Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Хронический гепатит С. Эпидемиология. Роль внепеченочных проявлений 11
1.2. Криоглобулинемия и криоглобулинемический васкулит при хроническом гепатите С 12
1.2.1. Криоглобулины. История открытия 12
1.2.2. Эпидемиология криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита 15
1.2.3. Патогенез криопреципитации и эндотелиального повреждения 18
1.2.4. Клинические проявления 21
1.3. Современный подход к генетическим исследованиям в медицине 23
1.3.1. Связь генетических вариаций с наблюдаемым фенотипом 23
1.3.2. Архитектура генетических исследований 24
1.3.3. Оценка генетического риска в клинической практике 25
1.4. Генетические аспекты патогенеза криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита при хроническом гепатите С 26
1.5. Влияние криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита на прогноз хронического гепатита С 35
1.6. Терапия криоглобулинемического васкулита, ассоциированного с хроническим гепатитом С 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Группы исследованных больных 39
2.2. Методы обследования больных 42
2.3. Методы исследования генотипов 42
2.4. Выделение геномной ДНК 44
2.5. Методы статистического анализа 49
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 53
3.1. Клинико-лабораторная характеристика пациентов 53
3.1.1. Результаты терапии хронического гепатита С препаратами прямого противовирусного действия у больных криоглобулинемией 58
3.2. Анализ носительства вариантных аллелей исследованных генов у больных с развитием криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита 65
3.2.1 Выбор ДНК-полиморфизмов для анализа 65
3.2.2. Анализ взаимосвязи вариантных аллелей исследованных генов с развитием криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита 67
3.2.3. Модель прогноза генетических рисков возникновения криоглобулинемического васкулита и бессимптомной криоглобулинемии 73
3.3. Выявление факторов риска развития криоглобулинемического васкулита у обследованных больных 78
Практические рекомендации 90
Список литературы 91
- Генетические аспекты патогенеза криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита при хроническом гепатите С
- Выделение геномной ДНК
- Результаты терапии хронического гепатита С препаратами прямого противовирусного действия у больных криоглобулинемией
- Выявление факторов риска развития криоглобулинемического васкулита у обследованных больных
Введение к работе
Актуальность работы
Криоглобулинемия (КГ) выявляется у 25-50% больных хроническим
гепатитом С (ХГС), у части из них (около 10-15%) развивается
криоглобулинемический васкулит (КВ), варьирующий в своих проявлениях от спорадических петехиальных высыпаний до жизнеугрожающих состояний (F. Dammacco et al., 2016).
Несмотря на успехи современной противовирусной терапии (ПВТ), в последнее время в литературе сообщается о сохранении КГ после достижения авиремии на фоне лечения препаратами прямого противовирусного действия (Sollima S. et al., 2016; Cornella S. et al., 2016). Таким образом, элиминация вируса не гарантирует отсутствие рецидива КВ.
Причины формирования КГ и КВ только у части больных ХГС остаются
неизученными. Принимая во внимание значительную географическую
вариабельность распространения КГ, выделен особый вклад генетических факторов в развитие КГ и КВ (Gragnani L. et al., 2013). Учитывая, что в основе данных заболеваний лежит иммуновоспалительная реакция, большую актуальность имеют работы по изучению генетических особенностей иммунной системы.
Согласно последним результатам зарубежных исследований (Zignego et al.,
2014), полногеномный поиск ассоциаций выявил однонуклеотидные полиморфизмы
в регионе HLA 6й хромосомы, ассоциированные с КВ. Каждая дополнительная
копия аллеля G в позиции rs9461776 и аллеля А (rs2071286) увеличивала риск
развития КВ в 2,16 и 2,15 раз, соответственно. В данном исследовании не изучались
генотипы пациентов с бессимптомной КГ. Также исследование было выполнено с
участием пациентов, проживающих на территории с наибольшей
распространенностью КГ.
В настоящее время нет исследований, посвященных генетическим аспектам HCV-ассоциированных КВ и КГ с привлечением пациентов из Российской Федерации. В связи с этим, актуальным является изучение генетических рисков
развития КГ и КВ, что позволит персонифицировать подход к тактике ведения пациентов с ХГС.
Цель исследования
Исследовать связь генетических полиморфизмов в ДНК-локусе HLA с развитием HCV – ассоциированных криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита.
Задачи исследования
1. Изучить ассоциации генетических полиморфизмов с развитием HCV-
ассоциированных криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита путем
генотипирования полиморфизмов rs2071286 и rs9461776.
2. Сравнить частоту риск-ассоциированных аллелей в группах бессимптомной
криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита.
3. Построить прогностическую модель генетического риска манифестации
криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита.
4. Оценить сочетанное влияние генотипов исследуемых полиморфизмов и клинико-
демографических показателей на развитие и особенности течения
криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита.
Научная новизна
Впервые показана ассоциация генетических полиморфизмов с развитием HCV-ассоциированных криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита у пациентов российской популяции.
Установлена сходная величина генетического риска развития
криоглобулинемического васкулита у пациентов с бессимптомной
криоглобулинемией и пациентов с криоглобулинемическим васкулитом.
Проанализированы результаты терапии пациентов с HCV-ассоциированной криоглобулинемией новыми препаратами прямого противовирусного действия. Установлены факторы риска персистенции криоглобулинемии после достижения авиремии.
Предложена генетическая модель риска манифестации криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита, а также прогнозирования иммунологических исходов терапии препаратами прямого противовирусного действия.
Практическая значимость
Определены полиморфизмы, ассоциированные с развитием криоглобулинемии
и криоглобулинемического васкулита, а также построена прогностическая модель
развития данных заболеваний. Определены факторы, негативно влияющие на
элиминацию криоглобулинов после достижения авиремии. Полученные результаты позволяют персонифицировать диагностику, критерии прогноза и выбор терапии у пациентов с HCV-ассоциированной криоглобулинемией и криоглобулинемическим васкулитом.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Полиморфизмы rs2071286 и rs9461776 в локусе HLA ассоциированы с криоглобулинемическим васкулитом и криоглобулинемией.
-
Построенная модель генетического риска позволяет прогнозировать риски развития криоглобулинемического васкулита и бессимптомной криоглобулинемии у пациентов с хроническим гепатитом С.
-
При лечении препаратами прямого противовирусного действия, факторами, способствующими персистенции криоглобулинемии, являются высокий уровень ревматоидного фактора, а также сочетание длительности инфицирования и высокого генетического риска.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы состоялась 16 июня 2017г. на совместном заседании кафедры внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.
Результаты работы представлены на зарубежной конференции Американского научного общества генетики человека (American Society of Human Genetics), в г. Орландо, США, 2017г.
Личный вклад автора
Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования от постановки задач до их теоретической и практической реализации, обсуждения результатов в научных публикациях и их внедрения в практику.
Внедрение в практику
Результаты исследования используются в работе гепатологического,
нефрологического и ревматологического отделений Университетской клинической
больницы № 3 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова; внедрены в практику
преподавания курса внутренних болезней студентам Факультета фундаментальной
медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и Первого МГМУ
им. И.М. Сеченова.
Выражаю глубокую благодарность за повседневную помощь в работе над диссертацией научному руководителю академику РАН, д.м.н., профессору Н.А. Мухину. Признательна за помощь в работе и ценные консультации д.м.н., профессору кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Д.Т. Абдурахманову, к.м.н., доценту кафедры внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова Т.Н. Красновой, а также всему коллективу Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 2 печатные работы, все - в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии, а также 1 тезисы на международной конференции.
Объем и структура диссертации
Генетические аспекты патогенеза криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулита при хроническом гепатите С
В настоящее время доказана роль HCV-инфекции как основного этиологического фактора развития КГ и КВ. КГ выявляется более чем у половины больных HCV-инфекцией, однако, лишь у части из них (15-25%) развивается КВ – системный васкулит, обусловленный образованием иммунных депозитов, поражающий сосуды мелкого (реже среднего) калибра. Причины формирования КГ только у части пациентов с ХГС и патогенез КВ остаются не до конца изученными, однако, накопленные данные позволяют выделить особый вклад генетических факторов организма в развитие болезни.
Если темпы прогрессирования HCV-инфекции зависят как от факторов хозяина, так и от факторов вируса, то р азвитие КГ и КВ, по всей вероятности, зависит только от факторов хозяина. Так, работы, выполненные вскоре после открытия HCV-инфекции, сфокусировались на поиске взаимосвязи между факторами вируса (таких, как генотип и уровень виремии) и развитием КГ. Однако, многочисленные исследования не выявили различий между уровнем виремии и генотипами вируса у больных с КГ и без нее [72-74]. Следующие попытки оценить вклад самого вируса в развитие КГ были направлены на поиск мутаций в гипервариабельном участке (HVR1) вируса – белке Е2, взаимодействие которого с CD-81 рецептором на поверхности В -лимфоцитов, приводит к стимуляции образования B-клеточного клона. Gerotto M. и соавт. обнаружили инсерционную мутацию в 385 кодоне HVR1, ответственную, по мнению исследователей, за способность белка Е 2 к дополнительной стимуляции В -лимфоцитов [75]. Однако, дальнейшие исследования показали, что любая мутация в HVR1 вируса гепатита С может быть ассоциирована с наличием КГ, и, наконец, несколько последующих исследований установили, что специфические изменения в белке Е2 вируса не являются причиной патологической В -клеточной пролиферации [76, 77].
Следующий шаг в поиске причин продукции криоглобулинов и доказательств независимости этого явления от факторов вируса сделали исследователи во главе с Pozatto G. Учитывая данные наблюдений о географической неоднородности выявления КГ, с преобладанием последней в странах Средиземноморья, исследователи сравнили частоту встречаемости В -клеточной моноклональности при ХГС у жителей Италии и Японии. В начале эпидемиологического исследования предполагалось, что низкая частота выявления КГ у этнических японцев может быть связана с особенностью их диеты - так называемой, низкоантигенной диетой, способной снизить уровень сывороточных криоглобулинов [78]. В ходе исследования показано, что ни один из обследованных пациентов с ХГС из Японии не имел признаков В-клеточной моноклональности, а также между обследованными группами из двух стран не было различий по полу , возрасту, длительности и тяжести заболевания, и генотипу вируса. Таким о бразом, авторы сделали вывод, что низкая встречаемость смешанной КГ у этнических японцев связана с генетическими особенностями, а вирус гепатита С способен провоцировать В-клеточную моноклональность в присутствии некоторых, пока не идентифицированных, особенностей организма человека [79]. В результате сформировалось приоритетное направление поиска генетически детерминированных факторов хозяина в развитии КГ.
Исследования в этом направлении, прежде всего, сосредоточились на изучении системы генов тканевой совместимости человека (англ. HLA, human leukocyte antigens). Главная функция системы HLA – представление клеткам иммунной системы как чужеродных, так и собственных антигенов для запуска иммунного ответа. В связи с этим, сформировалось предположение, что некоторые варианты молекул данной системы, вовлеченные в борьбу с вирусом, одновременно провоцируют продукцию аутореактивных антител иммунной системой [7]. Первые шаги в изучении данного вопроса были сделаны еще в 1981г Migliorini P. и соавт, описавшими группу из 36 пациентов с эссенциальной КГ. Диагноз был поставлен на основании наличия у пациентов триады Мельцера и КГ, при исключении известных инфекционных, неопластических и системных заболеваний. Авторы не нашли различий между вариантами генов системы HLA I и II класса у пациентов с КГ и без нее, однако это исследование было выполнено еще до открытия вируса гепатита С и полиморфизма комплекса генов HLA [80]. Спустя 17 лет, в 1998г, Lenzi M. и соавт. провели исследование HLA системы, включившее пациентов с HCV-ассоциированной криоглобулинемией той же географической зоны и с аналогичными исследованию Magliorini P. критериями включения. В результате, о бнаружена сильная ассоциация КГ с вариантами аллелей класса I HLA-В8 (ОШ 3,1) и класса II HLA-DR3 (ОШ 1,3), при этом пациенты с гаплотипом В8-DR3 имели в 8,2 раз выше риск развития КГ [81]. Противоречивость выводов авторы объясняют отсутствием данных о статусе вирусного гепатита С у пациентов в работе Magliorini P. Данные Lenzi M. частично подтвердились в работе Hwang S.-J. и соавт, в которой при исследовании пациентов китайской популяции также была обнаружена ассоциация КГ (преимущественно, бессимптомной) с аллельным вариантом HLA-DR3[82]. Между тем, в исследовании Nagasaka A. и соавт, ни один из 71 больных с HCV-ассоциированной КГ не имел аллельных вариантов HLA-B8 и HLA-DR3. Пациенты принадлежали к японской этнической группе, и отсутствие указанных вариантов системы HLA авторы объяснили в целом низкой встречаемостью этих аллелей у жителей Японии. Примечательны также данные клинико-лабораторной характеристики пациентов: из 167 пациентов с ХГС, обратившихся в клинику, у 71 (42,5%) выявлена КГ, однако, только у одного пациента диагностирован КВ, также большинство пациентов являлись носителями III типа КГ [83]. Дальнейшие исследования сконцентрировались на изучении аллелей II класса системы HLA. Многими исследователями была найдена интересная закономерность: аллельный вариант DRB1 11 ассоциирован с развитием КГ у пациентов с ХГС[84-86], вместе с тем, он также является протективным в отношении развития цирроза печени, связан со спонтанной элиминацией вируса и стойким вирусологическим ответом на терапию ИФН [87-89]. Каким образом могут быть согласованы эти два наблюдения? Авторы предполагают, что ген DRB1 11 может играть значительную роль в предоставлении Т-хелперам оптимальной конфигурации антигена вируса, что облегчает элиминацию вируса, однако, в рамках задачи предотвратить хронизацию HCV-инфекции, он одновременно провоцирует избыточную продукцию иммуноглобулинов с активностью РФ [84]. Полученные данные позволили сформировать гипотезу о роли определенных вариантов аллелей HLA в иммунологических нарушениях ХГС. Другая сторона анализа генетических факторов патогенеза КГ представлена изучением В -лимфоцитов (как главных продуцентов криоглобулинов ) и их факторов регуляции. Значительный интерес представляют работы по изучению BAFF, необходимого для регуляции развития, созревания и продукции иммуноглобулинов В-лимфоцитами. BAFF относится к суперсемейству ФНО и секретируется преимущественно клетками миелоидного ряда (макрофагами, моноцитами, дендритными клетками) [90]. В экспериментальной модели на животных показано, что избыточная экспрессия BAFF приводит к В -клеточной гиперплазии, лимфопролиферации, гипергаммаглобулинемии, протеинурии, васкулиту и волчаночно-подобным реакциям [91]. Показано, что сывороточная концентрация BAFF повышена у пациентов с системной красной волчанкой, ревматоидным артритом, синдромом Шегрена, при КГ, аутоиммунном гепатите, первичном билиарном циррозе, а также при ХГС и других инфекциях. Также известно, что н аличие высокого уровня BAFF в остром периоде гепатита С является независимым предиктором хронизации инфекции [92], а у пациентов с имеющимся циррозом печени концентрация указанного фактора достоверно выше, чем у пациентов без цирроза. Как показало исследование Toubi E. и соавт, высокий уровень BAFF у больных ХГС был ассоциирован с артралгиями и/или васкулитом, а также наличием КГ и антител к кардиолипину, что является отражением хронической неспецифической В -клеточной пролиферации и антигенной стимуляции [93]. Эти данные были подтверждены в исследовании Sene D.и соавт, показавшими значительную роль BAFF в возникновении и поддержании В-клеточной клональности [94]. Возможным объяснением подобных изменений, по мнению авторов, может являться следующее: персистирующая вирусная инфекция провоцирует клеточный апоптоз с высвобождением множества ядерных антигенов, включая белки теплового шока, а также экспрессию толл -подобных рецепторов 4 типа[95]. Следуя подобной гиперактивации, дендритные клетки увеличивают продукцию провоспалительных цитокинов, включая BAFF, который негативно влияет на толерантность B-клеток, стимулируя образование аутоантител. В результате, представлялось необходимым исследовать генетические особенности , позволяющие BAFF поддерживать клональность В -клеток. В 2006г Novak AJ и соавт. проанализировали генетические полиморфизмы промотора BAFF у пациентов с хронической B-клеточной лимфоцитарной лейкемией. В результате исследования показано, что высокий уровень экспрессии BAFF достоверно коррелировал с присутствием аллели T в позиции -871, также более высокая концентрация BAFF зафиксирована у пациентов с наследственной В -клеточной лимфоцитарной лейкемией, по сравнению со спорадической формой [96]. Полиморфизм -871C/T обнаружен в промоторе BAFF, при этом генотип -871T был ассоциирован с высоким уровнем мРНК в моноцитах. Последующие исследования подтвердили ассоциацию КГ и высокого уровня BAFF с присутствием T аллели, особенно в гомозиготном состоянии [97-99].
Выделение геномной ДНК
Получение высококачественных образцов ДНК является ключевым шагом в процессе идентификации генотипов. Во многих исследованиях предпочтение отдается выделению материала из крови, несмотря на инвазивность и дороговизну процедуры. ДНК, полученная из образца крови, преимущественно используется для создания иммортализованых клеточных линий , как бесконечного источника ДНК. Также возможно выделение индуцированных стволовых клеток для функциональных исследований. В то же время, в связи с более активной фрагментацией ДНК, кровь имеет намного меньшее время хранения, чем слюна. Выделение ДНК из слюны является неинвазивным и намного более дешевым способом получения материала для исследований. Этот способ значительно недооценен из -за устойчивого мнения о малом количестве доступного ДНК-материала. Однако, многочисленные исследования показывают, что при среднем содержании в 4,3х105 клеток/мл, слюна является достаточным источником биоматериала для геномных тестов. Выделение ДНК включает в себя несколько шагов: 1) выделение и хранение, 2) лизис клеток, 3) обработка РНКазой, 4) осаждение белков, 5) осаждение с помощью этанола, 6) регидратация ДНК. Выделение ДНК проводилось в соответствие с протоколом:
1) Выделение и хранение.
1) Перед забором слюны, пациенты воздерживались от приема пищи и питья в течение 30 минут.
2) В пробирку для центрифугирования объемом 15 мл, содержащую 2,5 мл стабилизирующего буферного раствора (на 250 мл буферного раствора: 1 М NaCl – 1,461 г, Tris HCl – 2,5 мл, 0,5 М ЭДТА – 5 мл, 10% SDS – 12,5 мл, раствор Протеиназы К (20 мг/мл) – 2,5 мл, ddH2O – 227,5 мл), собирали 2,5 мл слюны.
3) Пробирка закрывалась новой крышкой и перемешивалась до гомогенизации содержимого. Образцы, слюны могут храниться до трех месяцев при комнатной температуре, образцы для более длительного хранения помещались в холодильную камеру с температурой 4С.
2) Начальные приготовления и лизис клеток.
1) Перед началом процедуры выделения, готовилась водяная баня (37С), емкость со льдом, три конических пробирки (15 мл) для центрифугирования. Три пробирки были необходимы для помещения клеточных и белковых гранул, конечной выделенной гДНК и изопропаноловых и этаноловых супернатантных жидкостей.
2) Образцы слюны несколько раз перемешивались, затем центрифугировались на средней скорости в течение 15 сек. 3) 2,5 мл образца переносились в чистую 15 мл пробирку для центрифугирования, добавлялось 5 мл лизатного буферного раствора и перемешивалось 50 раз. Затем, смесь инкубировалась 30 минут при комнатной температуре.
3) Удаление РНК.
1) Добавлялось 40 мкл раствора РНКазы А (100 мг/мл) и инкубировалось 15 мин при 37С на водяной бане.
2) Затем, образец перемещался на лед и охлаждался в течение 3 минут.
4) Удаление белков и липидов.
1) К полученному раствору добавлялось 50 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл), раствор несколько раз перемешивался и инкубировался минимум 30 минут при комнатной температуре.
2) Добавлялось 1,7 мл белок-осаждающего раствора, полученный раствор центрифугировался на высокой скорости 20 секунд и помещался на лед на 10 минут.
3) После охлаждения, образец центрифугировался 10 минут на 3000 оборотах, при температуре 4С. Осаждающиеся белки должны сформировать плотные гранулы для продолжения протокола.
5) Выделение и очистка гДНК.
1) В чистую пробирку для центрифугирования (15 мл) пипетировали 5 мл изопропанола и 8 мкл чистого раствора гликогена (20 мг/мл).
2) Супернатантную жидкость из шага 4.3 переносили в пробирку, содержащую изопропанол и раствор гликогена. После внесения супернатантной жидкости, раствор аккуратно перемешивался 50 раз и затем центрифугировался 30 минут при 3000 оборотах и 4С. 3) Полученная супернатантная жидкость переносилась в чистую 15 мл пробирку. После удаления супернатантной жидкости, к оставшимся гранулам добавляли 1 мл 70% раствора этанола для промывки гранул осадка.
4) После первичной промывки, образец центрифугировался 1 минуту при 2000 оборотах и 20С.
5) Затем, этанол аккуратно удалялся и повторялись шаги 5.3, 5.4.
6) После удаления супернатантной жидкости вторичной промывки, гранулам давали высохнуть на воздухе в течение 15 мин.
6) Регидратация гДНК.
1) После просушки образца добавлялось 300 мкл трис-ЭДТА для регидратации гранул гДНК.
2) Раствор перемешивался в течение 5 секунд и помещался в водяную баню (65С) на 1 час.
3) Затем образцы инкубировались при комнатной температуре.
Выделение гДНК из образцов крови проводилось в соответствии с протоколом:
1) Лимфоциты выделялись из крови при помощи лизиса эритроцитов с использованием гипотонического буферного раствора (бикарбонат аммония + хлорид аммония), который оказывает минимальный лизирующий эффект на лимфоциты. Три объема лизирующего буферного раствора добавлялись к образцу крови, тщательно перемешивались в течение 5 минут, затем центрифугировались 10 минут при 20 g. Супернатантная жидкость удалялась почти полностью, оставляя около 1 мл, чтобы предотвратить потерю клеток. 2) К осадку повторно добавлялось 3 объема лизирующего буферного раствора и повторялись шаги перемешивания и центрифугирования 2-3 раза до получения прозрачной супернатантной жидкости и белого осадка . После последней промывки, супернатант удалялся полностью.
3) Осадок суспензировался в 500 мкл PBS, с последующим добавлением 400 мкл лизирующего буферного раствора (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 10% SDS, pH 7.5) и 10 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Раствор перемешивался до полного растворения осадка и , затем, инкубировался на водяной бане (56С) в течение двух часов.
4) Равный объем фенола (стабилизированного Tris, pH 8), добавлялся к раствору и перемешивался в течение 1 минуты. Затем раствор центрифугировался 10 минут при 10000 g и температуре 4С.
5) Верхний водный слой переносился в новую пробирку , содержащую равные объемы фенола и смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). Раствор перемешивался 1 минуту и центрифугировался 10 минут при 10000 g и 4С. Супернатант затем переносился в новую пробирку с добавлением 10 мкл (10 мг/мл) раствора РНКазы А.
6) Образец инкубировался при 37С в течение 30 минут, затем добавлялся равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), перемешивался в течение 1 минуты и центрифугировался 10 минут при 10000 g и 4С.
7) Супернатант переносился в новую пробирку с добавлением двукратного объема абсолютированого этанола. Образец перемешивался несколько раз и охлаждался при -20С. Затем образец центрифугировали 20 минут при 10000 g и 4С.
8) Супернатант удалялся, к осадку добавлялось 250 мкл 70% этанола. Осадок осторожно уплотнялся и раствор центрифугировался 10 минут при 10000 g. Затем, супернатант аккуратно декантировался с осадка.
Результаты терапии хронического гепатита С препаратами прямого противовирусного действия у больных криоглобулинемией
Появление новых препаратов прямого противовирусного действия значительно увеличило эффективность лечения ХГС. Однако высокая стоимость терапии ограничивает их широкое применение во многих странах, в том числе в России, и диктует необходимость выделять приоритетные группы пациентов. Современные рекомендации Американской и Европейской ассоциаций по изучению болезней печени подчеркивают первоочередность терапии пациентов с КВ ввиду высокого риска развития В -НХЛ и жизнеугрожающих осложнений [131]. Вместе с тем, на сегодняшний день в литературе представлено недостаточное количество работ по изучению эффективности и безопасности терапии препаратами ППД пациентов с КГ и КВ.
В данном проспективном исследовании мы анализировали результаты терапии 16 больных с HCV-ассоциированной КГ препаратами прямого противовирусного действия. Вирусологический ответ, клиническая эффективность и безопасность оценивались во время терапии, и в течение как минимум 16 недель после завершения лечения.
Пациенты получали лечение ППД (табл. 8), в зависимости от генотипа вируса, тяжести поражения печени, и ответа на предыдущую ПВТ. Суточная доза софосбувира составила 400 мг, даклатасвира – 60 мг, асунапревира – 200 мг, рибавирина 1000-1200 мг.
Среди 16 пациентов с КГ преобладали женщины (93,7%), средний возраст составил 58,7 лет (интервал 45-70). У 9 пациентов наблюдался КВ, среди них у одной пациентки до начала лечения была диагностирована В -НХЛ из клеток маргинальной зоны. У 7 пациентов отмечалась БСКГ. Основные демографические и вирусологические параметры отражены в таблице 9.
Вирусологический ответ на предыдущую ИФН-терапию ХГСОтсутствие ответаВирусологический прорывРецидив 1 13 2 2
У всех пациентов была достигнута авиремия к 4й неделе терапии была достигнута авиремия, которая сохранялась на всем протяжении лечения и наблюдения. Таким образом, устойчивый вирусологический ответ составил 100%.
Тяжелых нежелательных явлений за время терапии не отмечено, у части пациентов наблюдалась тошнота (6 пациентов), рвота (1), слабость и головокружение (2), фарингит (1).
При анализе клинического ответа в группе КВ ответ считался полным при снижении баллов по шкале BVAS до 0, частичный - при снижении баллов менее чем на 50%. Средний балл по шкале BVAS к 24й неделе терапии снизился с 10,2±7,9 до 3,4±4,3 баллов. У троих пациентов полностью регрессировала кожная пурпура, артралгии, купирован мочевой синдром (полный ответ). У четверых пациентов сохранялись артралгия, общая слабость и небольшое повышение активности РФ (частичный ответ). У пациентки с В -НХЛ по результатам повторного иммунохимического исследования белков сыворотки крови и мочи отмечена тенденция к снижению секреции парапротеина Mk с 9,5 г/л до 7,1 г/л, снизился криокрит, повысился уровень поликлональных иммуноглобулинов; начата поддерживающая терапия ритуксимабом.
В результате терапии ППД у еще одной пациентки (клиническое наблюдение № 1) отмечена частичная клиническая ремиссия, однако, КВ рецидивировал несмотря на стойкую авиремию, в связи с чем заподозрена лимфома, подтвердившаяся в результате обследования.
Клиническое наблюдение № 2 Женщина, 56 лет, антитела к HCV впервые выявлены в 1995г. Среди факторов риска инфицирования ХГС – гемотрансфузии. Предполагаемая длительность ХГС около 40 лет. В 2009 г проводилось лечение HCV-инфекции пегилированным интерфероном и рибавирином в течение года, без достижения вирусологического ответа. Дебют заболевания в 2011г с появлением пурпуры на гоже голеней, отеков ног, артралгий мелких суставов, лихорадки до 39,5С. Проводилась терапия преднизолоном 5 мг/сут с положительным эффектом в отношении указанных симптомов. В 2013г - ухудшение состояния на фоне отмены преднизолона: пурпура рецидивировала с формированием язвенно-некротических изменений на коже голеней. Обследована в Клинике им. Е.М. Тареева, где был поставлен диагноз: «Цирроз печени (класс А по Чайлд-Пью), в исходе хронического гепатита С (виремия 1,9х105, генотип 1в), высокой степени активности, с системными проявлениями: криоглобулинемический васкулит с поражением кожи (сосудистая пурпура с язвенно-некротическими элементами), суставов (артралгии), почек (латентный IgA-нефрит с сохранной функцией почек), периферической нервной системы (сенсомоторная полиневропатия), легких (интерстициальный фиброз легких), лихорадочным синдромом, иммунной тромбоцитопенией». В связи с высокой активностью криоглобулинемического васкулита проведен курс терапии ритуксимабом (суммарная доза 2000 мг) с положительной динамикой в отношении кожных проявлений васкулита. Однако, в последующие два года отмечено прогрессиро вание цирроза печени , в связи с чем, а также принимая во внимание наличие моноклональной секреции IgA, начата терапия HCV-инфекции препаратами прямого противовирусного действия по схеме даклатасвир 60 мг/сут + софосбувир 400 мг/сут + рибавирин 800 мг/сут в течение 24 недель . Несмотря на достижение устойчивого вирусологического ответа, через два месяца после окончания терапии сохранялся высокий криокрит и вновь отмечен рецидив кожной пурпуры с формированием язвенно-некротических изменений, в связи с чем заподозрено злокачественное лимфопролиферативное заболевание. По результатам обследования, в том числе биопсии костного мозга и лимфоузла, поставлен диагноз «В-клеточная лимфома из маргинальных клеток, ассоциированная с HCV-инфекцией, с вовлечением селезенки, костного мозга и моноклональной секрецией Mk (9,5 г,л) и белка Бенс-Джонса каппа».
Таким образом, следует особенно подчеркнуть необходимость длительного наблюдения за больными с КГ несмотря на достижение авиремии (в частности, выполнение динамического иммунохимического исследования белков сыворотки крови), в связи с высоким риском развития злокачественных лимфопролиферативных заболеваний.
Также сохранение симптомов на фоне достижения УВО может быть связано с необратимыми процессами повреждения органов и систем, возникшими в процессе заболевания КВ, что можно продемонстрировать на примере следующей больной.
Клиническое наблюдение № 3
Женщина, 50 лет. Среди факторов риска инфицирования – гемотрансфузии в 1990х годах . Длительное время наблюдалась в клинике им. Е.М. Тареева с диагнозом: «Цирроз печени в исходе хронического гепатита С (генотип 1в) с внепеченочными проявлениями: криоглобулинемический васкулит с поражением кожи (сосудистая пурпура ), суставов (артралгии), периферической нервной системы (сенсорная полиневропатия); моноклональная секреция Mk. Около двух раз в год отмечала рецидивы геморрагической пурпуры, сопровождающиеся выраженными болями в суставах, слабостью и болью в мышцах ног . В 2016г начата терапия асунапревиром, даклатасвиром и рибавирином в течение 24 недель. Терапию перенесла удовлетворительно, отмечала сохраняющуюся слабость и боль в ногах. После завершения ПВТ отметила появление геморрагической пурпуры на голенях, которая регрессировала самостоятельно.
По данным иммунохимического исследования сыворотки крови , выполненного через два месяца после завершения ПВТ, отмечено отсутствие криоглобулинемии, исчезновение секреции клонов Mk. Однако, продолжали беспокоить и нарастали боли в ногах, ограничивающие передвижения больной . По результатам обследования исключена патология суставов, мышц и вен нижних конечностей. Согласно полученным результатам ЭНМГ выявлена отрицательная динамика в виде выявления грубых аксональных поражений сенсорных и моторных волокон нижних конечностей, что расценивалось как тяжелое осложнение криоглобулинемического васкулита. Последующая терапия в течение нескольких месяцев совместно с невропатологом не привела к значимому улучшению состояния больной.
Выявление факторов риска развития криоглобулинемического васкулита у обследованных больных
Согласно нашим данным, пациенты с КВ и БСКГ имеют сходный генетический риск развития КВ. Однако, причины, по которым у некоторых пациентов наличие КГ не сопровождается клиническими проявлениями, остаются не изученными.
Мы провели многофакторный сравнительный анализ клинико-лабораторных характеристик пациентов с КВ и БСКГ. Анализ проводился методом ступенчатой многофакторной линейной регрессии.
Построение статистической модели в анализе клинических данных может иметь несколько способов реализации – включение всех измеренных параметров в модель, либо «ступенчатый» подход . В нашем случае, одновременное включение всех параметров (более 10) в линейную модель может привести к возникновению ложно положительных ассоциаций. Ступенчатый подход подразумевает одновременное тестирование только одного параметра, с целью выбора переменных, вносящих наибольший вклад для построения линейной модели. В данном случае, уравнение регрессии будет иметь вид D=b1 X+b0, где D – диагноз (КВ или КГ), X – тестируемый параметр, bi – коэффициенты регрессии. Результаты регрессионного анализа представлены в таблице 12.
Две группы пациентов сбалансированы по возрасту (р=0,12) и половой принадлежности (р=0,11), имеют сходный генетический риск (р=0,165). При анализе лабораторных параметров, в группе КВ статистически значимо выше уровень РФ (р=0,016). Уровни АЛТ, АСТ, ГГТ, ШФ, СРБ, не имели статистических различий между двумя группами. В дальнейшем, мы применили линейную регрессионную модель для поиска клинических параметров, коррелированных с генетическим риском. Для этого мы использовали в качестве переменной-ответа исследуемые параметры и переопределили модель, как X=b1 GR + b0, где GR – величина генетического риска, Х – переменная-ответ (тестируемые клинические параметры), bi – коэффициенты регрессии. Результаты регрессионного анализа пр едставлены в таблице 13.
Анализ клинических параметров по отношению к генетическому риску обнаружил статистически значимый вклад индекса массы тела (ИМТ). На рисунке 11 представлен регрессионный анализ связи индекса массы тела с величиной генетического риска. Как видно из графика, при увеличении генетического риска, пациенты чаще имеют более высокий ИМТ. Таким образом, можно утверждать, что повышенный индекс массы тела , является клиническим параметром, по которому можно идентифицировать пациентов с повышенным риском возникновения КГ (и/или КВ).
Мы оценили среднюю разницу в ИМТ между пациентами с нулевым и повышенным генетическим риском (рис. 12). Пациенты с повышенным риском в среднем имеют ИМТ на 1.32 единицы выше, чем пациенты с нулевым риском. Интересно, что группы БСКГ и KB имеют сходное распределение ИМТ (р=0,94). Таким образом, ИМТ является предиктором возникновения КГ, однако не является специфичным к бессимптомному течению КГ, либо манифестации КВ.
Еще одним важным параметром сравнения выступило исчезновение или сохранение КГ после лечения ХГС препаратами ППД. Препараты ППД стали применяться в отечественной практике недавно и на сегодняшний день не достаточно данных о лечении пациентов с КГ современными противовирусными средствами. Мы проанализировали 16 пациентов, получивших терапию препаратами ППД. В ходе терапии все пациенты достигли авиремии. Однако, несмотря на полную элиминацию вируса, иммунологический ответ (в виде элиминации криоглобулинов), был достигнут лишь у 7 пациентов. Аналогично с описанным выше подходом, мы построили регрессионную модель для поиска параметров, ассоциированных с исчезновением КГ. В начале, мы сфокусировались на группе пациентов, у которых была достигнута элиминация криоглобулинемии. Исчезновение криоглобулинов наблюдалось между 8 и 52 неделями после начала терапии. Мы применили регрессионную модель вида Т = Pi X + Ро, где Т - время до исчезновения криоглобулинов в неделях, Х -тестируемый клинический параметр, Р; - коэффициенты регрессии (табл. 14).
Полученные результаты показывают, что скорость элиминации КГ определяется длительностью ХГС (р=0,05).
Мы предположили, что особенности иммунного ответа м огут вносить определяющий вклад, д обавив в модель величину генетического риска, однако, наиболее значимой оказалась переменная взаимодействия длительности заболевания гепатитом С и генетического риска (табл. 15).
Для того, чтобы выявить пороговые значения длительности заболевания и генетического риска, мы провели анализ чувствительности к параметрам: для каждого возможного сочетания двух переменных строилась модель выживания Кокса и кривые Каплана-Мейера. Набор параметров, соответствующий наилучшему разделению пациентов по наблюдаемым времени исчезновения криоглобулинов считался удовлетворительным тер апевтическим критерием. Наилучшие результаты показывает сочетание пороговой длительности заболевания гепатитом С в 30 лет и отсутствие генетического риска (нулевой генетический риск). Разделение пациентов при таком выборе параметров представлено на рисунке 13. У пациентов с более длительным течением ХГС и высоким генетическим риском после достижения авиремии КГ сохраняется в среднем на 11 недель дольше.
В недавнем исследовании Е. Reyes- Aviles и соавт. показано, что присутствие высокого РФ у пациентов с ХГС способствует гиперпродукции зрелых В-клеток, а также гипосенсибилизирует их. Также, данный фенотип В-клеток персистирует в течение как минимум 8 недель после эрадикации вируса на фоне лечения препаратами ППД [134].
Мы провели анализ зависимости сохранения КГ от уровня РФ, построив регрессионную модель вида Т = Pi RF + р0, где Т - время до последнего наблюдения криоглобулинов в неделях, RF - уровень ревматоидного фактора. У пациентов с более высоким уровнем РФ отмечалось более длительное сохранение КГ (р=0,018). Пороговое значение уровня РФ выбиралось по аналогии вышеописанным анализом (рис. 14).
Отмечено, что криоглобулинемия сохраняется в среднем на 10 недель дольше у пациентов с более высоким значением РФ.
Данное наблюдение взаимосвязи персистенции криоглобулинов с генетическим риском и длительным антигенным стимулированием клето иммунной системы, еще раз демонстрирует сложные иммунопатологические реакции, лежащие в основе феномена криоглобулинемии.