Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Эпидемиология язвенного колита 11
1.2. Клинические особенности язвенного колита 11
1.3. Диагностика язвенного колита с использованием лабораторных и инструментальных методов 13
1.4. Язвенный колит и колоректальный рак 27
1.5. Иммуногистохимические методы в диагностике язвенного колита 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1 Клиническая характеристика обследованных больных 40
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Общая характеристика методов исследования 43
2.2.2. Эндоскопические методы исследования 46
2.2.3. Морфологические методы исследования 47
2.3. Статистическая обработка полученных результатов исследования 50
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 52
3.1. Клинические особенности пациентов с язвенным колитом 52
3.2. Гистологические особенности слизистой оболочки толстой кишки при язвенном колите 71
3.3. Иммуногистохимические показатели эпителиальных клеток толстой кишки у пациентов с язвенным колитом 76
3.4. Особенности экспрессии лектинов в слизистой оболочке толстой кишки при язвенном колите 89
3.5. Разработка критериев и способов диагностики тяжести атаки и активности язвенного колита с использованием методов математического анализа. 94
3.6. Определение взаимосвязи признаков 100
Заключение 101
Выводы. 108
Практические рекомендации 109
Список использованной литературы .
- Клинические особенности язвенного колита
- Иммуногистохимические методы в диагностике язвенного колита
- Эндоскопические методы исследования
- Особенности экспрессии лектинов в слизистой оболочке толстой кишки при язвенном колите
Клинические особенности язвенного колита
В настоящее время выявлены многочисленные типы углеводсвязывающих белков в тканях, биологических жидкостях и на поверхности клеток человека и животных [Королев Н.П., 1984; Gearing A.S.H., Newman W., 1993; Taylor M. E., Drickamer K., 1993; Powell L.D., Varki A., 1993; Barondes S.H. et al., 1994]. Углеводные структуры различной степени сложности экспрессированы на поверхности клеток и являются составной частью клеточных рецепторных систем, участвующих в процессах молекулярного узнавания и трансмембранной сигнализации [Rosales C., Juliano R.L., 1995; Manning J.C. et al., 2004; Villalobo A., Nogales-Conzalez A., Galius H.J., 2006].
Специфичность связывания лектинов с углеводными детерминантами представлена в работах оригинального и обзорного характера [Степанов С.А. и др., 1994; Шаповалова Е.Ю., Луцик А.Д., 2000; Лебединская О.В. и др., 2005; Лутай Н.В. и др., 2007; Gabius H.J., 1987; Allen H.J. et al., 1991; Chovanec M. et al., 2005].
В 1994 году С.А. Степанов и соавт. оценивали состояние слизеобразующего аппарата желудка и двенадцатиперстной кишки у детей при гастродуоденальной патологии, используя лектиновую гистохимию. Для характеристики процесса биосинтеза гликопротеидов в слизеобразующих клетках были использованы лектин бобовника анагиролистного (LAL) со специфичностью к L-фукозе, лектин бузины черной (SNA), специфичный к N-ацетилнейраминовой кислоте, лектин завязей пшеницы (WGA), специфичный к N-ацетилглюкозамину и лектин арахиса (PNA), специфичный к D-галактозе. Результаты исследования свидетельствуют об усилении процессов сиалирования секрета при состояних, характеризующихся высоким типом кислотообразования в желудке. У пациентов с хроническим гастродуоденитом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки удалось выявить закономерности процессов биосинтеза секреторных гликопротеидов и перераспределение рецепторов лектинов в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки. В последние годы в литературе появились работы с применением лектинов при заболеваниях толстой кишки, в том числе при ЯК.
А.Э. Дорофеев, О.А. Рассохина (2011) применяли лектины (завязей пшеницы, арахиса, семян чечевицы, бузины черной и др.) для оценки изменений слизистого барьера толстого кишечника при язвенном колите. Оказалось, что после лечения месалазином количество отдельных моносахаридов слизи у больных повышалось: количество галактозы (окраска PNA и ML-1), уровень глюкозы и глюкозамина (окраска HPA) достоверно возрастали, но уровень галактозамина, фукозы, маннозы слизи (окраска SNA, LAL, LCA) увеличивался недостоверно. На основании полученных результатов авторы сделали вывод о том, что изменения слизистого барьера являются патогенетически значимыми у больных язвенным колитом, и применение месалазина не только оказывает выраженный противовоспалительный эффект, но и приводит к нормализации процессов слизеобразования.
В работе Mario R. Melo-Jnior et al. (2004) оценивали углеводный состав клеточной поверхности эпителиоцитов толстой кишки у здоровых людей и больных язвенным колитом с использованием лектиновой гистохимии. В работе применялись следующие лектины: Con A – конканавалин, WGA – зародышей пшеницы, LTA – лектин лотуса, PNA – лектин арахиса. Результаты исследования показали, что у здоровых людей в железистом эпителии толстой кишки отмечалась экспрессия только лектина LTA, которая была слабой. У больных язвенным колитом была выявлена выраженная экспрессия LTA и WGА. Таким образом, авторы предполагают, что использование данных лектинов может оказаться перспективным для диагностики изменений при язвенном колите.
Экспрессию галектина-4 в клетках эпителия слизистой оболочки толстой кишки у пациентов с язвенным колитом, в участках дисплазии эпителия и у пациентов с колорекатальным раком изучали Kim S.W. et al (2013). Результаты исследования показали высокий уровень экспрессии галектина-4 в нормальной слизистой оболочке толстой кишки. И наоборот, уровень экспрессии галектина-4 был значительно ниже в образцах с дисплазией или у пациентов с КРР.Ученые предполагают, что низкий уровень галектина-4 приводит к пролиферации раковых клеток и способствует экспрессии генов-мишеней NF-kB и STAT3, связанных с раком.
Kuo J. Chin-Hun et al. (2016) изучали возможность применения с целью скрининга колоректального рака флюоресцентно меченые лектины. Для дифференциальной диагностики диплазии от нормальной ткани толстой кишки исследователи распыляли лектин завязей пшеницы (WGA) на поверхность свежей резицированной ткани толстой кишки мышей и биоптаты ткани толстой кишки у 47 человек. Отмечались значительные различия в экспрессии WGA у человека в неизмененном эпителии толстой кишки, гиперпластическом эпителии, в участках с дисплазией низкой и высокой степени и в карциноме. При этом чувствительность метода составила 81%, специфичность 87% и прогностическая ценность положительного результата 93%.
Block M. et al. (2016) изучали роль галектинов при язвенном колите. Гелектины участвуют в большом количестве физиологических и патофизиологических процессов. В этом исследовании изучалась экспрессия этих лектинов в слизистой оболочке толстой кишки у пациентов с ЯК (n=22) и в контрольной группе (n=11). Биоптаты слизистой оболочки толстой кишки окрашивали с помощью антител, распознающих галектин-1, галектин-2, галектин-3, и галектин-4. Галектин-1 не был обнаружен в нормальной слизистой оболочке и у пациентов с ЯК, в то время как экспрессия галектина-2, галектина-3, и галектина-4 была сильно выражена. Тенденция к уменьшалась эпителиальной экспрессии с увеличенной воспалительной класса галектина-2, галектин-3 и галектина-4 был также найден. При ЯК были выявлена сильная экспрессия галектина-2 и слабая экспрессия галектина-3. Четкой корреляции между экспрессией галектинов и тяжестью ЯК не обнаружено.
Иммуногистохимические методы в диагностике язвенного колита
Таким образом, у пациентов в возрасте старше 40 лет отмечается снижение количества жалоб по сравнению с лицами более молодого возраста, в связи с чем при оценке тяжести патологического процесса у данного контингента пациентов следует в большей мере ориентироваться на лабораторные данные и результаты эндоскопического обследования, чем на клиническую симптоматику.
Для примера приводим два клинических случая. Клинический пример 1. Пациент К. 19 лет поступил в гастроэнтерологическое отделение с жалобами на кашицеобразный стул до 5 раз в сутки с наличием примеси крови и слизи, боли в животе, преимущественно в левых отделах живота, урчание в животе, снижение аппетита, тошноту, слабость, плохой сон. Анамнез заболевания: считает себя больным в течение 10 дней, когда появились вышеописанные жалобы. Объективно: состояние средней степени тяжести. Температура тела в подмышечной впадине 37,30С. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС 88 в минуту. АД 120/80 мм. рт. ст. Живот при пальпации мягкий, болезненный в левых отделах живота. Стул 4-5 раз в сутки, кашицеобразный, с примесью крови. При обследовании выявлены лейкоцитоз (10,8 109/л); анемия (гемоглобин 115 г/л); ускорение СОЭ до 23 мм/ч; повышение СРБ – 16 мг/л. Антитела к гельминтам - отрицательные, патогенные бактерии в кале не обнаружены. В копрограмме определялись эритроциты до 50 в п/зр, лейкоциты до 30-40 в п/зр. При колоноскопии: начиная от ануса до селезеночного угла толстой кишки слизистая контактно кровоточит, неравномерно гиперемирована, с множественными эрозиями. Биопсия: воспалительная инфильтрация слизистой оболочки.
Пример № 1 демонстрирует, что у пациента К. 19 лет имеет место выраженная клиническая картина заболевания и согласно нашей анкете (табл.4), суммарное количество жалоб составило 9. На основании данных объективного обследования, результатов лабораторно-инструментального исследования был выставлен диагноз: Язвенный колит, острое течение, левостороннее поражение, среднетяжелая атака (II степень эндоскопической активности).
Клинический пример 2. Пациент Б. 45 лет поступил в гастроэнтерологическое отделение с жалобами на кашицеобразный стул до 4 раз в сутки, прожилки крови в кале, отсутствие аппетита, плохой сон. Анамнез заболевания: считает себя больным в течение недели, когда после стресса появились вышеописанные жалобы.
Объективно: состояние средней степени тяжести. Температура тела в подмышечной впадине 37,10С. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС 95 в минуту. При пальпации живот мягкий, болезненный в левых боковых отделах живота. Стул 3-4 раза в сутки, кашицеобразный, с примесью крови. При обследовании выявлены лейкоцитоз (11,8 109/л); анемия (гемоглобин 109 г/л); ускорение СОЭ (25 мм/ч); повышение СРБ – 19 мг/л. Антитела к гельминтам - отрицательные, патогенные бактерии в кале не обнаружены. В копрограмме: эритроциты до 30-40 в п/зр., лейкоциты до 70 в п/зр. При колоноскопии: начиная от ануса до селезеночного изгиба толстой кишки слизистая гиперемирована, контактно кровоточит, с множеством разнокалиберных эрозий, единичные язвы. Биопсия: воспалительная инфильтрация слизистой оболочки. Как следует из примера 2, у пациента Б. 45 лет по данным объективного обследования, результатов лабораторно-инструментального исследования был выставлен диагноз: Язвенный колит, острое течение, левостороннее поражение, среднетяжелая атака (II степень эндоскопической активности), однако клиническая картина заболевания менее выражена и согласно нашей анкете (табл.4), суммарное количество жалоб составило 4.
Таким образом, у обоих пациентов с острым течением язвенного колита, левосторонним поражением, среднетяжелой атакой и II степенью эндоскопической активности число жалоб было различным. Значительно большее количество жалоб предъявлял пациент молодого возраста.
При анализе коагулограммы не выявлено статистически значимых различий по показателю ПТИ и АЧТВ между группами пациентов с ЯК (табл. 18). Однако отмечалось увеличение фибриногена при повышении активности заболевания (р0,06), увеличении тяжести обострения (р0,03) и протяженности воспалительного процесса в толстой кишке (р0,01).
Эндоскопические методы исследования
У 48 пациентов с ЯК в возрасте от 20 до 66 лет (24 женщины и 24 мужчины) и в группе сравнения проводилось изучение экспрессии лектинов в слизистой оболочке толстой кишки.
У практически здоровых людей ни в одном случае не отмечалось экспрессии лектинов: завязей пшеницы WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину, бобовника анагиралистного LAL-тропного к -L-фукозе (–LFuc) и арахиса PNA-тропного к дисахариду Gal1-3GalNAc.
При ЯК экспрессия лектина арахиса и бобовника анагиралистного отсутствовала, однако имелись различия в экспрессии лектина завязей пшеницы WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину. У пациентов с ЯК только в 4-х случаях из 48 наблюдалась отрицательная реакция при использовании лектина завязей пшеницы WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину. Следует отметить, что во всех 4-х случаях это был дистальный колит с длительностью заболевания от 1 года до 5 лет, с легкой атакой и I степенью эндоскопической активности. Остальные пациенты с ЯК (n=44) в зависимости от длительности заболевания были разделены на 3 группы: с длительностью заболевания до 1 года (n=12), от 1 года до 5 лет (n=14) и более 5 лет (n=18). У 6 больных отмечалось легкое обострение заболевания, у 34 – среднетяжелое, у 4 – тяжелое. По локализации воспалительного процесса дистальный колит наблюдался у 12 человек, левосторонний – у 20 и тотальный – в 12 случаях.
В зависимости от эндоскопической активности заболевания больные были распределены на 3 группы: I степень активности была установлена у 14 пациентов, II степень – у 24 и III степень – у 6. Результаты исследования экспрессии лектина в зависимости от длительности ЯК представлены в таблице 31. Таблица 31
Как видно из таблицы 31, у 83% больных с длительностью заболевания до 1 года экспрессия наблюдалась практически во всех клетках железистого эпителия (80-100%). С увеличением длительности заболевания процент пациентов с такой же выраженностью экспрессии снижался до 58% во второй группе и до 34% в третьей группе с продолжительностью заболевания более 5 лет. Зависимости выраженности экспрессии в поверхностном эпителии от продолжительности заболевания не выявлено. Во всех случаях она была умеренно выраженной или выраженной, слабая экспрессия не наблюдалась ни в одном случае. В группах с различной длительностью заболевания не выявлялось закономерности по интенсивности экспрессии и в эпителии желез.
Из таблицы 32 видно наблюдалась менее чем в 50% эпителиальных клеток желез. В остальных случаях экспрессия обнаруживалась не более чем в 80% клеток. При среднетяжелом обострении высокий процент экспрессирующих клеток обнаруживался уже в 59% случаев, а при тяжелом – в 100% случаев. По интенсивности экспрессии в поверхностном эпителии закономерности выявлено не было, однако у пациентов с тяжелой атакой во всех случаях наблюдалась максимальная экспрессия клеток (от 80 % до 100%). Следует отметить, что интенсивность экспрессии в железистом эпителии нарастала с увеличением тяжести обострения, и при тяжелой атаке во всех случаях была выраженной в 100% случаев. Таблица 33 Результаты экспрессии лектина завязей пшеницы WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину у больных ЯК в зависимости от локализации воспалительного процесса Локализация % экспр-ии Дистальный Левосторонний Тотальный Кол-во больных (n, %) n=12 % n=20 % n=12 % До 50% 2 16 2 10 - 50-80% 6 50 4 20 6 50 80-100% 4 34 14 70 6 Экспрессия WGA в поверхностном эпителии Слабая - - - - - Умеренная 2 17 6 30 10 83 Выражен. 10 83 14 70 2 Экспрессия WG A в железистом эпител ии Слабая 2 17 4 20 - Умеренная 4 33 10 50 10 83 Выражен. 6 50 6 30 2 17
При анализе показателей в зависимости от объема поражения кишки различий по интенсивности экспрессии и количеству экспрессирующих клеток в железистом эпителии не выявлено, однако наблюдалось уменьшение интенсивности экспрессии в поверхностном эпителии при распространении воспалительного, что при легком обострении заболевания у 67% больных экспрессия процесса в проксимальные отделы кишки.
Особенности экспрессии лектинов в слизистой оболочке толстой кишки при язвенном колите
В осуществлении запрограммированной гибели клетки важная роль принадлежит белку p53 [Аруин Л.И., 2000; Белушкина Н.Н., Северин С.Е., 2001; Nelson W.G., Kastan M.B.,1994]. При повышении активности р53 повреждающими агентами клетки могут переходить в состояние повышенной чувствительности к апоптозу в результате опосредованного влияния этого гена на экспрессию генов Вах и Всl-2 [Аруин Л.И., 1987; Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А., 1998; Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004]. Результаты нашего исследования в отношении этого белка показали, что при увеличении тяжести текущей атаки и эндоскопической активности экспрессия р53 повышается. У практически здоровых людей экспрессии маркера р53 не было выявлено ни в одном случае. Следует отметить, что экспрессия р53 обнаруживалась в 100% случаев при тотальном поражении кишечника (р0,0003 по сравнению с дистальным колитом). Экспрессия данного маркера проявлялась в основном в участках слизистой оболочки с признаками дисплазии эпителия. Этот факт несомненно заслуживает внимания, так как увеличение экспрессии данного белка свидетельствует о риске развития опухолевого процесса. С такой позицией согласен и ряд авторов (Аруин Л.И., 2000; Белушкина Н.Н, Северин С.Е., 2001; F.D. Van Schaik et al., 2012), которые изучали апоптоз при заболеваниях органов пищеварения и на молекулярном уровне. По мнению T.A. Brentnall et al. (1994), мутация гена p53 возникает значительно раньше при ЯК, чем при спорадическом колоректальном раке. Таким образом, обнаружение мутантного гена р53 на фоне тотального колита является дополнительным фактором риска развития дисплазии слизистой оболочки толстой кишки при ЯК.
Одним из маркеров КРР длительное время считался раковый эмбриональный антиген, однако со временем пришли к выводу, что повышение концентрации РЭА может наблюдаться при неопухолевых заболеваниях, под влиянием некоторых экзогенных и эндогенных факторов [Скворцов С.В. и др., 1997; Скворцов С.В., Храмченко И.М., Кушлинский Н.Е., 1999].
Результаты нашей работы показали, что 100% экспрессия данного маркера в поверхностном эпителии наблюдалась у пациентов с язвенным колитом с длительностью заболевания более 5 лет, при тяжелой атаке, тотальном колите и III степени эндоскопической активности, однако и в группе сравнения она составляла 46,6% и была слабой интенсивности. Экспрессию РЭА у здоровых людей можно объяснить тем, что многие антитела к РЭА могут связываться и с неспецифическим антигеном (NCA – normal cross-reacting antigen), который присутствует не только в опухолевых клетках, но и в клетках нормального эпителия [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004]. Несмотря на различия экспрессии этого белка в группах больных ЯК, применять этот маркер для определения риска малигнизации, по-видимому, не представляется возможным.
Одной из задач нашего исследования было определить у пациентов ЯК специфичность связывания лектинов завязей пшеницы WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину, бобовника анагиралистного LAL-тропного к -L-фукозе (– LFuc), арахиса PNA-тропного к дисахариду Gal1-3GalNAc с эпителиальными клетками толстой кишки и обосновать возможность их применения для диагностики тяжести атаки.
В результате анализа были получены следующие результаты. У практически здоровых людей ни в одном случае не отмечалось экспрессии изучаемых лектинов. У пациентов с ЯК экспрессия лектина арахиса и бобовника анагиралистного отсутствовала, однако имелись различия в экспрессии лектина завязей пшеницы WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину. Этот гликопротеин с высокой степенью ветвления обладает высокими цитопротективными свойствами. Нами выявлено, что при увеличении тяжести атаки количество случаев с максимальной экспрессией и интенсивность экспрессии этого лектина увеличивались.
Анализ показал, что наиболее выраженную интенсивность экспрессии и наибольшее количество экспрессирующих WGA клеток наблюдается при III степени активности как в поверхностном, так и железистом эпителии. При анализе экспрессии лектина завязей пшеницы в зависимости от площади поражения кишки и длительности заболевания различий по интенсивности экспрессии и количеству экспрессирующих клеток в эпителии не выявлено. Таким образом, в сложных случаях для диагностики тяжести атаки ЯК возможно исследование биопсии с применением лектина завязей пшеницы. Максимальная экспрессия клеток при легкой атаке ЯК отсутствовала, при среднетяжелой и тяжелой атаках экспрессия наблюдалась в 59% и 100% случаев соответственно.
На основании жалоб и лабораторных показателей с использованием дискриминантного анализа было составлено аналитическое выражение, позволяющее дифференцировать пациентов с язвенным колитом по тяжести обострения с достоверностью 90,3%. Для удобства практического применения разработана компьютерная программа, позволяющая в течение короткого времени определить тяжесть атаки.
При выборе тактики лечения язвенного колита необходимо учитывать клиническую классификацию, которая основывается на выраженности симптомов, лабораторных показателей, а также эндоскопическую оценку активности воспаления. Однако в некоторых случаях провести колоноскопию не представляется возможным в силу ряда причин. В связи с этим нами был разработан косвенный метод оценки активности ЯК, основанный на комплексном анализе клинико-лабораторных показателей с использованием дискриминантного анализа, в результате которого получено выражение, позволяющее разграничить пациентов по степени эндоскопической активности с достоверностью 87,9%. Для облегчения определения активности с использованием данного способа также разработана компьютерная программа.