Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о состоянии цитокинового статуса и ферментов соединительнотканного матрикса при ревматоидном артрите в сочетании с гиперлипидемией (обзор литературы) 122
1.1 Факторы кардиоваскулярного риска при ревматоидном артрите: фокус на липидный профиль 122
1.2 Вклад цитокинов в развитие системного воспаления и атерогенез у больных ревматоидным артритом 20
1.3 Роль системы протеолиза в патогенезе сердечно-сосудистых осложнений у больных ревматоидным артритом 344
1.4 Современное состояние проблемы применения статинов у больных ревматоидным артритом 411
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 50
2.1 Клиническая характеристика больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией 50
2.2 Методы исследования Ошибка! Закладка не определена.
2.2.1 Методы оценки активности ревматоидного артрита 577
2.2.2 Методы определения показателей липидного обмена 60
2.2.3 Методы исследования цитокинового статуса 60
2.2.4 Методы изучения матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов 611
2.2.5 Инструментальные методы исследования 622
2.5 Статистический анализ результатов исследования 622
ГЛАВА 3. Результаты исследования 644
3.1 Изучение липидного обмена у больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией 655
3.2 Определение активности иммунного воспаления и цитокинового профиля у больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией 688
3.3 Исследование ферментов соединительно-тканного матриксау больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией 733
3.4 Влияние аторвастатина на активность системного воспаления, липидный профиль, цитокиновый статус и систему протеолиза у больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией 766
3.5 Корреляционный анализ показателей активности иммунного воспаления, липидного спектра, цитокинового профиля и системы протеолиза у больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией 833
Обсуждение результатов исследования 90
Выводы 1033
Практические рекомендации определена.5
Список литературы
- Вклад цитокинов в развитие системного воспаления и атерогенез у больных ревматоидным артритом
- Современное состояние проблемы применения статинов у больных ревматоидным артритом
- Методы исследования цитокинового статуса
- Влияние аторвастатина на активность системного воспаления, липидный профиль, цитокиновый статус и систему протеолиза у больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией
Введение к работе
Актуальность исследования
Кардиоваскулярная патология выступает в качестве распространенных коморбидных состояний у больных РА и наблюдается примерно у одной трети лиц, страдающих этим заболеванием (Насонов Е.Л., Попкова Т.В., Новикова Д.С., Мясоедова Е.Е. и соавт., 2011). Причиной сердечно-сосудистых осложнений (ССО) у пациентов с РА является раннее возникновение и быстрое прогрессирование атеросклероза сосудов (Никитина Н.М., Ребров А.П., 2011; Toms Т.Е., Kitas G.D., 2011).
В многочисленных исследованиях показано, что при РА развитие атеросклероза и ССО обусловлено как накоплением традиционных факторов риска, так и иммуновоспалительными механизмами, лежащими в основе патогенеза этих заболеваний (Попкова Т.В., Новикова Д.С., Насонов Е.Л., 2011; Sattar N. et al., 2010). Однако роль этих факторов в развитии кардиоваскулярных нарушений у больных с РА изучена недостаточно.
Несмотря на интенсивные исследования проблемы сердечно-сосудистой патологии при РА до сих пор не найдены высокочувствительные и высокоспецифичные маркеры кардиоваскулярного риска. Имеющиеся стандартные методы его определения (SCORE, Фремингемская шкала) не обеспечивают адекватного учета степени риска развития ССО у больных РА (Попкова Т.В. и др., 2009; Мазуров В.И. и др., 2010; Crowson C.S., 2011). В этой ситуации актуален поиск новых предикторов кардиоваскулярного риска при РА.
Известно, что системное воспаление у пациентов с РА способствует развитию дисбаланса цитокиновой сети и металлопротеиназной активации, в частности с увеличением содержания в крови матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) и снижением уровня ее тканевых ингибиторов (ТИМП) (Дубиков А.И., 2008; Турна А.А., 2010; Курак Т.А. и др., 2011). Однако клинико-диагностическая значимость ММП и ТИМП у больных РА с сердечно-сосудистой патологией и без неё остается до настоящего времени не достаточно изученной.
В последнее время для замедления прогрессирования атеросклеротического поражения сосудов и снижения риска кардиоваскулярных катастроф при РА
предложено использовать статины. Сегодня активно изучаются плейотропные эффекты статинов, что позволяет обсуждать перспективы их применения в лечении РА (Никитина Н.М., Ребров А.П., 2010; Насонов Е.Л., Новикова Д.С., Попкова Т.В., 2011; Toms Т.Е. et al, 2010).
Известны исследования по применению аторвастатина у больных РА: классическое исследование TARA - Trial of Atorvastatin in Rheumatoid Arthritis (McCarey D.W. et al, 2004; Charles-Schoeman С et al, 2007), TRACE RA - TRial of Atorvastatin for the Primary Prevention of Cardiovascular Events in Rheumatoid Arthritis, начатое в 2011г. (Тутунов В. С. и др., 2011; OzbalkanZ. et al., 2011).
Цель исследования
Определить клинико-диагностическое значение показателей активности РА, цитокинового профиля, концентрации ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 у больных РА с гиперлипидемией и оценить эффективность аторвастатина у данной категории больных.
Задачи исследования
1. Изучить особенности липидного обмена у больных РА с
гиперлипидемией.
2. Оценить активность иммунного воспаления (СОЭ, СРБ, DAS 28) у
больных РА с гиперлипидемией.
3. Исследовать цитокиновый профиль (ФНО-а, ИЛ-ір, ИЛ-10) в сыворотке
крови у больных РА с гиперлипидемией.
4. Определить концентрации ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 в
сыворотке крови у больных РА с гиперлипидемией.
5. Установить взаимосвязь между липидным обменом, степенью активности
иммунного воспаления, цитокинами, ММП-9 и комплексом ММП-9/ТИМП-2 у
больных РА с гиперлипидемией.
6. Выявить динамику вышеуказанных показателей после применения
аторвастатина у обследуемых больных.
Научная новизна
Впервые по результатам проведенной комплексной оценки липидного обмена, маркеров активности иммунного воспаления, цитокинового профиля и ферментов соединительно-тканного матрикса, в частности, ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 в сыворотке крови у больных РА с гиперлипидемией определены их особенности при разной степени гиперлипидемии.
Впервые выявлены патогенетически значимые взаимосвязи между показателями липидного обмена, активности иммунного воспаления, цитокинового статуса и системы протеолиза у больных РА с гиперлипидемией.
Впервые установлена диагностическая значимость активности ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 при различной степени гиперлипидемии.
Впервые ММП-9 и комплекс ММП-9/ТИМП-2 обозначены как маркеры кардиоваскулярного риска при РА в сочетании с гиперлипидемией.
Впервые исследовано одновременное влияние аторвастатитна на липидный обмен, маркеры активности иммунного воспаления, цитокиновый профиль и ферменты соединительно-тканного матрикса, в частности, ММП-9 и комплекс ММП-9/ТИМП-2 в сыворотке крови у больных РА с гиперлипидемией.
Практическая значимость
Определение уровней ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 у больных РА с гиперлипидемией рекомендовано как маркеров повышенного риска сердечнососудистых осложнений в реальной клинической практике ревматологов, кардиологов, терапевтов, врачей общей практики.
Дано обоснование применения аторвастатина у больных РА с
гиперлипидемией, имеющих повышенный риск сердечно-сосудистых
осложнений, с целью снижения активности иммунного воспаления и коррекции атерогенных изменений липидного профиля у данной категории пациентов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. У больных РА с гиперлипидемией выявляются атерогенные изменения липидного обмена на фоне низкой и умеренной активности РА.
2. Показатели цитокинового статуса, металлопротеиназной активности прямо
коррелируют со степенью повышения атерогенных фракций липидов крови у
пациентов с РА.
3. Увеличение концентраций ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 у
больных РА с гиперлипидемией является маркером кардиоваскулярного риска,
что позволяет выделить группу пациентов с возможностью раннего развития
сердечно-сосудистых осложнений.
4. Использование аторвастатина в комплексном лечении РА у больных с
повышенным кардиоваскулярным риском целесообразно и позволяет
положительно повлиять на липидный обмен и уменьшить активность РА у
данных пациентов.
Апробация результатов исследования
Материалы и отдельные положения диссертации представлены на XIV, XV Тихоокеанских научно-практических конференциях студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2013, 2014), на Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XVII Всероссийская конференция «Человек и его здоровье») (Санкт-Петербург, 2014), на I Съезде ревматологов Центрально-Черноземного региона (Курск, 2014), II Евразийском конгрессе ревматологов (Москва, 2014), на заседании Приморского краевого терапевтического общества (Владивосток, 2013), на заседании Приморского общества ревматологов (Владивосток, 2013).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 17 работ, при этом 3 - в журналах, из которых 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 - в иностранной печати. Личный вклад соискателя
Автором работы на основе анализа литературных источников были обозначены цель и задачи исследования, выбраны оптимальные методы исследования, разработаны протоколы исследования и анкеты пациентов,
б
выполнены курация больных на протяжении всего исследования, сбор, хранение, постановка иммунологических реакций, интерпретация результатов. Автором самостоятельно проведен статистический анализ материала. Полученные результаты были систематизированы, подвергнуты анализу и сопоставимы с имеющимися литературными данными. Доля участия автора в сборе материала -90%, в анализе и систематизации полученных данных - 95%.
Объем и структура диссертации
Вклад цитокинов в развитие системного воспаления и атерогенез у больных ревматоидным артритом
Описывается несколько взаимосвязанных причин, приводящих к увеличению риска кардиоваскулярных катастроф. К ним относят накопление традиционных факторов кардиоваскулярного риска, хроническое иммунное воспаление, побочные эффекты лекарственной терапии, использующейся для лечения РА, недостаточное внимание к необходимости профилактики ССО при данном заболевании [34, 158, 159].
До настоящего времени не определены факторы риска, наиболее значимые для развития ССО при РА. С одной стороны, существуют работы, подтверждающие важность традиционных факторов риска - возраста, артериальной гипертензии, атерогенной дислипидемии, сахарного диабета, курения, индекса массы тела, гипергомоцистеинемии [29, 85], большую частоту встречаемости отдельных факторов при РА по сравнению с другими ревматическими заболеваниями [29, 96]. С другой стороны, существует мнение, что повышение кардиоваскулярного риска у больных РА не связано с традиционными факторами риска [97].
Существует также мнение, что до начала заболевания происходит накопление традиционных факторов риска, а затем системное ревматоидное воспаление способствует развитию клинических проявлений атеросклероза [32,111,134].
Для понимания роли системного воспаления в развитии сердечнососудистых катастроф у больных РА принципиальное значение имеет концепция о сходстве патогенетических механизмов аутоиммунного воспаления и атеросклероза. Субклиническое (lowgrade) и выраженное (highgrade) воспаление в сосудистой стенке, свойственное хроническим воспалительным заболеваниям, создают предпосылки для раннего развития атеросклеротического поражения сосудов и обусловленных им ССО [96, 142, 161].
Показано, что важную роль в развитии ССО при РА играет тяжесть заболевания, характеризующаяся высоким суставным счетом, наличием внесуставных проявлений, выраженностью функциональной недостаточности суставов, позитивностью по ревматоидному фактору (РФ) и антителам к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) и высоким уровнем маркеров воспаления: СОЭ, СРБ, ИЛ-6 [37, 63, 66]. Хорошо известно, что хроническое воспаление играет важную роль в развитии нарушений, связанных с системой транспорта ОХС [10, 46, 64]. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют об увеличении частоты дислипидемии у больных ревматическими заболеваниями (до 84%) по сравнению с лицами, не имеющими таковых [100, 164]. Однако у пациентов с РА за несколько лет до клинической манифестации заболевания наблюдается повышение уровня ОХС, ТГ и снижение концентрации ХС ЛПВЩ151, 145].
Не сложилось единого мнения исследователей в отношении изменений липидных показателей крови у больных РА в зависимости от особенностей клинического течения заболевания. В ряде работ показано, что с ростом активности заболевания уровень атерогенных показателей возрастает [134, 174]. В других работах описаны обратные изменения: снижение уровня ОХС и ХС ЛПВП на фоне повышения активности заболевания [151, 165]. При активном РА нарушения липидного спектра крови характеризуются снижением концентрации «атерогенных» липидов: ОХС, ТГ, липопротеида (а) и, в большей степени, «антиатерогенных» липопротеидов (ХС ЛПВП), что приводит к увеличению коэффициента атерогенности (КА) [85, 88]. Так, в работах Е.Е. Мясоедовой и соавт., показано, что более низкие уровни ОХС и ХС ЛПНП сопряжены с высоким риском кардиоваскулярных событий («липидный парадокс») [121]. Полагают, что повышение уровня ТГ, снижение концентрации ХС ЛПВП и увеличение выработки свободных жирных кислот на фоне высокой активности аутоиммунного процесса связано со способностью «провоспалительных» цитокинов и острофазовых белков подавлять активность липопротеинлипазы [10, 52]. В результате сложных механизмов обмена липидов крови высокий уровень ТГ приводит к снижению концентрации ХС ЛПВП и повышению синтеза проатерогенных маленьких плотных частиц ХС ЛПНП [64]. Важное значение в этом процессе играют частицы ЛПВП и апоАІ. АпоАІ ингибирует взаимодействие Т-лимфоцитов с моноцитами, а также подавляет продукцию ИЛ-1 и ФНО-а [168]. При воспалении частицы ХС ЛПВП приобретают провоспалительные свойства. При РА такие провоспалительные частицы ХС ЛПВП встречаются в 5 раз чаще (20%), чем в контрольной группе (4%) [10].
Важную роль в развитии нарушений липидного спектра крови придают СРБ, клиническое значение которого подробно рассмотрено в опубликованных обзорах [69, 119]. Некоторые авторы отметили ассоциацию между СРБ и сниженными уровнями ХС ЛПВП, апоАІ [174], повышенным уровнем окисленного ХС ЛПНП [67]. По некоторым данным, у больных РА повышение концентрации СРБ и скорости оседания эритроцитов (СОЭ) сопровождалось снижением уровней «антиатерогенного» ХС ЛПВП и его белкового компонента апоА1 [29, 106].
Однако роль воспаления как фактора атерогенеза не ограничивается его участием в проатерогенных нарушениях обмена липидов и липопротеинов крови. В настоящее время атеросклероз трактуется как хронический воспалительный процесс, сочетающий как неспецифический системный компонент, так и специфический - локальный, протекающий непосредственно в стенке сосуда [47, 54]. Отличительной чертой локального воспаления является рекрутирование Т-лимфоцитов, а затем и моноцитов в зону повреждения, где они трансформируются в макрофаги под действием хемотаксических факторов, цитокинов, факторов роста и модифицированных липопротеинов, а затем превращаются в пенистые клетки [13, 151]. При деструкции лизосом и последующего аутолиза наступает их гибель и в сосудистой стенке возникает очаг асептического воспаления.
Современное состояние проблемы применения статинов у больных ревматоидным артритом
В исследование включено 96 женщин с диагнозом серопозитивный РА в возрасте от 45 до 59 лет, которым проводилось стационарное и амбулаторное обследование и лечение на базе Приморского краевого ревматологического центра ГЖКБ № 1. Диагноз РА верифицирован на основании критериев ACR (American College of Rheumatology, 1987) [156] и EULAR (European League Against Rheumatism, 2010) [60]. Исследование было одобрено Независимым междисциплинарным этическим комитетом Тихоокеанского (ранее -Владивостокского) государственного медицинского университета.
Для постановки диагноза и определения критериев включения, исключения всем больным проводилось тщательное клинико-лабораторное обследование по стандартам, рекомендованным Ассоциацией ревматологов России [36]. Объем исследований для каждой группы не различался. Пациенты давали письменное согласие на участие в исследовании. Всем больным были заполнены анкеты, включающие в себя оценку жалоб, анамнез, данные объективного статуса, подсчет индекса DAS 28, результаты лабораторных исследований: биохимических (функциональные пробы печени, креатинин, мочевина, мочевая кислота, уровень глюкозы в крови, коагулограмма и липидограмма), СРБ, РФ, АЦЦП; инструментальных (ЭКГ, ЭхоКГ, рентгенография органов грудной клетки, рентгенография кистей и стоп в прямой проекции, других суставов - в зависимости от локализации суставного синдрома) [12, 27, 58].
Отбор пациентов в исследование проводился в соответствии с критериями включения: достоверный диагноз серопозитивного РА, в возрасте от 45 до 59 лет, с гиперхолестеринемией (Па и ПЬ типы по Фредриксону), без клинических проявлений сердечно-сосудистой патологии. Все больные были активно обследованы на наличие факторов кардиоваскулярного риска: курения, гиперхолестеринемии (ОХС 5 ммоль/л), ожирения (индекс массы тела 30 кг/м , объем талии 88 см у женщин), отягощенной наследственности по сердечно-сосудистым заболеваниям, артериальной гипертензиии. Стратификация кардиоваскулярного риска проводилась по традиционной шкале SCORE для стран высокого риска, а также по шкале SCORE с использованием поправки (множитель 1,5), предложенной комитетом EULAR (риск SCORE/EULAR) (Peters М. J. et al, 2010), при наличии 2 из 3 прогностически неблагоприятных характеристик: продолжительность РА 10 лет, серопозитивный РА по РФ и/или АЦЦП, наличие внесуставных проявлений РА.
Критериями исключения больных явились наличие: сердечнососудистой патологии, в том числе обнаружение при инструментальном обследовании (на рентгенограмме органов грудной клетки, по данным ЭКГ, ЭхоКГ) субклинических поражений сердечно-сосудистой системы; артериальной гипертензии (при АД выше 140 и 90 мм. рт. ст.); заболеваний печени; сахарного диабета, хронических заболеваний почек (со скорость клубочковой фильтрации более 60 мл/мин/1,73 м ); противопоказаний для назначения базисной и гиполипидемической терапии; в анамнезе за 5 последних лет любых злокачественных новообразований; алкогольной и наркотической зависимости; беременности и лактации.
В контрольную группу включено 26 практически здоровых женщин в возрасте от 45 до 59 лет, не имевших гиперхолестеринемии (с концентрацией ОХС плазмы менее 5,0 ммоль/л) и других факторов кардиоваскулярного риска, отягощенного семейного анамнеза или клинических проявлений сердечно-сосудистой патологии, заболеваний опорно-двигательного аппарата, сопоставимых с основной группой по возрасту, полу, этнической принадлежности.
В исследовании участвовали женщины, так как они страдают РА чаще мужчин - в 7-8 раз и мужчины к возрасту 45-59 лет имели уже какую-либо кардиологическую патологию. Все пациентки были серопозитивны по РФ и/или АТТПТТ
Длительность заболевания у обследованных пациентов варьировалась от 4 месяцев до 18 лет. Преобладали пациентки с ранним (41%) и поздним (37%) РА. Регистрировалась низкая и умеренная степень активности РА. Часть пациенток - 11% - имели внесу ставные проявления РА: субфебрилитет, анемию, лимфаденопатию, синдром Шёгрена, ревматоидные узелки, полинейропатию.
Существует прямая взаимосвязь между длительностью, серопозитивностью заболевания и рентгенологической картиной (наличием и количеством эрозий), функциональным классом заболевания. Положительный результат на определение АЦЦП - прогностически неблагоприятный фактор течения РА [36, 63].
В рамках оценки кардиоваскулярного риска у лиц, включенных в исследование, важно проанализировать традиционные факторы: пол, возраст, индекс массы тела, курение, наличие артериальной гипертензии, сахарного диабета, хронического заболевания почек со снижением клубочковой фильтрации, гиперлипидемии, отягощенной наследственности по сердечнососудистым заболеваниям. Распределение контингента пациентов по половой и возрастной принадлежности приведено выше. Индекс массы тела варьировался от 21 до 30 кг/м , т. е. дефицита массы тела и ожирения зарегистрировано не было. В исследование были включены пациентки, не страдающие табакозависимотью, не имеющие артериальной гипертензии, сахарного диабета, хронического заболевания почек со снижением клубочковой фильтрации, отягощенной наследственности по сердечнососудистым заболеваниям. По показателю ОХС пациентки были условно разделены на две группы по 48 человек: 1) больные РА с легкой гиперхолестеринемией - с уровнем ОХС 5,0-6,2 ммоль/л; 2) больные РА с умеренной гиперхолестеринемией - с уровнем ОХС 6,3-8,0 ммоль/л.
Таким образом, по оценке традиционных факторов риск фатального сердечно-сосудистого события в течение ближайших 10 лет по шкале SCORE у исследуемых больных не превышал 1-2%, т. е. пациентки были отнесены к низкому и умеренному риску. Однако анализ литературных источников показал, что оценка кардиоваскулярного риска на основе Европейской шкалы SCORE и ещё в меньшей степени Фремингемской шкалы (США) не учитывает фактор системного иммунного воспаления и не обеспечивает адекватного учета степени вероятности развития ССО у больных РА [56]. В этой ситуации поиск дополнительных маркеров для уточнения сердечнососудистого риска при РА как никогда актуален.
Методы исследования цитокинового статуса
Активность ревматоидного артрита оценивалась по показателям DAS 28, уровням СОЭ, СРБ. Количественная оценка степени активности РА проводилась с использованием индекса DAS 28 (Disease Activity Score), рекомендованного EULAR и ассоциацией ревматологов России [36, 95]. Компоненты индекса DAS 28 включают: счет болезненных суставов из 28 возможных, счет припухших суставов из 28 возможных (табл. 6), скорость оседания эритроцитов (СОЭ), общую оценку состояния здоровья по визуальной аналоговой шкале (ВАШ): DAS 28 = 0,56 х sqrt(4BC28) + 0,28 х (ЧПС28) + 0,70 х 1п(СОЭ) + 0,014 х ОСЗ, где ЧПС - число припухших суставов; ЧБС - число болезненных суставов; СОЭ - скорость оседания эритроцитов (мм/час); In - наруральный логарифм; ОСЗ - общее состояние здоровья или общая оценка активности заболевания по мнению пациента (100 мм ВАШ). Активность заболевания по критериям Американской ревматологической ассоциации и ассоциации ревматологов России расценивается следующим образом [36]:
Выраженности болей в суставах и ОСЗП оценивались с помощью визуально-аналоговой шкалы (ВАШ). ВАШ представляла собой линию длиной 100 мм, на которой пациент маркером отмечал выраженность болевого синдрома в суставах и степень влияния заболевания на общее состояние здоровья. Крайняя левая точка на этой линии считалась нулевой отметкой и обозначала отсутствие боли или ощутимого негативного воздействия болезни на пациента, крайняя правая точка соответствовала максимально возможной боли или максимально возможному отрицательному воздействию РА на общее состояние здоровья. С помощью линейки оценивалось полученное расстояние в миллиметрах (рис. 4) [36].
Эффективность лечения оценивали по динамике индекса DAS 28: хороший эффект соответствовал снижению DAS 28 более чем на 1,2 балла при итоговом значении, не превышающем 3,2 балла; при снижении DAS 28 на 0,6-1,2 балла и итоговом значении от 3,2 до 5,1 балла эффект расценивается как удовлетворительный. При сохраняющейся высокой активности болезни (DAS 28 5,1) пациент считался не ответившим на лечение независимо от степени снижения DAS 28. Критерием ремиссии являлся показатель DAS 28 2,6 балла [36].
Определение СОЭ проводили по методу Панченкова. В этом методе используется стандартный стеклянный капилляр длиной 172 мм, наружным диаметром 5 мм и диаметром отверстия - 1,0 мм. Он имеет четкую коричневую градуировку от 0 до 10 см, шаг шкалы - 1,0 мм, верхнее деление шкалы отмечено «0» и буквой «К» (кровь), напротив деления 50 имеется буква «Р» (реактив). Показатель выражается в мм/час.
Иммунологическое исследование включало определение концентрации С-реактивного белка (СРБ), ревматоидного фактора (РФ) и антител к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП). Исследование СРБ в сыворотке крови больных проводилось количественно с использованием латекс-метода (верхняя граница нормы составляет 6 мг/л). Определение РФ осуществлялось также латекс-методом (верхняя граница нормы - 12 МЕ/л). При исследовании концентрации АЦЦП использовался иммуно ферментный метод с использованием коммерческого набора фирмы «Axis-Shield Diagnostic Limited» (Великобритания) согласно инструкции фирмы-производителя (верхняя граница нормы 5 мг/л).
Концентрации ФНО-а и ИЛ-ір, ИЛ-10 в сыворотке крови обследуемых больных и в группе контроля определяли высокочувствительными иммуноферментными методами с помощью тест-системы фирмы «R&D Systems» (USA) согласно прилагаемой инструкции в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Количество ФНО-а и ИЛ-ір, ИЛ-10 рассчитывали путем построения калибровочной кривой с использованием компьютерной программы и выражали в пикограммах/мл (пкг/мл).
Концентрации ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 в сыворотке крови обследуемых больных определяли высокочувствительными иммуноферментными методами с помощью тест-системы фирмы «R&D Systems» (USA) согласно прилагаемой инструкции в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Количество ММП-9 и комплекса ММП-9/ТИМП-2 рассчитывали путем построения калибровочной кривой с использованием компьютерной программы и выражали в нанограммах/мл (нг/мл).
Материалом для исследования являлась сыворотка крови, взятая утром из локтевой вены после 12-часового голодания.
Принцип ИФА основан на количественном определении изучаемого антигена при его послойном связывании со специфическими моноклональными антителами, фиксированными на поверхности лунок планшетки. После удаления не связавшихся протеинов отмыванием в лунки добавляют поликлональные антитела, связанные с энзимом, которые наслаиваются на иммобилизованный в ходе первой инкубации антиген по типу —сэндвича. После этого излишек антител отмывается и в лунки добавляется раствор хромогенного субстрата, который, прореагировав с энзимом, дает характерное окрашивание, по интенсивности которого оценивается содержание в пробе исследуемого антигена. Анализ оптической плотности производился с использованием системы «Multiscan» Labsystems (Финляндия) при определенной длине волны. 2.2.5 Инструментальные методы исследования
Инструментальное исследование пациентов включало проведение рентгенографии кистей и стоп в прямой проекции, при диагностической необходимости - других суставов, рентгенографию органов грудной клетки, использование методов ЭКГ, ЭхоКГ. Рентгенография Рентгенологическая стадия определялась по классификации Штейнброккера путем рентгенографии кистей и стоп в прямой проекции. При диагностической необходимости проводилась рентгенография суставов других локализаций. Всем пациентам проводилась рентгенография органов грудной клетки. Электрокардиография ЭКГ исследования выполнялись на электрокардиографе «ИНТЕКАРД-3» (Республика Беларусь). Диапазон измеряемых значений напряжения -0,03-5 мВ, времени - 0,01-2 сек., допустимая погрешность ±5%. Ультразвуковое исследование сердца (ЭхоКГ) УЗИ сердца проводилось на аппарате «Vivid-7», General Electrics (США) с применением ультразвукового датчика 3,5 МГц по стандартной методике [53]. Исследование выполнялось в М-, В-модальном и цветном доплеровском режимах, допустимая погрешность измерений 2%, 5%, 4-10% соответственно.
Влияние аторвастатина на активность системного воспаления, липидный профиль, цитокиновый статус и систему протеолиза у больных ревматоидным артритом с гиперлипидемией
В пользу воспалительной природы атеросклеротического процесса говорят исследования, проведенные в общей популяции, где показано, что повышенный уровень высокочувствительного СРБ, не превышающий, однако, порог нормальных значений при рутинных исследованиях, является предиктором развития ИБС [32, 119], что согласуется с нашими данными. Ассоциация таких «нормально повышенных» уровней СРБ с высоким кардиоваскулярным риском свидетельствует о том, что даже низкие уровни воспаления достаточны для потенцирования развития атеросклероза [29].
Некоторые исследователи отмечают, что даже больные РА, находящиеся в стадии ремиссии или имеющие минимальную воспалительную активность по индексу DAS 28, в 66% случаев могут иметь высокий СРБ [37, 95], что предполагает наличие у них высокого кардиоваскулярного риска, несмотря на достижение оптимальных уровней DAS 28. Следует отметить, что среди показателей воспаления на настоящий момент нет принятого критерия с доказанной прогностической значимостью и установленными количественными характеристиками, который бы являлся эталоном таргетного контроля кардиоваскулярного риска при РА. Доказано, что СРБ является фактором, ассоциированным с неблагоприятным кардиоваскулярным прогнозом при РА [31, 119]. При этом прогностическая значимость снижения уровня СРБ в отношение сердечно-сосудистых заболеваний при РА пока не ясна.
В наше исследование были включены больные с низкой и умеренной степенью активности РА. Увеличение СОЭ, СРБ и индекса DAS 28 рассматривается как независимые факторы риска развития ССО у пациентов с РА [2, 140, 157].
В ходе нашего исследования показатель СОЭ в группе с легкой гиперхолестеринемией был достоверно выше, чем у больных РА с умеренной гиперхолестеринемией и у практически здоровых добровольцев (соответственно, 19,56±4,27 мм/ч, 15,93±3,52 мм/ч и 6,18±0,57 мм/ч, р 0,05, р 0,001).
У пациентов с РА и легкой гиперхолестеринемией выявлено достоверное повышение СРБ по сравнению с группой больных РА с умеренной гиперхолестеринемией и контролем (соответственно, 24,11±5,89 мг/л, 14,79±4,73 мг/л и 4,12±0,18 мг/л, р 0,05; р 0,001).
Индекс DAS 28 в группе больных РА с легкой гиперхолестеринемией был выше, чем в группе с умеренной гиперхолестеринемией и составил 3,58±0,62 и 3,18±0,34 соответственно.
Таким образом, уровень повышения ОХС обратно пропорционален степени активности иммунного воспаления у больных РА.
При хронической активации иммунного ответа наблюдается гиперпродукция «провоспалительных» (ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-ір, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-17) и относительная недостаточность синтеза «противовоспалительных» (ИЛ-4, ИЛ-10, антагонист рецептора ИЛ-1, трансформирующий фактор риска Р) цитокинов. Возникновение дисбаланса цитокиновой сети способствует развитию сосудистых нарушений, составляя основу атеротромбоза: дисфункции эндотелия, вазоконстрикции, перекисного окисления липидов и липопротеидов, гиперкоагуляции, в дальнейшем - формированию и «дестабилизации» атеросклеротической бляшки и развитию ССО [38, 84, 125].
У всех больных, включенных в наше исследование, обнаружено повышенное содержание «провоспалительных» цитокинов -ИЛ-ір, ФНО-а в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой (р 0,001). Наибольшего уровня повышения среди всех исследуемых цитокинов достигал ФНО-а в группе больных РА с умеренной гиперхолестеринемией. Значение ФНО-а в данной группе больных было достоверно выше, чем при легкой гиперхолестеринемии и в группе контроля (соответственно, 15,26±2,54 пкг/мл, 13,04±2,21 пкг/мл и 2,49±0,31 пкг/мл, р 0,05). Согласно ABC study взрастание риска ишемической болезни сердца было связано с достоверным увеличением ФНО-а [82].
Полученные данные демонстрируют достоверное повышение уровня ИЛ-ір у больных РА с легкой и умеренной гиперхолестеринемией в сравнении с контрольной группой (соответственно, 9,61±1,13 пкг/мл, 12,47±1,38 пкг/мл и 0,39±0,08 пкг/мл, р 0,05). У всех пациентов, включенных в исследование, экспрессия «провоспалительных» цитокинов возрастала в ряду «легкая-умеренная гиперхолестеринемия» и четко ассоциировалась со степенью повышения уровня ОХС.
Также зарегистрировано достоверное повышение уровня ИЛ-10 при легкой и умеренной гиперхолестеринеми (соответственно, 10,62±1,73 пкг/мл и 11,87±1,91 пкг/мл, р 0,05) по сравнению с практически здоровыми добровольцами (2,41±0,52 пкг/мл).
Наряду с этим, как у больных ранним, так и длительно текущим РА наблюдалась активация звена провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Это проявлялось достоверным повышением содержания ИЛ-ір, ФНО-а, ИЛ-10 в сыворотке крови у всех пациентов в сравнении с группой контроля. Данные однонаправленные сдвиги в системе про- и противовоспалительных цитокинов у пациентов РА можно рассматривать как проявление эндогенных гомеостатических механизмов, направленных на ограничение интенсивности иммуновоспалительного процесса [22].
Цитокиновый дисбаланс является пусковым фактором активации ММП, основное значение среди которых имеет ММП-9, которая в свою очередь может обуславливать нарушение соотношения про- и противовоспалительных медиаторов, замыкая порочный круг [1, 15, 87]. Доказано, что ММП-9 продуцируется не только синовиальными фибробластами и макрофагами, но и макрофагами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками атеросклеротической бляшки [7, 86]. Для пациентов с РА характерны повышенные уровни ММП-9 в синовиальной жидкости и крови, что коррелирует с прогрессированием заболевания и уровнем некоторых маркеров активности заболевания [79, 122, 124].
Рядом исследователей воспаление в области атеросклеротической бляшки, сопровождающееся активацией локального и системного иммунного ответов, продукцией молекул адгезии, провоспалительных цитокинов, ММП, рассматривается как причинный фактор их нестабильности [7, ПО]. При гистологическом исследовании коронарных артерий пациентов с ИБС было установлено более выраженное воспаление и большее количество нестабильных бляшек у больных РА по сравнению с группой контроля [15].
В исследовании «AtheroGene» показано, что при повышении уровня ММП-9 риск ускоренного кардиоваскулярного риска возрастает в 3 раза. У больных РА заявленный риск еще больше увеличивается в связи с влиянием хронического аутоиммунного воспаления на стенки сосудов [137, 139, 147], что повышает значимость определения ММП-9 и комплекса ММР-9/ТИМР-2 как маркеров риска развития ССО у данной категории пациентов.
В ходе нашего исследования получены статистически значимые различия концентраций ММП-9 в сыворотке крови у больных РА с легкой и умеренной гиперхолестеринемией по сравнению с группой контроля (соответственно, 299,21±15,34 нг/мл, 337,14±10,68 нг/мл и 255,83±11,38 нг/мл, р 0,001, р 0,05). Экспрессия ММП-9 достоверно возрастала в ряду «легкая-умеренная гиперхолестеринемия» и зависела от степени повышения уровня ОХС.