кальцификации магистральных артерий и сердца, анемией, белково-энергетической
недостаточностью, наиболее сильная в группе пациентов, которым не удалось
достичь адекватной коррекции уровня АД, анемии, БЭН. Выявлена прямая
корреляция повышения сывороточного уровня FGF-23 с выраженностью
ремоделирования ЛЖ, в том числе подтверждено прямое токсическое влияния
FGF-23 на миокард, проявляющееся повышением уровня тропонина-I в сыворотке
крови. Впервые в отечественной и зарубежной клинической практике
подтверждено значение оценки динамики изменений сывороточных показателей
морфогенетических белков и гликопротеина склеростина в качестве маркеров
эффективности нефрокардиопротективного действия ингибиторов
ангиотензинпревращающего фермента (иАПФ) и сартанов, назначаемых в сочетании с селективными аналогами витамина D, фосфатсвязывающими препаратами, стимуляторами эритропоэза (эритропоэтины и железо), малобелковой диетой и кето/аминокислотами (КА).
Практическая значимость исследования На основании проведенного исследования, определены новые подходы к оценке кардиоренальных взаимодействий у больных ХБП с использованием определения в сыворотке крови морфогенетических белков - FGF-23,sKlotho и склеростина. Показано, что снижение сывороточного уровня sKlotho является фактором высокого риска кальциноза сердца и магистральных артерий; повышение уровня FGF-23 – более ранним, чем сывороточный уровень паратиреоидного гормона (ПТГ), маркером формирования вторичного гиперпаратиреоза (ВГПТ), и показателем, прямо коррелирующим с выраженностью ГЛЖ. Повышение сывороточного уровня склеростина может расцениваться как протективный фактор, имеющий значение при определении риска кальцификации сердца и сосудов.
Обоснована целесообразность использования сывороточных показателей FGF-23, sKlotho и склеростина в качестве ранних диагностических маркеров костно-минеральных нарушений и в целом для оценки прогноза ХБП. Установлена информативность этих показателей при мониторировании результатов проводимой кардионефропротективной терапии.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Морфогенетические белки и гликопротеин склеростин являются неотъемлемой частью общей системы регуляции костно-минерального обмена; их изменения -повышение сывороточного уровня FGF-23, склеростина и снижение sKlotho определяются уже в начальной (3А) стадии ХБП, предшествуя развитию гиперфосфатемии и повышению уровня ПТГ, и могут рассматриваться как ранние биомаркеры костно-минеральных нарушений у больных ХБП.
-
Нарушения функции морфогенетических белков и склеростина прогрессируют по мере нарастания почечной недостаточности, приводят к развитию ВГПТ и одновременно создают предпосылки для возникновения ССО, БЭН, анемии, железодефицита и воспаления, что необходимо учитывать при разработке общей стратегии мер по коррекции нарушений костно-минерального обмена и минимизации сердечно-сосудистого риска при ХБП
3. Снижение сывороточного уровня sKlotho и увеличение - склеростина
коррелирует с выраженностью АГ, увеличением ИММЛЖ и кальцификацией
сердца и сосудов. Повышение в сыворотке уровня FGF-23 у больных ХБП
оказывает прямое, независимое от уровня АД, токсическое влияние на миокард с
увеличением уровня тропонина –I. Эти нарушения могут служить маркером
формирования ремоделирования сердца и сосудов.
4. Кардионефропротективная терапия у больных ХБП ассоциируется с более
высоким сывороточным уровнем sKlotho и менее выраженным кальцинозом
сердца и сосудов при применении иАПФ и сартанов, чем при использовании
других антигипертензивных препаратов. Сочетание иАПФ и сартанов с селективными активаторами витамина Д (парикальцитол), стимуляторами эритропоэза (эпоэтин + железо), фосфатбиндерами (некальцийсодержащими – севеламера гидрохлорид) малобелковой диетой с добавлением кетоаналогов аминокислот сопровождается еще более эффективным уменьшением сердечнососудистого риска, указывая на роль морфогенетических белков и в первую очередь - поддержания секреции sKlotho, в торможении процессов ремоделирования сердца и сосудов и механизмах реализации кардионефропротективных эффектов этих препаратов
Внедрение в практику
Результаты исследования используются в практической работе отделений нефрологии и искусственная почка клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева УКБ №3 Первый МГМУ им.И.М. Сеченова, в лекционном курсе и практических занятиях со студентами и курсантами кафедры внутренних, профессиональных заболеваний и пульмонологии; включены в клинические рекомендации по ведению больных с ХБП, одобренные Минзравом РФ, 2014г.
Апробация работы
Апробация работы проведена на совместном заседании кафедры нефрологии
и гемодиализа, кафедры внутренних, профессиональных болезней и
пульмонологии и отдела нефрологии НИЦ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова 24
июня 2016 г., протокол № 11.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 78 печатных работ, в том числе 65 – в журналах, рецензируемых ВАК. Результаты работы доложены на:
1. Юбилейном XX Форуме "Национальные дни лабораторной медицины России - 2016" (14-16 сентября 2016 г., Москва, СК "Олимпийский" Общероссийская междисциплинарная научно-практическая конференция с международным участием «Консолидация лабораторной медицины и клинической практики: диагностические инновации, лабораторная индустрия»)
-
Общероссийской научно-практической конференции «Дни Нефрологии в Москве - 2016»
-
Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 55- летию медицинского факультета РУДН
-
XIII Всероссийском конгрессе с международным участием «Артериальная гипертония 2017», Уфа, март 2017
-
IX Russian Dialysis Society Conference «Renal Week 2015», September 15-19, St. Petersburg, Russia (награда за лучший доклад)
-
53rd Congress ERA-EDTA (European Renal Association – European Dialysis Transplant Association), Vienna, Austria, May 21-24, 2016
-
54 Congress ERA-EDTA, Madrid, Spain, June 3-6, 2017
Объем и структура диссертации
Роль FGF-23, Klotho в регуляции гомеостаза фосфора, кальция, витамина D и минерализации костной ткани при ХБП
Гликопротеин cклеростин синтезируется остеоцитами, является ингибитором Wnt- сигнального пути через который осуществляется регуляция (активация) костеобразования [5]. Было показано, что уровень cклеростина увеличен у больных, получающих лечение ГД, обратно коррелирует с уровнем ПТГ в сыворотке крови и скоростью костеобразования [7]. Полагают, что повышенная экспрессия cклеростина остеоцитами является ранним изменением при ХБП [8], и играет существенную роль в патофизиологии минерально-костных нарушений при ХБП, в частности повышает резистентность костной ткани к ПТГ. По мнению ряда авторов, повышение сывороточного уровня склеростина ассоциировано с плохим прогнозом у больных ТПН. В то же время, имеются публикации, в которых показано,что повышенный уровень cклеростина, наоборот коррелировал с лучшей выживаемостью у больных на программном ГД [9]. Кроме того, взаимоотношения повышенного сывороточного уровня cклеростина с другими маркерами МКН-ХБП, такими как FGF-23 и циркулирующей формой белка Klotho (s-Klotho), а также ранее установленными факторами риска прогрессирования ХБП и ее осложнений (воспаление, анемия, БЭН, АГ, гиперфосфатемия, гипокальциемия и др.) также еще не выяснены.
Wnt/-катениновый сигнальный путь играет ключевую роль во множестве биологических процессов, так или иначе связанных с дифференцировкой, миграцией и пролиферацией клеток [83]. Этот путь вызывает дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток по остеобластному пути и усиливает их пролиферацию. Кроме того, он подавляет пролиферацию остеокластов за счет стимулиции экспрессии остеопротегерина, антагониста фактора дифференцировки остеокластов RANKL [84]. Все эти влияния в сумме обеспечивают выраженный анаболический эффект активации Wnt/-катенинового сигнального пути. Как уже было отмечено выше, кальциноз артерий в основном связана с фенотипическими изменениями гладкомышечных клеток сосудов, сопровождающиеся их превращением в остеобластоподобные клетки, при этом остеогенная дифференцировка клеток сопровождается активацией соответствующей транскрипционной программы (клетки начинают экспрессировать остеоцит-специфичные белки, в том числе FGF23 и склеростин) за счет активации Wnt/-катенинового сигнального пути уже в сосудах [69, 85].
Несмотря на то, что в последнее время исследователям удалось обнаружиить несколько ингибиторов Wnt/-катенинового сигнального пути, основное внимание сейчас приковано к склеростину.
Cejka I.G. и соавт. [61] впервые показали, что у пациентов на гемодиализе сывороточная концентрация склеростина выше, чем в общей популяции. [87] Впоследствии эти данные были неоднократно подтверждены результатами других небольших исследований, посвещенных изучению роли склеростина у пациентов, находящихся на регулярном гемодиализе [88-90] в связи с чем до конца не понятно, связано ли это с усилением экспрессии, или же является следствием снижения фильтрующей функции почек и ретенционной задержки склеростина в крови.
В настоящее время подробно изучается влияние высоких концентраций склеростина на риск ССО. Данные опубликованных исследований, посвещенных этому вопросу, неоднозначны. Имеются публикации, что высокая концентрация склеростина напрямую связана с повышенным риском кальцификации сердечно-сосудистой системы [95]. В то же время, после проведения множественной регрессии часть исследователей приходит к выводу о том, что несмотря на повышение его концентрации при ХБП склеростин играет роль протективного фактора. Так, по данным Viaene L. и соавт. [89] у пациентов, находящихся на гемодиализе и имеющих высокий сывороточный уровень склеростина, риск сердечно-сосудистых осложнений почти в два раза ниже. В свою очередь, Claes K.J. и соавт. [92] провели исследование, в которое вошли 154 пациента с ХБП. Согласно результатам однофакторной логистической регрессии, высокая концентрация склеростина была напрямую связана с наличием кальцинатов в аорте. Однако после проведения множественной логистической регрессии было выяснено, что кальцинаты в аорте чаще всего возникают при низкой концентрации склеростина в сыворотке.
Таким образом, патогенез сердечно-сосудистых осложнений при ХБП представляет собой сложную систему, в которой задействовано множество взаимосвязанных факторов среди которых cклеростин, FGF-23 и Klotho могут играть важную роль в развитии ремоделирования миокарда и эктопической кальцификации артерий на ранних этапах этих процессов. Однако клиническое значение сывороточной концентрации гликопротеина склеростина и морфогенетических белков - FGF-23 и Klotho до сих пор остается до конца не выясненным. Те данные о роли этих факторов в патогенезе сердечно-сосудистых осложнений при ХБП, которые присутсвуют в литературе, указывают на необходимость системного клинического подхода к изучению патогенеза ССО при ХБП. Для окончательного выяснения роли этих факторов и влиянии их сывороточных уровней на сердечно-сосудистую систему необходимо проведение дополнительных исследований.
Определения сывороточной концентрации FGF-23, s-Klotho и склеростина
У всех больных определяли наличие кальцинатов в клапанах сердца и аорте (соответственно на основании эхокардиографии и рентенографии брюшного отдела аорты в боковой проекции по методу Kauppila); о степени нарушения демпфирующей функции артерий и давлении в аорте судили на основании изменения скорости пульсовой волны, индексов аугментации определяемых с помощью прибора «SphygmaCor ArtCor», Австралия)
Кроме того, оценивали влияние на продукцию морфогенетических белков – FGF-23, s-Klotho и гликопротеина склеростина ряда препаратов, применяемых для нефропротекции – кетоаминокислот (КА) в сочетании с малобелковой диетой (МБД), иАПФ и блокаторов ангиотензиновых рецепторов и др, а также фосфат-связывающих препаратов, эритропоэтина и железа, активных метаболитов витамина D. 2.3. Специальные методы исследования
Помимо общеклинического обследования больных, принятого в нефрологическом отделении, для решения поставленных задач проводили специальные исследования. Определяли показатели фосфорно-кальциевого обмена, такие как интактный паратиреоидный гормон (иПТГ), сывороточный уровень общего и ионизированного кальция, неорганического фосфора, щелочной фосфатазы (ЩФ), а также величину суточной экскреции фосфора и кальция с мочой. Для диагностики синдрома хронического воспаления определяли уровень С - реактивного белка (СРБ), фибриногена, ферритина в сыворотке крови, СОЭ.
Белково-энергетическую недостаточность диагностировали по следующим критериям: 1. Индекс массы тела (индекс Кетле, кг/м2), рассчитанный по формуле: ИМТ=M/L2, где M- масса тела в килограммах; L – рост человека, измеренный в метрах ивозведенный в квадрат. Снижение ИМТ ниже 18,5 кг/м2 рассматривался как показатель недостаточности питания. 2. Сывороточный альбумин: уровень 35 г/л; 3. Сывороточный трансферрин 2,0 мг/л. У пациентов с гипоальбуминемией (альбумин в сыворотке крови 40 г/л) использовался показатель коррегированного на альбумин кальция, рассчитанный по рекомендованной организацией KDIGO (2012) по формуле: Са корр. в ммоль/л = Са общий +[(40- альбумин в г/л)0,02]
Исследование биохимических параметров крови проводили на биохимическом анализаторе Technicon (США).
У пациентов с ХБП 5D стадии проводился объем клинического, лабораторного и инструментального обследования аналогичный таковому у больных с более ранними стадиями ХБП.
В течение всего периода наблюдения за больными регистрировались случаи повторных госпитализаций по причине развития ССО, нарушений нутритивного статуса, необходимости коррекции антигипертензивной терапии.
У всех больных, клинические, биохимические показатели изучены на протяжении 1 года: на момент скрининга и конца периода наблюдения (12 мес). Среди 130 больных за период наблюдения 1-1,5 г. зарегистрировано 4 случая смерти, из них - все больные, получавшие лечение ГД (3- в течение 1-го года диализной терапии, 1 – через 6 лет от момента начала лечения постоянным ГД). Причинами летального исхода являлись ССО - острая сердечно-сосудистая недостаточность вследствие развития тяжелых некупируемых нарушений ритма, инфаркта миокарда, ХСН). 2.3.1. Определения сывороточной концентрации FGF-23, s-Klotho и склеростина
У всех обследованных больных ХБП, а также в контрольной группе (здоровых добровльцев) изучен сывороточный уровень FGF-23 (Human FGF-23 ELISA kit с использованием моноклональных антител к полной молекуле FGF-23), циркулирующей формы Klotho (Human soluble - Klotho ELISA kit с набором анти - Klotho антител) и склеростина (Human sclerostin ELISA kit). Забор цельной крови выполнялся у пациентов утром натощак, у диализных пациентов – через 2 дня после последнего сеанса ГД, перед началом очередной процедуры. В дальнейшем кровь центрифугировали в течение 15 минут со скоростью 30 000 оборотов/мин. Полученную таким образом сыворотку замораживали и хранили при температуре - 28С до накопления необходимого количества проб.
Исследование морфогенетических белков FGF-23, s-Klotho и гликопротеина склеростина проводили иммуноферментным анализом (иммунологический метод количественного определения белков на основании специфической реакции «антиген-антитело»). В каждом исследовании применен «сэндвич» - метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляли сыворотку, содержащую анализируемый антиген (FGF-23 или s-Klotho), и в процессе инкубации на первой стадии твердой фазы происходило образование комплекса «антиген-антитело». Затем носитель отмывали от не связавшихся компонентов и к нему добавляли меченные ферментом специфические антитела. После второй инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом, определяли носителя. На стадии выявления специфического иммунного комплекса антиген фиксировался между молекулами иммобилизированных и меченых антител. Ферментативная цветная реакция проходила в присутствии перекиси водорода и субстрата - неокрашенного соединения, которое в процессе пероксидазной реакции окислялось до окрашенного продукта на финальном этапе постановки. Интенсивность окрашивания зависила от количества выявленных специфических антител и оценивалась с помощью спектрофотометра.
Взаимосвязь показателей FGF-23, s-Klotho и с клеростина с уровнем фосфора, кальция, ПТГ в сыворотке крови и экскрецией фосфора
Учитывая опубликованные результаты исследования, указывающего на наличие взаимосвязи между уровнем С-реативного белка и нутритивными нарушениями при ХБП [93], мы также проанализировали изменение сывороточного уровня морфогенетических белков – FGF-23, s-Klotho и гликопротеина склеростина в зависимости от синдрома белково-энергетической недостаточности (табл. 23).
Показатели FGF-23, s-Klotho и гликопротеина склеростина в зависимости от синдрома белково-энергетической недостаточности у больных с 3Б-5 стадиями ХБП (n=60) Показатель, m±SD Me (ИКР) FGF-23, пг/мл (п=20) s-Klotho, пг/мл (п=20) Склеростин, пмоль/л (п=20) ИМТ, кг/м 2 ( 20 кг/м2) 1009,9 ± 3,9 98,8± 4,2 176,1±4,7 Альбумин, г /л ( 35 г/л) 32,8 ± 10,6 31,3±4,9 32,1±4,5 Трансферрин, г/л ( 2,0 г/л) 1,6,9±0,6 1,6,8±0,3 1,8,±0,4 С-реактивный 3,0±0,4 2,6±0,3 4,0±0,8 белок, мг/л ( 1 мг/л) Среди изученных больных с 3Б к 5 стадиями ХБП и наличием неимуннго воспаления и БЭН отмечались более высокие показатели FGF-23, склеростина и низкие Klotho по сравнению с больными сопоставимых стадий ХБП без воспаления и БЭН.
Мы также проанализировали изменение сывороточного уровня FGF-23, s-Klotho и склеростина у больных ХБП 3Б-5Д стадий в зависимости от основного параметра нутритивного статуса – сывороточного уровня альбумина. Установлена обратная корреляционная зависимость между сывороточным уровнем FGF-23 и альбумина (r= (-) 0,444; p 0,001 [рис. 36]. В то же время выявлена сильная прямая связь между уровнем s-Klotho и уровнем альбумина (r= (+)0,330; p 0,01) в сыворотке крови (рис. 37).
Выявленные корреляции между изменениями в сыворотке крови содержания морфогенетических белков - FGF-23, s-Klotho и гликопротена склеростина и изменениями основных параметров нутритивного статуса по мере прогрессирования ХБП от 3 к 5Д стадии позволяют рассматривать сывороточные уровни FGF-23, s-Klotho и склеростина в качестве ранних факторов риска формирования у больных ХБП БЭН. При этом сывороточный уровень s-Klotho может служить предиктором выраженности нутритивных нарушений при ХБП.
Наши данные согласуются с результатами экспериментального исследования [92] показавшего, что уремический токсин индоксил сульфат ускоряя деградацию белка, индуцирет развитие БЭН и подавляет экспрессию гена Klotho в почках, тем самым вызывая прогрессирование атеросклероза и тулоинтерстициального фиброза.
Среди больных ХБП на ГД с синдромом хронического воспаления, по данным дуплексного сканирования магистральных сосудов шеи, чаще (у 63,6%) выявляли атеросклероз/кальциноз общих сонных артерий, чем у больных (у 33,3%) без наличия воспаления (2 =4,25; p 0,05). Повышение уровня FGF-23 и склеростина и особенно снижение уровня Klotho в сыворотке крови коррелировало с частотой обнаружения атеросклеротических бляшек в сонных артериях (соответственно r=0,418; p 0,01; r=0,449; p 0,05 r=(-)359; p 0,05), что свидетельствовало о формировании у больных MIA-синдрома (англ. MIA - Malnutrition 98 Inflammation-Atherosclerosis), включающего в себя белково-энергетическую недостаточность, атеросклероз, системное воспаление.
Полученные нами результаты подтверждают данные Izquierdo M. C. и соавт. [84] о блокирующем эффекте латентного иммунного воспаления на секрецию белка s-Klotho в почечных канальцах у больных ХБП. 5. Влияние нефропротективной терапии на коррекцию сывороточного уровня морфогенетических белков - FGF-23, s-Klotho и гликопротеина склеростина у больных ХБП
Мы оценили влияние кето/аминокислот (КА) и ограничения белка на продукцию регуляторов фосфорно-кальциевого обмена - FGF-23 и s-Klotho у 50 больных с ХБП 3Б-4 стадий, соблюдавших в течение 12 мес малобелковую диету (МБД) - 0,6 г белка на кг массы тела в сутки. Больные были распределены на 2 группы: в 1-ю группу (основная группа) включили 25 больных ХБП, дополнявших МБД кетоаналогами аминокислот (КА) Кетостерил по 1 табл./5 кг массы тела/сутки. 2-ю группу (группа сравнения) составили 25 больных, которые также соблюдали МБД, но не принимали КА по личной мотивации. Группы были сопоставимы по возрасту, полу и степени снижения СКФ. Причиной ХБП у 26 больных был хронический гломерулонефрит и у 24 – тубулоинтерстициальный нефрит. Стадии ХБП определяли в соответствии с критериями KDIGO (2012). СКФ рассчитывали по уравнению CKD EPI. Среди наблюдаемых нами больных 1-й группы (n=25), получавших МБД в сочетании с КА признаки БЭН за время наблюдения зарегистрированы не были. В то же время у 5 больных (3 мужчин и 2 женщины) 2-й группы, не принимавших КА, спустя 3 мес отмечалось снижение индекса массы тела (ИМТ) до 17,9-18,0 кг/м2 (норма 18,5 – 24,9 кг/м2), в том числе мышечной массы тела у мужчин - до 29-30 % (норма 31,1- 39,1%), у женщин - до 23- 23,5% (норма 24,1-30,1%) [табл. 26].
Изменение сывороточных концентраций FGF-23, Klotho и склеростина в зависимости от уровня суточной протеинурии, белково энергетической недостаточности (БЭН) и факторов не иммунного воспаления
В проведенном нами исследовании выявлена прямая ассоциация повышения сывороточной концентрации FGF-23, склеростина и низкой концентрации s-Klotho с наличием воспаления – уровнем С-реактивного белка, белково-энергетической недостаточностью, уровнем протеинурии. Эти данные согласуются с результатами других авторов [94, 124], которые на основании выявления у больных ХБП 3-5 стадий повышенного уровня С-реактивного белка – неспецифического маркера воспаления и эндотелиальной дисфункции, рассматривают ХБП как состояние хронического воспаления.
В экспериментальных исследованиях повышение экспрессии Klotho сопровождалось уменьшением протеинурии и существенным снижением ангиотензина II у гипертензивных мышей с ХГН [124]. У наблюдаемых нами больных ХБП с АГ степень повышения АД обратно коррелировала с сывороточной концентрацией s-Klotho. Эта корреляция была наиболее сильной в группе больных, которым не удалось достичь адекватной коррекции АД. Напротив, в группе больных, которым удалось достичь и поддерживать целевой уровень АД с помощью ингибиторов АПФ и блокаторов ангиотензиновых рецепторов, по сравнению с группой больных с некорректированной АГ, отмечены более высокие показатели s-Klotho и менее выраженная степень ремоделирования миокарда [125].
У трансгенных мышей с высокой продукцией Klotho выявлена существенно меньшая степень кальциноза сосудов по сравнению с диким типом мышей с ХБП и сниженной продукцией Klotho [41]. Благоприятный эффект Klotho на сосудистый кальциноз был выражен в большей степени, чем его эффект на почечную функцию и фосфатурию, что связывают с прямым влиянием Klotho на сосуды.
Кальциноз сердца и сосудов в основном связан с фенотипическими изменениями сосудистых ГМК, которые начинают экспрессировать остеоцит-специфичные белки, в том числе и склеростин за счет активации Wnt/-катенинового сигнального пути [126-128]. . ПТГ увеличивает экспрессию FGF-23 через Wnt и протеинкиназа А - PKA (англ. Protein Kinase A) сигнальные пути (рис. 2.3) в результате блокирования тормозящего влияния гликопротеина склеростина. По данным ряда авторов сверхэкспрессия склеростина остеоцитами у больных на гемодиализе ассоциирована с уменьшением летальности диализных больных от различных причин, в том числе и вследствие уменьшения частоты ССО [59, 60, 75].
В исследованиях in vitro показано, что наряду с увеличением фосфатурии и стабилизацией СКФ Klotho супрессирует Na-зависимый захват эндотелием и сосудистыми ГМК фосфора, предупреждает дифференциацию сосудистых ГМК и минерализацию, индуцируемую гиперфосфатемией [124].
Накопленные данные позволяют рассматривать нарушение соотношения FGF-23/s-Klotho/склеростин и в качестве одного из ранних маркеров прогрессирования ХБП и развивающихся нарушений минерального обмена [126, 129].
По мнению ряда авторов, часть благоприятных эффектов s-Klotho на эндотелиально-сосудистую функцию при ХБП является результатом уменьшения трансдукции FGF-23 [121, 124].
Наши данные согласуются с результатами других авторов, показавших, что повышение FGF-23 прямо связано с выраженностью атеросклероза, ГЛЖ миокарда и кальцинозом сердца и сосудов [124]. В условиях снижения массы действующих нефронов и редукции рецепторов FGF-23 (FGFR1) в почках влияние FGF-23 при нарастании его уровня в сыворотке крови может распространяться на любые другие органы, экспрессирующие FGFR.
ГЛЖ с развитием у диализных больных диллятационной кардиомиопатии и ССО является независимым фактором риска смерти больных ХБП на регулярном ГД [124]. Высокий сывороточный уровень FGF-23 у больных ХБП коррелирует с увеличением ИММЛЖ. Влияние FGF-23 на развитие ГЛЖ и интерстициального кардиального фиброза осуществляется через активацию FGFR-рецепторов, особенно FGFR1, экспрессирующихся на миокардиальных клетках, которые могут быть блокированы in vitro с помощью ингибитора PD173074 (синтетический ингибитор FGF-23), не требуя наличия Klotho в качестве ко-рецептора. В масштабном исследовании CRIC (Chronic renal Isufficiency Cohort Study), в котором проанализированы клинические данные о 1 908 больных ХБП на додиализных стадиях, была установлена четкая связь между тяжестью ХБП и диффузным кальцинозом артерий независимо от традиционных факторов риска [87]. В исследовании ARMORR установлено, что высокий сывороточный уровень FGF-23 у больных ХБП является предиктором смерти в течение 1-го года диализной терапии независимо от сывороточного уровня фосфора и ПТГ [131].
Эти данные подтверждают, что изменение соотношения FGF-23/s-Klotho/склеростин является ранним биомаркером степени хронического почечного повреждения при ХБП и развивающихся ее сердечно-сосудистых осложнений.