Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Эндотелиальная дисфункция при неалкогольной жировой болезни печени (обзор литературы)
1.1. Эпидемиология неалкогольной жировой болезни печени 14
1.2. Патогенетические механизмы неалкогольной жировой болезни печени
1.3. Эндотелиальная дисфункция 19
1.3.1. Общие понятия об эндотелии, эндотелиальной дисфункции и ее клинических проявлениях
1.3.2. Эндотелиальная дисфункция и неалкогольная жировая болезнь печени
1.3.3. Эндотелин-1 и его роль в патологии печени 25
1.3.4. Оксид азота и его роль в патология печени 30
1.3.5. Циркулирующие (десквамированные) эндотелиальные клетки и их роль при заболеваниях печени
1.4. Лечение неалкогольной жировой болезни печени 37
1.4.1. Общие принципы терапии неалкогольной жировой болезни печени
1.4.2. Принципы медикаментозной терапии неалкогольной жировой 37
болезни печени (инсулинсенситайзеры, гиполипидемические препараты, гепатопротекторы)
1.5. Возможности медикаментозного влияния на эндотелиальную 39
дисфункцию
ГЛАВА II. Клиническая характеристика больных 42
ГЛАВА III. Методы исследования 54
3.1. Общие клинические и лабораторно-инструментальные методы исследования
3.2. Специальные методы исследования 55
3.2.1. Определение содержания уровня эндотелина-1 в сыворотке крови
3.2.2. Определение содержания уровня оксида азота (NO) в сыворотке крови
3.2.3. Определение в сыворотке крови уровня циркулирующих эндотелиальных клеток
3.3. Морфологическое исследование биоптатов печени 61
3.4. Статистическая обработка материала 62
ГЛАВА IV. Показатели эндотелиальной дисфункции у больных неалкогольной жировой болезнью печени (собственные данные)
4.1. Содержание эндотелина-1 в крови больных неалкогольной жировой болезнью печени
4.2. Содержание NO в крови больных неалкогольной жировой болезнью печени
4.3. Содержание циркулирующих эндотелиальных клеток в крови 87
больных неалкогольной жировой болезнью печени
4.4 Влияние терапии на показатели эндотелиальной дисфункции у пациентов с НАЖБП
4.4.1. Влияние комплексной терапии на показатели эндотелиальной 96 дисфункции у пациентов с НАЖБП
4.4.2. Возможные перспективы медикаментозного влияния на функ- 100 цию эндотелия у пациентов с НАЖБП
ГЛАВА V. Обсуждение 102
Выводы 117
Практические рекомендации 119
Перспективы дальнейшей разработки темы 120
Список сокращений 121
Список литературы
- Общие понятия об эндотелии, эндотелиальной дисфункции и ее клинических проявлениях
- Общие принципы терапии неалкогольной жировой болезни печени
- Специальные методы исследования
- Возможные перспективы медикаментозного влияния на функ- 100 цию эндотелия у пациентов с НАЖБП
Общие понятия об эндотелии, эндотелиальной дисфункции и ее клинических проявлениях
Постоянно увеличивается число доказательств, подтверждающих, что при НАЖБП первичными являются метаболические нарушения [153,170,71]. Инсулинорезистентность занимает центральное место в этих метаболических нарушениях и может привести к развитию НАЖБП [39]. Затем жировая дистрофия печени может вызывать повреждение гепатоцитов и воспаление посредством оксидативного стресса, что в свою очередь приводит к прогрессированию НАСГ в цирроз печени.
Начальные теории патогенеза НАСГ были основаны на теории «2-х ударов». «Первый удар» - накопление в печени триглицеридов, или стеатоз, увеличивает восприимчивость печени к воспалению, опосредованному «вторым ударом», или воспалительными цитокинами/адипокинами, митохондри альной дисфункцией и оксидативным стрессом. Всё это в результате приво дит к стеатогепатиту и/или фиброзу печени [67,68]. Основным элементом НАЖБП является накопление триглицеридов в виде жировых капель в цитоплазме гепатоцитов, что является необходимым условием для последующих событий развития стеатогепатита. Обычно на биопсиях печени хорошо видно, что более чем 5-10% гепатоцитов содержат капельки жира [71,44,111]. Снижение чувствительности тканей к инсулину и нарушение поступления глюкозы в клетки сопровождается повышением скорости липолиза в жировой ткани и увеличением концентрации СЖК в сыворотке крови. Гиперинсулинемия также способствует снижению скорости -окисления СЖК в печени и нарастанию синтеза липопротеинов очень низкой плотности. Избыточное поступление СЖК в печень, образование из них эфиров (триглицеридов) и одновременно снижение скорости окисления СЖК способствуют формированию жировой дистрофии печени [16]. Избыток углеводов, либо из пищевых источников или из de novo процессов глюконеогенеза в печени, также является основным стимулом для de novo cинтеза жирных кислот в печени.
Ожирение является вялотекущим хроническим воспалительным состоянием. Связанные с ожирением цитокины, такие как интерлейкин-6, адипонектин, лептин и ФНО-, играют важную роль в развитии НАЖБП. Жировая ткань в настоящее время признается источником важных медиато ров воспаления и адипокинов, оказывающих как провоспалительные (лептин, ФНО- и ИЛ-6), так и противовоспалительные (адипонектин) эффекты [44,111,211,179]. Хотя эти цитокины и гормоны могут нормально работать, находясь в оптимальных соотношениях, этот гомеостаз нарушается при НАСГ, в виде снижения уровней адипонектина и увеличения ФНО-. Сразу несколько механизмов могут играть роль в возникновении ге патоцеллюлярного повреждения при развитии НАЖБП, многие из которых генерируют активные формы кислорода. Печень с избыточным накоплением жира более уязвима для стрессовых факторов, таких как реактивные АФК, адипокины и цитокины, чем нормальная печень.
Факторы, которые играют ключевую роль в развитии НАСГ из простого стеатоза печени, до сих пор не до конца изучены [213,239,146,170]. Предполагаемыми возможными причинами являются оксидативный стресс, являющийся следствием увеличения продукции АФК и снижения антиоксидантов, пероксидация липидов, реактивные метаболиты, такие как малондиальдегид и 4-гидрокси-2-ноненаль, продукты жировой ткани, трансформирующий фактор роста-1, Fas-лиганды, митохондриальная дисфункция и дефицит дыхательной цепи, кишечная микрофлора, повышающая проницаемость кишечной стенки, увеличение запасов энергии от диеты, бактериальные липополисахариды, эндотоксины и ФНО-.
Кроме того, имеется дополнительный компонент, или «третий удар», который отражает недостаточную пролиферацию гепатоцитов [137 ]. В здоровой печени, гибель клеток, стимулирует репликацию зрелых гепатоцитов, которые заменяют мертвые клетки и восстанавливают функцию нормальной ткани [137]. Однако оксидативный стресс, являющийся главной чертой патогенеза НАЖБП, ингибирует репликацию зрелых гепатоцитов, что приводит к увеличению популяции печеночных клеток-предшественниц (овальные клетки) [183]. Эти клетки могут дифференцироваться в гепатоцито-подобные клетки. Количество и овальных клеток, и промежуточных гепатоцитоподоб-ных клеток значительно коррелирует со стадией фиброза, предполагая, что совокупный убыток гепатоцитов способствует и накоплению клеток-предшественниц, и их дифференцировке в сторону гепатоцитов [183]. Активация этих клеток также участвует в гепатоцеллюлярном карциногенезе [183]. При хроническом повреждении печени развитие фиброза/цирроза зависит от эффективности регенерации гепатоцитов, и, следовательно, гибель клеток с нарушением пролиферации гепатоцитов - предшественников представляет предлагаемый «третий удар» в патогенезе НАЖБП [137].
Общие принципы терапии неалкогольной жировой болезни печени
При изучении липидного спектра обследованных больных были выявлены признаки дислипидемии в виде повышения уровней общего холестерина, ХсЛПНП и триглицеридов.
Для определения наличия у пациентов синдрома инсулинорезистентно-сти, как одной из составляющих метаболического синдрома и НАЖБП, у больных также исследовали углеводный обмен. Изучали уровень глюкозы и инсулина натощак, а также высчитывали значение НОМА-индекса.
НОМА-индекс 4,08±0,25 Данные таблицы 2.5 отражают повышение средних значений уровней глюкозы и инсулина в крови обследованных больных НАЖБП натощак. Показатель НОМА – индекса, выбранный нами для верификации наличия синдрома инсулинорезистентности, оказался также значительно превышающим нормальные значения. При этом клинически нарушения углеводного обмена у наших пациентов в клинической картине проявлялись различно. В 20 случаях был диагностирован сахарный диабет 2-го типа, а у 21 пациента нарушение углеводного обмена были расценены эндокринологом как нарушение толерантности к глюкозе.
Артериальная гипертензия, являющаяся другим компонентом метаболического синдрома, имела место у 47 больных (33%). Этот факт представлялся нам чрезвычайно важным, так как АГ могла вносить значительный вклад в развитии ЭД. 21 пациенту была выполнена пункционная биопсия с последующим морфологическим исследованием биоптатов (доцент Касторная И.В.). Полученные данные морфологической картины печеночных биоптатов больных НАЖБП представлены на рис. 2.3 и рис. 2.4.
Сопутствующие заболевания у наших больных представлены в таблице 2.6. Сопутствующей патология была представлена патологией билиарного тракта (функциональные заболевания, желчнокаменная болезнь), патологией желудка (хронический гастрит, хронический дуоденит), гастро-эзофагеальной рефлюксной болезнью, функциональной патологией кишечника, хроническим панкреатитом. Все сопутствующие заболевания у пациентов с НАЖБП были вне стадии обострения.
20 больных НАЖБП были обследованы в динамике 1 месяца комплексной терапии. Пациентам были рекомендованы диетические ограничения и адекватные физические нагрузки, а также комплекс препаратов, влияющих на основные звенья патогенеза.
Эти пациенты получали комплексную терапию, которая включала препарат, влияющий на чувствительность инсулиновых рецепторов - метформин (сиофор или глюкофаж) в дозе в дозе 1000-2000 мг/сут в зависимости от веса пациента. В связи с тем, что инсулинорезистентность является важным фактором патогенеза НАЖБП, метформин выступал в качестве основного патогенетического средства. Тот факт, что у основной массы пациентов имелась ги-перлипидемия, в частности гиперхолестеринемия, определил необходимость назначения статинов. С этой целью больным назначались препараты статинов - аторвастатин в дозе 10 мг/сут.
Третьим препаратом комплексной терапии явился гепатопротектор Фосфоглив форте - препарат, содержащий эссенциальные фосфолипиды и натрия глицирризинат, обладающий противовоспалительным действием. Препарат назначался по 2 капс 3 раза в день.
Кроме основной группы больных, обследованных в динамике комплексного лечения, мы выделили 10 пациентов, которые была проведена монотерапия препаратом сулодексид (Вессел Дуэ Ф). Медикамент относится к системным препаратам, принадлежащим к группе гепариноидов. Это глико-заминогликан высокой степени очистки. Основными медикаментозными эффектами сулодексида являются: способность восстановления функции и ан-титромботического потенциала эндотелия, нормализация реологических свойств крови и микроциркуляции, повышение активности фибринолиза, ослабление воздействия метаболических изменений. Целью назначения суло-дексида явилась его потенциальная возможность воздействия на функцию эндотелия. Препарат назначался в течение 1 месяца в дозе по 1 капсуле (250 ЛЕ) 2 раза в день. Перед назначением сулодексида пациенты подписывали информированное согласие.
Таким образом, из приведенной выше характеристики пациентов, становится ясно, что клинический материал представлен достаточным количеством больных НАЖБП. Все больные были обследованы современными методами исследования, позволяющими диагностировать НАЖБП разных стадий: от простого стеатоза печени до неалкогольного стеатогепатита. Больные были обследованы как до начала лечения, так и в динамике после патогенетической терапии, а также была выделена опытная группа пациентов, получавшая целенаправленное лечение для коррекции ЭД. Выполненный объём работы позволил реализовать поставленные цели и задачи.
Специальные методы исследования
Забор крови производился у больных из кубитальной вены в утренние часы строго натощак (период полной абстиненции не менее 24 часов). Забор крови осуществлялся до и после манжеточной пробы. После забора крови в спокойном состоянии, пациентам на плечо накладывалась манжетка от тонометра, воздух нагнетался до уровня на 10 мм выше уровня систолического АД. В таких условиях больной находился не менее 3-х минут. Затем манжетка снималась, пациенту сразу же производился забор крови. Пробирки центрифугировали в течение 15 минут центрифуге со скоростью 3000 оборотов в минуту с плавающим ротором при комнатной температуре.
Уровень ЦЭК определялся с помощью метода изоляции клеток вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью аденоз-инфосфата (АДФ). Цитологический контроль исследуемой клеточной популяции осуществляли иммунохимически посредством стрептавидин - биотино-вого теста. Суспензию клеток наносили на предметные стёкла инкубировали с моноклональными антителами к антигену CD-31 (фирма "Dako" Дания). Данный анализ производился в ООО «Центр клинической фармакологии и фармакотерапии».
Контрольную группу составили те же 20 здоровых добровольцев, у которых осуществляли забор крови для определения ЭТ-1 и NO. Уровень ЦЭК до наложения манжетки у здоровых составил 3,05±0,2 клеток 104/л, а после наложения манжетки - 5,9±0,33 клеток 104/л.
Для уточнения степени поражения печени (выраженности стеатоза и воспалительных изменений, стадии фиброза) 21 пациенту была проведена пункционная биопсия печени с последующим гистологическим исследованием полученного материала. Прицельная пункционная биопсия печени проводилась во всех случаях в клинике «Русмед». Полученный образец ткани фиксировали 10%-ным раствором формалина. Приготовленные срезы ткани окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван Гизону Все биптаты печени оценивались доцентом кафедры патологической анатомии Касторной И.В.
Степень стеатоза и стадию процесса оценивали по Brunt Е.М. По Brunt Е.М. выделяют 3 степени стеатоза: 1 степень - стеатоз 33% всех гепатоци-тов, 2 степень - стеатоз 34-66%, 3 степень - стеатоз 66%. Стадию заболевания (степень фиброза) оценивали также по Brunt Е.М [Brunt]. При фиброзе I стадии отмечается перисинусоидальный фиброз, при Пстадии - к перисину-соидальному фиброзу добавляются признаки портального /перипортального фиброза. При III стадии фиброза печени отмечается появление септ, а IV стадия фиброза характеризуется выраженным септальным фиброзом и формированием цирроза [177].
Параллельно морфологической оценки НАБЖП по Brunt Е.М., также дополнительно использовалась оценка гистологической активности по Кп-odell. Данный дополнительный морфологический анализ был проведён для получения балльной оценки воспаления с последующим статистическим анализом возможных взаимосвязей между маркерами эндотелиальной дисфункции и проявлением гистологической активности. 3.4. Статистическая обработка материала
Для статистической обработки полученных результатов использовались компьютерные программы «Microsoft Office Excel 2007» с встроенной подпрограммой «Attestat 10.5.1», «Biostat», «Statistica 6,0».
Для выявления нормальности распределения использовались критерии Колмогорова и Смирнова. По всем изученным параметрам у всех обследованных групп применялись параметры описательной статистики. Вычисление критерия Стьюдента использовалось при сравнительном анализе у групп с нормальным распределением. Критерий Манна - Уитни вычислялся в группах с ненормальным распределением. Корреляционный анализ проводился с определением критерия Спирмэна. Количественные значения с нормальным распределением были представлены в виде средней±стандартная ошибка средней (X±s ). Данные выборок с ненормальным распределением описывались в виде медианы и интерквантильного (25 и 75 процентили) размаха (Ме (Q1 - Q3)). Достоверными считали различия при p 0,05. Для расчета оптимального значения величины порога отсечения использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) с построением ROC-кривой. Диагностическую ценность признаков определяли их чувствительностью, специфичностью, положительной и отрицательной предсказательной ценностью, точностью. Значимость факторов риска определяли с помощью отношения шансов - ОШ.
Из всего вышеперечисленного следует, что комплекс проведённых исследований был выполнен на современном уровне и в достаточном объёме для осуществления задач и решения вопросов, поставленных диссертацией.
Выражаю благодарность сотрудникам гастроэнтерологического отделения ГБУЗ СК «СККЦ СВМП» (зав. отделением Гаврилова Л.Б.) за большую помощь и содействие в выполнении клинической части работы.
Возможные перспективы медикаментозного влияния на функ- 100 цию эндотелия у пациентов с НАЖБП
Анамнез. Считает себя больным в течение двух лет, когда при сдаче крови (отя-гощённый анамнез по сахарному диабету) было выявлено умеренное повышение уровня аминотрансфераз. При обследовании маркеры гепатитов В и С отрицательные. Был проконсультирован инфекционистом по месту жительства, принимал хофитол, карсил, дюспа-талин без эффекта — сохранялось повышение АлАТ, АсАТ в крови. Консультирован в ге-патологическом кабинете ГБУЗ «СККЦ СВМП», установлен диагноз неалкогольного стеа-тогепатита. По данным анализов крови определяются нарушения липидного обмена, гипе-ринсулинизм, инсулинорезистентность, по результатам УЗИ — спленомегалия, нарушения портального кровотока.
Объективно: Общее состояние удовлетворительное. Повышенного питания (ИМТ 35). ОТ=117 см, ОБ=109 см, ОТ/ОБ=1,07. Кожные покровы и слизистые обычной окраски, стрии на передней брюшной стенке. Склеры субиктеричные. Язык влажный, обложен жёлто-белым налётом. Дыхание везикулярное. Сердечные тоны ритмичные, ясные. ЧСС = Ps = 68 в мин. АД 120/75 мм. рт. ст. Живот увеличен в объёме за счёт подкожно — жировой клетчатки, мягкий, безболезненный при пальпации. Нижний край печени + 1-2 см ниже края рёберной дуги, плотноэластической консистенции, гладкий. Границы по Курлову 13-9-8 см. Селезёнка не пальпируется. Симптом «поколачивания» по поясничной области отрицательный с обеих сторон. Стул, мочеиспускание без особенностей.
Данные дополнительных исследований: Общий анализ крови: эр.- 6,15 1012/л, Нb - 168 г/л, лейк.- 8,7 109/л, тромб. – 231 109/л, э.-0 %, п.я.-0 %, с.я.-72 %, лимф.-24 %, мон.-4 %, СОЭ- 5мм/ч. Общий анализ мочи – без патологии.
Биохимические анализы. Билирубин – 14,2 мкмоль/л. АлАТ – 71,2 Ед/л, АсАТ – 35,3 Ед/л. ГГТ – 38 Ед/л, ЩФ — 191 ед/л. Общий белок – 80,5 г/л, альбумин – 51,1 г/л. Холестерин общий – 5,8 ммоль/л, триглицериды 3,8 ммоль/л, ХсЛПВП – 0,5 ммоль/л, ХсЛПНП – 4,7 ммоль/л. Глюкоза крови – 4,32 ммоль/л. Инсулин до еды 23,24 мкМЕ/мл. НОМА=4,46 Маркеры вирусных гепатитов: HBsAg (-), anti-HCV (-). УЗИ. Печень: правая доля 142 мм, левая – 86 мм, контуры ровные, эхогенность повышена, звукопроводимость ослаблена, сосудистый рисунок обеднён, внутрипечёночные протоки не расширены. В левой доле визуализируется участок более низкой эхогенности, неправильной формы, с нечёткими контурами, размерами 12 8 мм, средней звукопроводимости (дифференцировать с неизменённым участком паренхимы). Воротная вена 12 мм, печёночные вены 8 мм, селезёночная вена 6 мм, холедох 5 мм. Желчный пузырь расположен обычно, с фиксированным перегибом в области тела, размерами 61 29 мм, стенки 3 мм, повышенной эхогенности, содержимое однородное. Селезёночная вена в области ворот — 7 мм.
Биопсия печени. Гистология печени от 08.06.2011 г.: ткань печени, дольковое строение сохранно. Портальные тракты небольшие, но с явным фиброзом, скудной лимфо-цитарной инфильтрацией без пролиферации желчных протоков. Умеренный фиброз стенок центральных вен. Прослеживается очаговая капилляризация синусоидов, а также тонкие порто – перипортальные фиброзные септы. Гидропическая и диффузная крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов. Заключение: хронический стеатогепатит метаболического генеза. Индекс Кноделя 5 баллов. Индекс Десмета 2 балла. Brunt: 3 степень стеатоза, фиброз 3ст.
Показатели эндотелиальной дисфункции: Эндотелин-1 - 0,5 фмоль/л, оксид азота — 34,2 мкмоль/л, ЦЭК (до нагрузки) — 6 кл. 104/л, ЦЭК (после нагрузки) — 20 кл. 104/л.
Данный клинический пример демонстрирует повышение показателей ЭТ-1, оксида азота и ЦЭК у пациента с НАСГ метаболического генеза, развившимся на фоне инсулинорезистентности, ожирения 2 степени, с наличием гистологических признаков активности стеатогепатита, значительной выраженностью жировой дистрофии гепатоцитов (3 ст. по E. Brunt) и уровнем фиброза III стадии.
Таким образом, нами было установлено, что у всех пациентов с НАЖБП имеется повышенный уровень ЦЭК, при этом у пациентов с НАСГ этот показатель был выше, чем при стеатозе печени. Содержание ЦЭК не зависело от пола и возраста пациентов, степени выраженности ожирения, а также от наличия сопутствующей АГ или СД 2 типа. Уровень ЦЭК в крови и при стеато-гепатите (но не при стеатозе) находился в прямой зависимости от активности АлАТ и содержания общего холестерина как до, так и после нагрузки ман жеткой. При НАСГ была выявлена положительная связь между содержанием ЦЭК после наложения манжетки и показателем НОМА-индекса, а при стеато-зе такой зависимости не было.
Полученные нами в результате исследования данные свидетельствовали о наличии ЭД у больных НАЖБП. Однако возникает вопрос о возможной обратимости этих изменений при проведении терапевтических мероприятий. На сегодняшний день четких схем терапии НАЖБП не существует. Терапия жировой болезни печени должна включать в себя модификацию образа жизни (диетические мероприятия + адекватные физические нагрузки), применение инсулиновых сенситайзеров, а также гепатопротекторов.
У 20 пациентов с НАСГ показатели ЭД изучались в динамике – до и после месяца комплексной терапии. Пациентам рекомендовались диетические ограничения, обязательным компонентом медикаментозной терапии, учитывая имеющуюся у всех этих пациентов инсулинорезистентность, являлся мет-формин. Метформин назначался после консультации эндокринолога в дозе 1000-2000 мг/сут в зависимости от веса пациента. В качестве гепатопротекто-ра назначался Фосфоглив форте – препарат, содержащий эссенциальные фосфолипиды и натрия глицирризинат, обладающий противовоспалительным действием. Для снижения гиперлипидемии назначался аторвастатин 10 мг/сут. Для изучения показателей функции эндотелия исследовали содержание в крови ЭТ-1 и оксида азота.