Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Эндотоксин и липополисахаридсвязывающий белок при неалкогольной жировой болезни печени (обзор литературы)
1.1. Эпидемиология неалкогольной жировой болезни печени 14
1.2. Современные представления о патогенезе неалкогольной жировой болезни печени
1.2.1. Роль свободных жирных кислот в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени
1.2.2. Роль инсулинорезистентности в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени
1.2.3. Роль оксидативного стресса в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени
1.2.4. Эндотоксин и микрофлора кишечника в патогенезе и механизмах прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени
1.2.5. Липополисахарид-связывающий белок и механизмы развития и прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени
1.2.6. Роль фактора некроза опухоли- в развитии неалкогольного стеатогепатита
1.3. Принципы терапии терапии больных неалкогольной жировой 33
болезнью печени
1.3.1. Роль модификации образа жизни 33
1.3.2. Возможности коррекции липидного профиля пациентов с неалкогольной жировой болезнm. печени
1.3.3. Применение инсулиновых сенситайзеров в терапии неалкогольной жировой болезни печени
1.3.4. Другие препараты, принадлежащие к разным группам 39
ГЛАВА II. Клиническая характеристика больных 43
ГЛАВА III. Методы исследования 53
3.1. Определение эндотоксина в сыворотке крови 54
3.2. Определение уровня человеческого белка, связывающего липополисахариды в сыворотке крови (липополисахарид-связывающего белка)
3.3. Определение в периферической крови содержания фактора некроза опухоли-
3.4. Морфологическое исследование печени 59
3.5. Статистическая обработка материала 60
ГЛАВА IV. Содержание эндотоксина, липополиса- харид-связывающего белка и фактора некроза опухоли- у больных неалкогольной жировой болезнью печени (собственные данные)
4.1. Содержание эндотоксина в сыворотке крови больных неалкогольной жировой болезнью печени
4.2. Содержание липополисахарид-связывающего белка у больных неалкогольной жировой болезнью печени
4.3. Содержание фактора некроза опухоли- в крови больных неалкогольной жировой болезнью печени
4.4 Изменение уровней в крови эндотоксина, липополисахарид- связывающего белка и ФНО- у больных неалкогольным стеатоге-патитом в динамике терапии пентоксифиллином
ГЛАВА V. Обсуждение результатов исследования 100
Выводы 112
Практические результаты 114
Список литературы
- Роль свободных жирных кислот в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени
- Липополисахарид-связывающий белок и механизмы развития и прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени
- Определение в периферической крови содержания фактора некроза опухоли-
- Содержание липополисахарид-связывающего белка у больных неалкогольной жировой болезнью печени
Введение к работе
Актуальность проблемы. Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) представляет актуальную медико-социальную проблему в связи с широким распространением, возможностью развития серьезных осложнений, значительным экономическим ущербом, нерешенностью вопросов терапии (Ratziu V. Et al., 2015). НАЖБП принято рассматривать как один из компонентов метаболического синдрома. НАЖБП выявляется у 15-30% населения западноевропейских стран, США, а также населения стран Азии (BellentaniS., MarinoM., 2009; Zois C.D.et al., 2010). В России распространенность НАЖБП среди взрослого населения составляет 27% (Драпкина О.М.. Ивашкин В.Т., 2014).
В патогенезе НАЖБП на современном этапе имеет место теория «множественных параллельных ударов», рассматривающая НАЖБП как многофакторное заболевание. Важную роль в механизмах развития болезнииграют ожирение, избыточное образование свободных жирных кислот, инсулинорезистентность, митохондриальная дисфункция, дисбаланс адипоцитокинов, оксидативный стресс, ведущий к усилению процессов ПОЛ и продукции провоспалительных цитокинов, в том числе ФНО- (Day C.P., 1998, 2006;Tilg H., Moschen A.R., 2010). Однако механизмы развития воспаления в печени на фоне жировой дистрофии, ведущие к развитию неалкогольного стеатогепатита, недостаточно ясны и требуют дальнейшего изучения и уточнения.
В качестве одного из патогенетических факторов НАЖБП, рассматривается эндотоксин (или ЛПС) грамотрицательных микроорганизмов. Избыточное поступление ЭТ в кровоток и недостаточностьан-тиэндотоксинового иммунитета приводит кэндотоксиновой агрессии, играющей важную роль в стимуляции воспаления ткани печени, про-грессировании фиброза и развитии инсулинорезистентности (Левитан Б.Н. и др., 2013; Verdam F.J. etal., 2011; Gangarapu V .et al., 2014). Гепатоциты, а также частично энтероциты, образуют антиэндотокси-новую иммунную систему, за счет выработки липополисахарид-связывающего белка (ЛПСБ), образующегося при попадании в организм ЭТ и способного ингибировать воспалительную реакцию, индуцированную ЛПС. Содержание ЛПСБ в крови может отражать не только напряжение антиэндотоксинового иммунитета, но и являться биомаркером метаболических нарушений (Самуилова Д.Ш., Боровко-ва У.Л., 2013; Dentener M.A. et al., 2000; еt al., 2014).
Стандартных схем терапии НАЖБП не существует, априменяемые медикаменты недостаточно эффективны. Поиск новых методов лечения, обоснованных на данных изучения патогенетических механизмов
эволюции НАЖБП, представляется чрезвычайно важной клинической задачей.
Повышенные уровни ЭТ, индуцированные им патологические реакции в печени, а также нарушение параметров антиэндотоксинового иммунитета могут играть важную роль в патогенезе НАЖБП, что определило актуальность проведения комплексного исследования патогенетических взаимосвязей эндотоксинемии, ЛПСБ, ФНО- в развитии и прогрессировании неалкогольного стеатогепатита.
Цель исследования. Определить клинико-диагностическое и прогностическое значение сывороточных уровней эндотоксина и липопо-лисахарид-связывающего белка у больных неалкогольной жировой болезнью печени.
Задачи исследования:
-
Изучить содержание эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка и фактора некроза опухоли- в крови при неалкогольной жировой болезни печени.
-
Установить взаимосвязь уровней липополисахарид-связывающего белка, эндотоксина и фактора некроза опухоли- с основными клинико-лабораторными синдромами патологии печени и компонентами метаболического синдрома у больных неалкогольной жировой болезнью печени.
-
Определить особенности показателей эндотоксинемии и анти-эндотоксинового иммунитета у пациентов в зависимости от наличия стеатоза или неалкогольного стеатогепатита.
-
Выявить взаимосвязь изменения содержания в крови липополи-сахарид-связывающего белка, эндотоксина и фактора некроза опухоли- с выраженностью стеатоза, гистологической активностью и степенью печеночного фиброза и разработать на этой основе модель не-инвазивной диагностики активности и фиброза печени.
-
Оценить эффективность и безопасность терапии пентоксифил-лином больных неалкогольным стеатогепатитом и определить возможность влияния препарата на изучаемые показатели эндотоксине-мии, антиэндотоксиновой защиты и фактора некроза опухоли-.
Научная новизна работы
Впервые комплексно на большом клиническом материале у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени изучены уровни эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка и фактора некроза опухоли-. Доказано повышение эндотоксина и фактора некроза опухоли- с параллельным увеличением концентрации в крови показателя антиэндотоксинового иммунитета – липополисахарид-связывающего белка. Впервые установлено, что наиболее высокие значения эндоток-
сина, липополисахарид-связывающего белка и фактора некроза опухоли- наблюдались у пациентов с 3-й степенью ожирения. Показана прямая зависимость между содержанием в крови больных неалкогольным стеатогепатитом эндотоксина и показателями ферментов цитолиза, инсулина, триглицеридов и значениями НОМА-индекса. Впервые обнаружены прямые корреляционные связи между сывороточными уровнями липополисахарид-связывающего белка и показателями общего холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеинов низкой плотности, инсулина и НОМА-индекса при неалкогольном стеатогепа-тите, а также между значениями липополисахарид-связывающего белка и активностью обеих аминтотрансфераз при неалкогольной жировой болезни печени, более выраженные у больных со стеатогепатитом. Определена прямая зависимость содержания фактора некроза опухоли- в крови при неалкогольном стеатогепатите (но не при стеатозе) от уровней триглицеридов, холестерина липопротеинов низкой плотности, аланиновойаминотрансферазы, инсулина и показателей НОМА-индекса. Доказано наличие положительной связи эндотоксина и липо-полисахарид-связывающего белка, а также эндотоксина и фактора некроза опухоли-. Впервые выявлено, что у больных неалкогольной жировой болезнью печени при умеренном и выраженном стеатозе печени, а также при II и III стадиях фиброза печени сывороточные уровни эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка и фактора некроза опухоли- были выше, чем у пациентов с 1 степенью стеатоза и с со стадией фиброза 0-I. Установлена прямая корреляционная связь изученных показателей воспалительной реакции с индексом гистологической активности. Впервые определены и обоснованы количественные критерии эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка и фактора некроза опухоли- крови, свойственные больным неалкогольной жировой болезнью печени с наличием стеатоза 2-3 степени и умеренного/тяжелого фиброза печени. Впервые продемонстрировано, что под влиянием терапии пентоксифилином, наряду с уменьшением активности аминотрансфераз, происходит снижение сывороточных уровней эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка, а также фактора некроза опухоли-.
Практическая значимость работы
Результаты данного диссертационного исследования имеют важное
значение для практического здравоохранения. Изучение показателей
эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка и фактора нек-
роза опухоли- в комплексе, выявление их взаимосвязи с активностью ферментов цитолиза, значениями липидного профиля и инсули-норезистентностью, расширяют существующие научные знания о ме-5
ханизмах развития неалкогольного стеатогепатита. Установленные в ходе исследования взаимосвязи между измененными при неалкогольном стеатогепатите показателями эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка, фактора некроза опухоли- и активностью ала-ниновойаминотрансферазы и аспарагиновой аминотрансферазы позволяют использовать изученные показатели воспаления как дополнительные критерии активности стеатогепатита. Существование взаимосвязи между уровнями эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка, фактора некроза опухоли- и значениями индекса гистологической активности, выраженностью печеночного стеатоза и фиброза печени дают возможность использования показателей эндотоксинемии и антиэндотоксиновой защиты в качестве неинвазивных маркеров жировой дистрофии, фиброза и активности воспалительного процесса в печени у больных с неалкогольной жировой болезнью. Показанная возможность снижения эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка, фактора некроза опухоли- в динамике терапии пентоксифил-лином обосновывает целесообразность назначения данного препарата пациентам неалкогольным стеатогепатитом
Основные положения, выносимые на защиту:
повышение в крови больных неалкогольным стеатогепатитом уровня эндотоксинемии, сопряженное с ростом показателя антиэндо-токсинового иммунитета – липополисахарид-связывающего белка;
наличие положительной корреляционной связи между уровнем эндоксинемии и показателями липополисахарид-связывающего белка, фактора некроза опухоли-;
зависимость содержания в крови эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка, фактора некроза опухоли- при неалкогольном стеатогепатите от степени ожирения, выраженности инсулинорези-стентности и изменений параметров липидограммы;
ассоциированность повышения активности цитолитических ферментов при неалкогольной жировой болезни печени с ростом уровней эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка, фактора некроза опухоли- в крови;
связь выраженности активности воспаления, стеатоза и фиброза в ткани печени ассоциировано с повышением сывороточных уровней эндотоксина, липополисахарид-связывающего белка, фактора некроза опухоли-;
- возможность снижения активности цитолитических ферментов,
сывороточных уровней эндотоксина, липополисахарид-связывающего
белка, фактора некроза опухоли- при использовании препарата пен-
6
токсифиллин у пациентов с неалкогольным стеатогепатитом, а также безопасность такого лечения.
Практическое использование полученных результатов
Результаты исследования используются в практической работе отделений ГБУЗ СК «Ставропольская краевая клиническая больница» г. Ставрополя, МУЗ «Городская клиническая больница» №2 г. Ставрополя, МУЗ «Городская поликлиника №1» г. Ставрополя. Результаты работы включены в лекционный материал, используются на практических занятиях со студентами, клиническими ординаторами, врачами и аспирантами кафедр госпитальной терапии, поликлинической терапии Ставропольского государственного медицинского университета.
Публикации и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных работ.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XIX Российской Гастроэнтерологической неделе (Москва, 2013), на XIX Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (Москва, 2014), на 195-м Фальк-симпозиуме (Фрайбург, Германия, 2014), на совместном заседании кафедр госпитальной терапии, поликлинической терапии Ставропольского государственного медицинского университета (Ставрополь, 2015).
Объем и структура диссертации
Роль свободных жирных кислот в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени
Истинную распространенность неалкогольной жировой болезни печени оценить сложно, однако в последние 10 лет наблюдается тенденция к росту этой патологии. Это связано как с улучшением диагностики заболевания, так и с истинным ростом – в большинстве случаев НАЖБП является печеночным проявлением метаболического синдрома, приобретающего на сегодняшний день характер эпидемии [10, 26, 40, 153, 164, 168, 175, 236].
В США среди биоптатов печени потенциальных донорских органов в 20% случаев был обнаружен стеатоз. По данным корейских ученых при проведении биопсии печени у 589 возможных доноров у 51% была диагностирована НАЖБП [119,125, 217]. В Греции на основании аутопсий умерших от ишемической болезни сердца или от несчастных случаев при дорож-но-транспортных происшествиях стеатоз был определен в 31%, а стеатогепа-тит в 40% случаев [223]. Столь высокую распространенность заболевания связывают с снижение физической активности и изменением в привычках питания греческого население за последнее десятилетие.
Хотя неинвазивные методы определения НАЖБП менее точны, чем гистологическое исследование биоптата, но на их основе также можно определить общепопуляционную распространенность данной патологии. В многоцентровом исследовании населения Испании после исключения больных с известными заболеваниями печени и чрезмерным потреблением алкоголя распространенность НАЖБП на основе данных УЗИ составила 33% у мужчин и 20% у женщин [189].
Kojima S. и соавт., основываясь на данных сонографии печени, сделали вывод, что за период 10-12 лет, распространенность НАЖБП в когорте 35 519 обследованных японцев увеличилась с 13% до 30%. [109].
В США при ретроспективном анализе электронной медицинской документации больных (The Johns Hopkins Hospital Executive Health Program) были исследованы уровни аминотрансфераз у 2294 пациентов [194].
Повышение одного из ферментов наблюдалось в 14% случаев, а в 21% случаев были повышены оба фермента, при этом у данной когорты лю дей не было в анамнезе злоупотребления алкоголем. По данным других ис следований, проводимых в США, повышение уровня АлАТ наблюдалось колебалось от 8 % до 9% [ 53].
Распространенность НАЖБП в России изучалась в 2007 году в исследование DIREG_L_01903. Анализируемый материал включал данные о 30754 пациентах, обратившихся к терапевтам 228 поликлиник России в период проведения исследования, которым выполнялись общеклинические, антропометрические обследования, а также УЗИ, лабораторные исследования, включавшие биохимические тесты и определение маркеров гепатитов В и С. Группу больных, проживающих в ЮФО, составили 2384 пациентов, карты которых были доступны для анализа. Среди заболеваний печени, как в РФ, так и в ЮФО преобладали признаки стеатоза (77,0% и 77,4% соответственно), тогда как стеатогепатит встречается у 16,6% и 20,3% больных. Признаки цирроза диагностировались в ЮФО в 0,9% , а в целом по России в 2,9% [6].
Распространенность НАЖБ и фиброза связанного с ней увеличивается с возрастом [174, 188, 190, 191, 193]. Frith J., и соавт. изучили когорту из 351 пациента с НАЖБП, подтвержденной данными биопсии [166].
Было показано, что пожилые пациенты имели значительно больше факторов риска НАЖБП, таких как гипертония, ожирение, диабет и гиперли-пидемия. Исследование распространенности НАЖБП в когорте восьмидесятилетних пациентов гериатрической больницы продемонстрировало, что
распространенность НАЖБП составила 46%, что больше, чем у населения в целом [163]. С другой стороны, это исследование не показало связи между жировой болезнью печени и метаболическим синдромом, сердечнососудистыми заболеваниями, или циррозом печени. Имеются данные, что молодой возраст связан с более высокой активностью АлАТ [119, 126, 195, 205], а также с жировой дистрофией печени у лиц с необъяснимым повышением уровня трансаминаз [54].
Во время профилактических медицинских осмотров 26527 азиатов было установлено, что распространенность НАЖБП оказалась равна 31% среди мужчин и 16% – у женщин [192, 204]. Мужской пол также ассоциирован с более частой встречаемостью у пациентов с жировой болезнью печени повышенного уровня аминотрансфераз, наличия гистологических признаков НАСГ, фиброза печени и общей смертностью [78, 100, 174]. Меньше данных, что женский пол ассоциируется с НАЖБП и фиброзом [18, 234], а также было установлено, что женский пол является независимым фактором риска развития НАСГ у пациентов с метаболическим синдромом [219].
Распространенность НАЖБП в различных этнических группах и у различных рас различна. Так, например, выходцы из Латинской Америки имеют самый высокий показатель распространенности жировой болезни, далее следуют неиспаноязычных белые и самый низкий уровнем распространенности у афро-американцев [55, 78].
Исследования больших семейных когорт показывают, что наследуемость стеатоза печени составляет примерно 0,27 [90]. Наиболее важным генетический вклад в NAFLD является I148M аллель гена PNPLA3, который кодирует адипонутрин, у гомозиготных носителей этого аллеля содержание печеночного жира более чем в два раза выше, чем в группе с отсутствием но-сительства [19, 78].
Липополисахарид-связывающий белок и механизмы развития и прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени
Рис. 2.2 Доли больных НАЖБП с разными значениями ИМТ Избыточная масса тела (ИМТ 30 кг/м2) отмечалась у 30 пациентов. Переобладающую часть пациентов составили больные с I степенью ожирения (64 чел. – 40,5%). II степень ожирения (ИМТ от 35 до 39,9 кг/м2) встречалась реже, этот вариант был диагностирован у 41 больного (26%). Реже – с частотой 14,5% – встречались пациенты с ИМТ 40 – III степень ожирения. Проводился анализ других антропометрических параметров, значимых при ожирении,- объем талии, объем бедер, а также отношение ОТ/ОБ.
ОТ был достоверно выше у мужчин, чем у женщин (таблица 2.2), в то время, как показатели ОБ пациентов мужского пола, наоборот, ниже значений у женщин. У мужчин среднее значение соотношения ОТ/ОБ было выше 1, а у женщин ниже 1, что говорит о преобладании у мужчин абдоминаль 46 ного типа ожирения. При этом соотношение ОТ/ОБ у лиц разного пола также достоверно различались.
У 95% (150 чел.) имело место увеличение размеров печени (рис. 2.3). При УЗИ диагностировалось выраженное усиление эхогенности ткани печени («белая печень»), что считается признаком стеатоза. Спленомегалия имела место у 11 пациентов (7%).
Встречаемость гепатомегалии и спленомегалии у больных неалкогольной жировой болезнью печени Таблица 2.3 Показатели биохимических параметров у больных с неалкогольной жировой болезнью печени (X±s-)
Из данных таблицы 2.3 мы видим, что среднеее значение АлАТ пре вышает нормальные показатели. Среднее значение АсАТ соответствовало норме. У 89 пациентов (56,3%) активность АлАТ была нормальной, таким образом, у этих больных был выставлен стеатоз печени. У прочих 69 (43,7%) пациентов можно было верифицировать неалкогольный стеатогепа-тит. Здесь надо обязательно отметить, что дифференциальный диагноз между стеатозом и стеатогепатитом проводился и на основании биохимических параметров, и на основании данных гистологической картины (у 25 чел.). Рас 48 пределение больных по степени повышения активности АлАТ представлены на рис. 2.4. Основная часть пациентов была представлена повышением АлАТ до 1,5 норм – 118 чел. В эту группу входили пациенты со стеатозом печени с нормальным уровнем аминотрансфераз и больные НАСГ с минимальным повышением активности АлАТ. Цитолитическая активность от 1,5 до 3 норм отмечалась у 32 больных, и только у 8 пациентов пациентов была активность аминотрансфераз превышал 3 нормы.
Распределение больных неалкогольной жировой болезнью печени по выраженности синдрома цитолиза (активности аланиновой ами-нотрансферазы) Средние значения ГГТ также были выше нормы, а у 6 пациентов активность фермента была повышена более, чем в 3 раза. У обследованных больных средние значения билирубина не были выше нормы. Однако у 13 пациентов отмечалась гипербилирубинемия, не привышающая 1,5 норм. Активность ЩФ не была повышена ни у одного человека, и как следствие, средние величины у всех обследованных пациентов оказались нормальными.
Нарушение белковосинтетической функции печени, признаками которой являлись снижение сывороточного уровня общего белка и альбумина, определялось только у 3 пациентов с признаками формирующегося цирроза печени. Но при этом у этих больных не определяли признаки декомпенсации - появление отечно-асцитического синдрома.
У обследованных нами пациентов с НАЖБП выявлена дислипиде-мия в виде повышения уровня общего Хс, триглицеридов, а также относительно низкий уровень ХСЛПВП – данные таблицы 2.4.
Среднее значение С- реактивного белка не превышало уровень нормы, однако у 11 человек активность была более 2 норм.
Мы акцентировали свое внимание на изучении состояния углеводного обмена и определении наличия одной из основных составляющих метаболического синдрома и НАЖБП - инсулинорезистентности.
Из данных таблицы 2.4 видно, что у наблюдаемых нами больных средние значения гликемии натощак повышены. Высокие показатели инсулина до приема пищи, так же были характерны для них. Средние значение вычисленного НОМА-индекса, наиболее информативного показателя наличия инсулинорезистентности, превышало норму в среднем в 1,5 раза.
Клиническое проявление нарушения углеводного обмена у обследованных пациентов было различно. Сахарный диабет 2 типа был диагностирован у 19 пациентов. В 22 случаях была диагностирована нарушение толе 50 рантности к глюкозе. Все эти больные были проконсультированы эндокринологом. Из других компонентов метаболического синдрома у наших больных наблюдалась артериальная гипертензия, которую мы регистрировали в 47 случаях (29,7%). 25 пациентам была проведена пункционная биопсия печени. Данные гистологии (доцент кафедры патологической анатомии Касторная И.В.) представлены в таблице 2.5.
Определение в периферической крови содержания фактора некроза опухоли-
Определение ЛПСБ методом ИФА в сыворотке крови проводилось в иммунологической лаборатории ФКУЗ «Ставропольский научно исследовательский противочумный институт» д.м.н Жарниковой И.В. Минимальная концентрация, которая может быть измерена использованной нами тест-системой 4,4 нг/мл, диапозон измеряемых концентраций 4,4-50 нг/мл.
С целью подсчета результата анализа на масштабно-координатной бумаге строили калибровочную кривую. Концентрации ЛПСБ откладывали по оси абсцисс, соответствующие показатели оптической плотности - по оси ординат. Содержание ЛПСБ определяли по пересечению значений оптической плотности образцов и калибровочной кривой. У здоровых людей уровень в крови ЛПСБ оказалось равным 5,83 (5,39; 6,69) g/мл. 3.3. Определение в периферической крови содержания фактора некроза опухоли- В утренние часы натощак, проводили забор крови из локтевой вены. В центрифуге со скоростью 3000 оборотов осуществлялось центрифугирование длительностью 15 минут с плавающим ротором при комнатной температуре. Замораживание и хранение осуществлялось при температуре ниже
Концентрацию ФНО- в плазме крови изучали методом ИФА с помощью стандартных тест наборов тест-систем для ИФА («Протеиновый контур», Россия).
В наборе «ИФАNF-alpha» использован «сэндвич-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ФНО-. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа ФНО-, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный ФНО- взаимодействует со вторыми антителами, меченными биотином. Количество связавшегося конь-югата прямо пропорциональна ФНО- в исследуемом образце. На последней стадии в лунки вносится конъюгат стрептавидин-пероксидаза.
Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченных антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация ФНО- в определяемых образцах.
Определение ФНО-, методом ИФА в сыворотке крови проводилось в иммунологической лаборатории ФКУЗ «Ставропольский научно исследовательский противочумный институт» д.м.н Жарниковой И.В. Чувствительность тест-системы 1 пг/мл, воспроизводимость (коэффициент вариации результатов) не превышает 10%.
Для подсчета результата анализа на масштабно-координатной бумаге строили калибровочную кривую, по оси абсцисс откладывали концентрации ФНО-, по оси ординат соответствующие показатели оптической плотности. Содержание ФНО- определяли по пересечению значений оптической плотности образцов и калибровочной кривой. Ниже приведен пример калибровочной кривой, полученной при определении ФНО-. 25 пациентам, с целью уточнения диагноза, была проведена пункцион-ная биопсия печени. Далее осуществлялось гистологическое исследование полученного материала. Биопсии выполнялись заведующим кафедрой госпитальной терапии СтГМУ профессором А.В. Ягода или проводились в медицинском центре «Русмед». Процедуру выполняли натощак, в первой половине дня. Были использованы одноразовые наборы инструментов для биопсии печени фирмы «Brown» (Германия) с иглой конструкции Менгини. Биопсийный материал фиксировали 10%-ным раствором формалина. Приготовленные срезы ткани окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван Ги-зону, для окрашивания соединительной ткани. Морфологическое исследование проводилось доцентом кафедры патологической анатомии СтГМУ Кас-торной И.В.
Гистологическую картину печени оценивали по Brunt E.M. [ ]. Согласно этой системе градации морфологических изменений выделяется 3 степени жировой дистрофии (стеатоза): 1 степень – стеатоз 33%; 2 степень – стеатоз 34-66%; 3 степень – стеатоз 66%. При оценки стадии заболевания (стадии фиброза) использовали также систему Brunt E.M.
Кроме вышеуказанных гистологических параметров использовали дополнительно оценка гистологической активности по Knodell, вычисляя индекс гистологической активности. Для этого оценивали в баллах интралобу 60 лярный компонент, некротический компонент, а также выраженность портальной воспалительной инфильтрации.
Для статистического анализа данных применяли пакет программ «Microsoft Office Excel 2007», «Primer of Biostatistics 4.0», «Attestat 10.5.1». Нормальности распределение в группах определялась с помощью критериев Колмогорова и Смирнова. Для сравнительного анализа показателей в группах с нормальным распределением использовали вычисление критерия Стью-дента. В случаях с ненормальным распределением в группах применяли использовались критерий Манна-Уитни. Для выявления наличия корреляционных применялся критерий Спирмэна.
Количественные значения с нормальным распределением были представлены в виде средней±стандартная ошибка средней (x±s-), признаки, характеризующиеся ненормальным распределением, - в виде медианы и интер-квантильного (25 и 75 процентили) размаха (Ме (Q1;Q3)). Достоверными считали различия при р0,05. Диагностическую ценность признаков определяли их чувствительностью, специфичностью, положительной и отрицательной предсказательной ценностью, точностью. Значимость факторов риска определяли с помощью отношения шансов - ОШ.
Таким образом, комплекс проведенных клинических и лабораторно-инструментальных исследований был исполнен в достаточном объеме для осуществления целей и задач, поставленных диссертационным исследованием.
Содержание липополисахарид-связывающего белка у больных неалкогольной жировой болезнью печени
Печень, получая кровь из воротной вены, становится первой мишенью антигенов кишечной микрофлоры и побочных бактериальных продуктов [94]. Эндотоксин (или липополисахарид) является главным компонентом клеточной мембраны грамотрицательных бактерий. Важно, что ЛПС являются естественными лигандами TLR-4. Изменение кишечной микробиоты, избыточный бактериальный рост в тонкой кишке, транслокация бактерий способны повышать уровень эндотоксинемии, стимулировать иммунный ответ, индуцировать продукцию провоспалительных цитокинов, способствовать прогрессированию фиброза [ 9, 209].
Попадая в печень, ЭТ взаимодействует с эндотелиальными клетками синусоидов, что может приводить к возникновению эндотелиальной дисфункции. Физиологическая системная эндотоксинемия может присутствовать в общем кровотоке практически здоровых людей, поддерживая все звенья иммунной системы в состоянии умеренного статуса. При избыточном поступлении ЭТ в кровоток и недостаточности антиэндотоксинового иммунитета может развиваться эндотоксиновая агрессия [7, 17, 87, 146]. Повышенные уровни ЭТ, индуцированные им патологические реакции в печени, а также нарушение параметров антиэндотоксинового иммунитета могут играть важную роль в прогрессировании НАСГ.
Нами было установлено, что у пациентов со стеатозом печени уровень ЭТ нормальный, а прогрессирование в стеатогепатит сопровождается увеличением уровня эндотоксинемии. При этом, диагностическим значимым для больных НАСГ по нашим данным оказался уровень ЭТ 0,93 Ед/мл. Полученный факт свидетельствует о важной роли повышенных уровней ЭТ в раз витии воспалительного процесса в печени. Повышение ЭТ в крови у взрослых и детей при НАСГ показывали и другие авторы [48, 74, 76]. Обоснование этого факта получено на экпериментальных моделях НАСГ. У мышей с индуцированным диетой с преобладанием жира стеатоге-патитом было доказано, что активация провоспалительных механизмов была связана с TLR-4-сигнализацией, вызываемой ЭТ. Авторы наблюдали активацию NF-kB и повышенную чувствительность к TLR-4 лигандам [159]. В результате взаимодействия TLR-4, находящихся в составе поверхностных мембран купферовских клеток, с эндотоксином выделяются провоспалительные медиаторы, которые ведут к повреждению гепатоцитов и развитию фиброза. Ключевая роль TLR-4 купферовских клеток в развитии НАСГ была продемонстрирована в эксперименте, а разрушение последних предотвращало развитие экспериментального НАСГ [253].
При алкогольной болезни печени, имеющей гистологическое сходство с НАСГ, эндотоксин-индуцированная стимуляция клеток Купфера была предложена в качестве важных исходных событий, приводящих к образованию провоспалительных цитокинов и свободных кислородных радикалов [43, 248]. Однако, есть сведения, что активированные клетки Купфера способны оказывать и протекторный эффект на гепатоциты [16].
Показатели ЭТ не зависели от возраста и пола пациентов. Анализ зависимости уровня эндотоксинемии от степени ожирения показал, что содержание ЭТ было выше в сыворотке крови больных с 3-ей степенью ожирения сравнительно с показателями пациентов с ИМТ 30. Есть сведения, что у человека ожирение коррелировало со снижением разнообразия микрофлоры кишечника, являющейся основным источником ЭТ [20].
Содержание ЭТ в крови при стеатогепатите находилось в прямой зависимости от уровней инсулина, триглицеридов и значения НОМА-индекса, а при стеатозе такой зависимости не было. Взаимосвязь повышенных уровней ЭТ с компонентами метаболического синдрома хорошо характеризует термин «метаболическая эндоксинемия», предложенный Cani P.D. с соавт [52, 150]. Авторы на мышах с экспериментально индуцированном ожирением, показали повышение уровней ЭТ, отличное от наблюдаемого при сепсисе – в 10-50 раз ниже, но, тем не менее, клинически значимое. Хроническая воспалительная реакция, спровоцированная субклинической эндотоксинемией, может играть важную роль в патогенезе метаболических нарушений [52, 129, 150].
Имеется мнение, что именно ЛПС через CD14-рецепторный аппарат влияет на чувствительность к инсулину, приводя к развитию ИР [52, 150]. Подтверждением этой гипотезы является факт наличия более высокого уровня ЛПС у пациентов с СД 2-го типа, чем у пациентов без диабета [129].
Имелась прямая корреляционная зависимость между ЭТ и активностью аминтотрансфераз при НАСГ, а у больных стеатозом печени только между ЭТ и АсАТ. Есть данные, что уровень сывороточного ЭТ увеличивается с нарастанием тяжести НАЖБП [135,171]. ЛПС является самым мощным инициатором воспалительной реакции, а эндотоксемия сопровождается токсическим воздействием практически на все системы организма [41]. Наличие связи эндотоксинемии с активностью воспаления в печени представляется логичной, так как ЭТ способен вызывать поражение паренхимы, индуцируя синтез провоспалительных цитокинов [43].
Полученные данные подтверждают мнение, что хроническая эндоток-синемия может вести себя как «гепатотоксин», имея особое значение в стимуляции воспаления ткани печени, прогрессированию фиброза и резистентности к инсулину [135, 171].