Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Глава 1. Вязкость крови 8
Глава 2. Эритроцит (общие сведения) 9
Глава 3. «Микрореологические» свойства эритроцитов 11
Глава 4. Гемореологические нарушения при сердечнососудистых заболеваниях и белковых
Глава 5. Патогенез гематурии 16
Глава 6. Системная красная волчанка 21
Глава 7. IgA-гломерулонефрит 37
Заключение 43
Список использованной литературы 80
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изменения реологических свойств крови и процессов агрегации и деформации эритроцитов могут существенно влиять на циркуляцию крови в микрососудах, и, тем самым, способствовать активации и повреждению сосудистого эндотелия, приводя к развитию и прогрессированию ишемии и фиброзу органов. При системной красной волчанке (СКВ) гемореологические нарушения свойственны всем больным [Смыр К.В., 2008; Соколова И.А. и др., 2008; Краснова Т.Н. и др., 2009; Козловская Л.В. и др., 2010; Емануйлова Н.В., 2011; Ernst E. et al., 1991; Rosenson, R.S. et al., 2001; Vaya A. et al., 2008]. Значимые изменения гемореологических показателей отмечены и при хронических гломерулонефритах, особенно протекающих с нефротическим синдром [Смыр К.В., 2008; Козловская Л.В. и др., 2010]. Среди причин увеличения основного гемореологиче-ского параметра — вязкости крови — важное значение придают белковой дискразии (гипо- / дис-протеинемии и гиперфибриногенемии), характерной как для хронического гломерулонефрита с нефротическим синдромом, так и для СКВ [Rosenson R.S. et al., 2001; Vaya A. et al., 2008]. Однако особенности гемореологических изменений при поражении почек у больных СКВ — волча-ночном нефрите — не изучены.
Наряду с протеинурией и гипо- / диспротеинемией важное значение как маркеру активности вол-чаночного нефрита придаётся гематурии [Тареева И.Е., 2000; Moreno, J.A. et al., 2012; Moreno J.A., et al., 2013]. Известные в настоящее время механизмы развития гематурии связывают, в основном, с нарушением локально-почечных процессов; при этом не учитывается возможное изменение свойств самих эритроцитов, характерное не только для волчаночного нефрита, но и для других форм хронического гломерулонефрита, протекающих с гематурией, особенно для IgA-нефрита [Lai K.N., 2012; Moreno J.A. et al., 2012; Novak J. et al., 2012]. На стадии активности СКВ эритроциты вовлекаются в иммуновоспалительные реакции за счёт осаждения на их мембранах компонентов комплемента, антител к кардиолипинам и иммуноглобулинов разных классов, что клинически может проявляться, в частности, анемией
[Giannouli, S. et al.,2006]. О влиянии циркулирующих в потоке эритроцитов с изменёнными свойствами на выраженность гематурии данных нет.
Гемореологические нарушения обладают прогностической значимостью при таких заболеваниях как сахарный диабет, тяжёлые термические травмы и др. [Кузник Б.И., 2010; Булаева С.В., За-
мышляева А.В., 2012; Лыченко СВ., 2012; Marossy A. et. al, 2009]. Данные о предикторном значении гемореологических параметров на течение СКВ, в том числе и с поражением почек (волча-ночном нефрите), отсутствуют.
Цель исследования
Определить диагностическую значимость и предикторное значение гемореологических нарушений у больных системной красной волчанкой (СКВ) с поражением почек (волчаночным нефритом — ВН).
Задачи исследования
-
Охарактеризовать гемореологические изменения в зависимости от степени активности системной красной волчанки.
-
Исследовать степень нарушения деформационных свойств эритроцитов и их агрегации у больных с поражением почек в зависимости от активности волчаночного нефрита.
-
Определить взаимосвязь между изменением гемореологических параметров и выраженностью гематурии.
-
На основании сравнения гемореологических свойств у больных активными формами волчаночного нефрита и IgA-нефритом определить диагностическую значимость гематурии для оценки активности волчаночного нефрита.
-
Определить предикторное значение гемореологических показателей.
Научная новизна
Впервые произведен комплексный анализ микрогемореологических свойств у больных СКВ, в том числе при волчаночном нефрите, и показано, что процесс агрегации эритроцитов зависит от активности болезни.
Впервые отмечено, что изменение деформационных свойств эритроцитов характерно для всех больных СКВ, независимо от стадии активности заболевания, но наиболее выраженные изменения зафиксированы при поражении почек — активном волчаночном нефрите с нефротическим синдромом в сочетании с анемией.
Впервые продемонстрировано, что быстрое образование крупных эритроцитарных агрегатов высокой прочности свидетельствует о неблагоприятном течении волчаночного нефрита.
Впервые на основании бинарно-логистической регрессии определены как клинические, так и гемореологические показатели, обладающие прогностической ценностью для характеристики течения волчаночного нефрита.
Практическая значимость
Изучение гемореологических показателей у больных СКВ с поражением почек позволяет уточнять прогноз течения болезни и адекватность проводимой терапии. Анализ гемореологических параметров при заболевании позволяет своевременно диагностировать возникновение микроцир-куляторных нарушений и оценить риск развития гиперагрегационного синдрома. Выявлены гемореологические предикторы неблагоприятного течения волчаночного нефрита.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
У больных СКВ выявляются нарушения реологических свойств крови — повышение ее вязкости, ухудшение деформационных свойств эритроцитов, ускоренное образование крупных эритроцитарных агрегатов. Аномалии процессов агрегации-дезагрегации максимально выражены у больных в период обострения, и зависят от стадии активности заболевания.
-
У больных с волчаночным нефритом, по мере нарастания признаков активности заболевания, ухудшаются деформационные и агрегационные свойства эритроцитов, что максимально выражено у больных с активным волчаночном нефритом.
-
Выраженность гематурии у больных волчаночном нефритом прямо коррелирует с размером эритроцитарных агрегатов, в то время как у больных с IgA-нефритом при сопоставимом уровне гематурии такая корреляция отсутствует.
-
Наиболее тяжёлые гемореологические изменения отмечаются у больных активным волчаночном нефритом с сопутствующей анемией, у которых образуются крупные эритроци-тарные агрегаты повышенной гидродинамической прочности и максимально снижена способностью эритроцитов к деформации.
5. При обострении волчаночного нефрита образование крупных эритроцитарных агрегатов
повышенной прочности является признаком дальнейшего неблагоприятного течения заболевания.
Внедрение результатов в практику
Результаты диссертации используются в лечебной работе клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней имени Е.М. Тареева Университетской клинической больницы №3 ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.
Личный вклад автора
Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их теоретической и практической реализации, включая выполнение лабораторной части, до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах, а также их внедрение в практику. Автором был лично выполнен сбор архивного материала, формирование базы данных, аналитическая и статистическая обработка полученных данных.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы проведена 25 сентября 2013 года на совместном заседании сотрудников кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, кафедры терапии и профессиональных болезней медико-профилактического факультета, кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования врачей, отдела нефрологии НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья человека ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России. Материалы диссертации докладывались на семи конференциях.
-
IV Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). Москва, 4–6 февраля 2009 г.;
-
VI Международной конференции по гемореологии и микроциркуляции», Ярославль, 10– 13 июня 2009 г.;
-
VII съезд научного общества нефрологов России, 19–22 октября 2010 г., Москва;
-
Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011», 11–15 апреля 2011 г., Москва;
-
Восьмая международная конференция (со школой для молодых ученых) системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения), 10–15 июня 2011 г., Ярославль;
-
European Renal Association — European Dialysis and Transplant Association, 2011, 23– 26.06.2011, Praga, the Czech Republic;
-
Пятая всероссийская школа-конференция по физиологии кровообращения, Москва, 2012 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 — в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 1 — в иностранной печати.
Объем и структура работы
Вязкость крови
Одним из свойств мембраны эритроцита является её необыкновенная приспосабливаемость к меняющимся условиям осмотического и онкотического давления. Большое количество белка в эритроците обеспечивает ему очень высокое онкотическое давление и создаёт условия для «разбухания» эритроцита в изотонических растворах и сморщивание в гипертонических. Это особенно важно при прохождении эритроцита через сосудистую сеть почек, где онкотическое давление меняется от изотонического до резко гипертонического (увеличенного в 6 раз) [29].
В мембране эритроцита имеются каналы, через которые происходит обмен ионами между цитоплазмой и внеклеточной средой. Мембрана эритроцита проницаема для катионов Na+ и K+; особенно хорошо она пропускает кислород, углекислый газ, анионы Cl- и HCO3-. В составе эритроцитов содержится около 140 ферментов, в том числе и антиоксидантная ферментная система, а также Na+-, K+-, Ca2+-зависимые АТФазы, обеспечивающие транспорт ионов через мембрану эритроцита и поддержание его мембранного потенциала [29].
Кроме своей основной функции, эритроцит играет важную роль в межклеточных взаимодействиях, иммуновоспалительных реакциях, а также в поддержании кислотно-щелочного баланса. Установлено, что на мембране эритроцитов присутствует фермент карбоангидраза, который катализирует присоединение молекулы углекислого газа к молекуле воды с образованием гидрокарбонат-аниона (HCO3-), который значительно лучше углекислого газа растворяется в жидкой части крови и затем с током крови транспортируется в лёгкие. Гидрокарбонат-анион также играет важную роль в формировании бикарбонатного буфера, на долю которого приходится около 10% всей буферной ёмкости крови [30, 31]. Эритроциты адсорбируют и синтезирует сигнальные молекулы, а также переносят на поверхности мембраны различные соединения с помощью сети гликопротеинов, выполняя транспортную функцию [32]. Оболочка эритроцита представляет собой пластичную молекулярную мозаику, состоящую из фосфолипидов, липо- и гликопротеинов, а также интегральных белков мембраны.
В мембране эритроцита человека идентифицировано около 340 белков, 15 из которых имеют молекулярную массу от 15000 до 250000 Да. Три из них — спектрин, гликофорин и белок полосы 3 — в сумме составляют по весу более 60% всех мембранных белков. Основой оболочки является липидный бислой, который пронизывают плавающие в нем трансмембранные белки. К последним через «якорные» белки, крепится спектрин-актиновый ци-тоскелет (рис. 1.2; [33, 34]), играющий важную роль в формировании механических свойств мембраны эритроцита.
Экспериментально было показано, что на мембране эритроцитов находятся рецепторы к инсулину [35], эндотелину, церулоплазмину [29], 2-макроглобулину [36]; и -адренорецепторы [37], рецепторы к компонентам комплемента [37], иммуноглобулинам [37, 38], антителам к кардиолипинам [37]. Недавно на поверхности эритроцита обнаружен и рецептор фибриногена [39], обладающий высокой специфичностью. «Микрореологические» свойства эритроцитов Способность эритроцитов к изменению формы именуется также его деформируемостью. Деформация эритроцита до некоторого предела может происходить без существенного натяжения его оболочки, что возможно из-за «избытка» площади поверхности по сравне-11 нию со сферой того же объёма [40]. В пределах ограничений, накладываемых этим геометрическим фактором, деформируемость клеток зависит от свойств их мембраны и внутреннего содержимого.
Деформируемость эритроцита во многом диктуется свойствами его оболочки. Мембрана — липидный бислой — в реологическом отношении представляет собой двухмерную жидкость. Несмотря на затрудненность обмена между слоями, его молекулы легко перемещаются в пределах своего слоя [41]. Жёсткость эритроцита определяется наличием мембранного цитоскелета — длинных ( 2000 ) и жёстких молекул спектрина. Высокое сопротивление этих молекул деформации, до некоторой степени, компенсируется сетчатым характером их взаимосвязи [42, 43]. Способность эритроцита к деформации различных типов (изгиб, растяжение, сжатие, кручение) существенно различается [44], однако в норме, в системе кровообращения клетки легко изменяют свою форму [45].
Благодаря тому, что в эритроците молекулы гемоглобина заключены в гладкую и хорошо деформируемую оболочку, реализуется оптимальное соотношение между кислородной ёмкостью крови и гемодинамическим сопротивлением. На уровне мельчайших капилляров нормально деформирующиеся эритроциты легко преодолевают входные участки и неравномерности сосудистого диаметра [46].
Деформируемость эритроцитов может изменяться в результате изменения целого ряда параметров: водно-солевого обмена клетки, её энергетических реакций, взаимодействия мембраны с плазматическими факторами и др. В патологических случаях нарушения, стимулируемые патогенными факторами или/и определяющиеся наследственной предрасположенностью, могут существенно ухудшать деформируемость эритроцитов и, как следствие, затруднять транспорт крови [19, 47, 48].
Движение крови при низких скоростях течения также зависит другой составляющей гемо-реологических параметров, а именно от способности эритроцитов к взаимодействию между собой — агрегации. Агрегация эритроцитов является нормальным и обратимым явлением, более свойственным подвижным видам животных [49]. Она реализуется в венозных сосудах в отсутствие значительных напряжений сдвига, разъединяющих клетки. Процессы объединения и разъединения клеток зависят от физико-химических свойств поверхности эритроцитов и могут модифицироваться под действием различных компонентов плазмы крови (в том числе, низкомолекулярных). Однако основополагающим и обязательным условием агрегации эритроцитов является наличие в плазме крови крупных полимерных молекул. В экспериментальных условиях агрегацию эритроцитов могут стимулировать полимеры самой различной химической природы; in vivo (в норме) она определяется, преимущественно, наличием молекул фибриногена [19, 23].
В настоящее время обсуждаются два основных механизма влияния полимерных молекул на стимуляцию агрегации эритроцитов. Это т.н. теория мостиков или теория макромолеку-лярного связывания и теория истощенного слоя. Теория мостиков основывается на данных оптического исследования, при котором было показано, что в процессе агрегации эритроцитов с помощью полилизина (пептид или укороченный белок, получаемый из питательного раствора Streptomyces albulus) электрон-плотные молекулы последнего располагаются между соседними клетками подобно «мостикам» [50]. Согласно теории мостиков, перемычки из полимерных молекул обусловливают взаимодействие эритроцитов [51]. Подтверждением этому является эксперимент, в котором при использовании различных полимеров расстояние между соседними эритроцитами в агрегате соответствует характерной длине полимерных молекул [52].
Теория истощенного слоя основывается на данных коллоидной химии, согласно которым близ поверхности твёрдой частицы, помещенной в раствор полимеров, концентрация полимерных молекул ниже, чем в основной массе раствора, что происходит благодаря конфор-мационным особенностям молекул полимера [53]. Возможность образования аналогичного «истощенного слоя» близ поверхности эритроцитов подтверждается тем, что в растворе вязкого полимера электрофоретическая подвижность клеток, по сравнению с этим показателем в плазме крови, снижается весьма незначительно [54]. Согласно теории истощенного слоя, наличие такого слоя между сближенными эритроцитами может приводить к возникновению осмотического (in vivo — онкотического) градиента, оттоку воды из межэритроци-тарного зазора и агрегации клеток [55]. В целом, вопрос о механизмах агрегации эритроцитов далек от разрешения. Об этом свидетельствуют и противоречия между описанными группами представлений, и отдельные альтернативные данные, говорящие о возможности влияния на процесс агрегации эритроцитов внутриклеточных процессов [56]. Кроме того, в единичных работах выявлена возможность реализации не только общепризнанного неспецифического механизма влияния фибриногена на агрегирующие эритроциты, но также рецепторного взаимодействия молекул фибриногена с клетками [57-59].
«Микрореологические» свойства эритроцитов
Тяжесть течения волчаночного нефрита и обуславливаемая им высокая летальность делают актуальной диагностику этого состояния и степени его активности. Общепринятой является диагностика активного волчаночного нефрита по наличию нефротического или мочевого синдрома. При этом обращают внимание на такие показатели работы почек, как скорость клубочковой фильтрации, уровень белков, особенно, альбумина в крови, наличие артериальной гипертонии. Как правило, ведущую роль в диагностике активности волчаночного нефрита отводят протеинурии [73], которую определяют по суточным анализам мочи, в связи с тем, что разовые порции могут сильно варьировать в концентрации.
Кроме того, удобными показателями являются концентрация креатинина в моче и соотношение белок/креатинин. На ВН также указывает осадок в моче: это может быть следствием лейкоцитурии, гематурии и наличия мелкозернистых и гиалиновых цилиндров [3]. Важным диагностическим признаком при ВН является снижение уровня факторов комплемента C3 и C4 в крови. Также в крови у больных ВН часто повышен титр антител к ДНК.
Сложность диагностики ВН заключается в том, что при СКВ обычные маркеры патологического процесса не всегда позволяют выявить почечные нарушения. Действительно, у больных волчанкой стандартные лабораторные оценки свидетельствуют о нарушении почечных функций лишь у 25–50% больных, а морфологический анализ показывает наличие почечных аномалий более чем у 60% взрослых и 80% детей [45]. Проявления почечных нарушений при СКВ настолько многообразны, что диагностировать ВН часто не удается до тех пор, пока не развивается полноценный нефротический или нефритический синдром [55, 29]. Это обусловливает необходимость дальнейшего углубленного анализа перспективности различных маркеров ВН. Гемореологические нарушения при системной красной волчанке
Появившийся в последнее десятилетие интерес к диагностике и коррекции гемореологиче-ских нарушений при различных заболеваниях обусловлен, прежде всего, поиском пути, позволяющего замедлить развитие ишемии жизненно важных органов и предотвратить развитие сосудистых катастроф [7, 196, 197]. Патологическое изменение гемореологических свойств является важным фактором в развитие большого количества заболеваний, включая СКВ и IgA-нефрит.
Повышение вязкости крови может стать первостепенным нарушением в микроциркулятор-ном русле при развитии СКВ. Выраженность изменений гемореологических параметров зачастую определяет тяжесть состояния больного и прогноз исхода заболевания [196]. Нарушения микроциркуляции
Микроциркуляторная патология, свойственная больным СКВ, связана как с сосудистыми изменениями, так и с гематологическими нарушениями.
Наглядные свидетельства изменения морфологии сосудов выявляются при биомикроскопии доступных исследованию областей. В стенке сосудов обнаруживают повреждения, связанные с местным отложением иммунных комплексов. Имеется немало данных о неблагоприятном развитии подобных нарушений, вплоть до волчаночного васкулита, причем, поражение микрососудов, как правило, носит генерализованный характер и тесно связано с нарастающей дезорганизацией соединительной ткани [11].
Нормальному кровотоку в области микрососудов при заболевании может препятствовать активация лейкоцитов, активация процессов свертывания крови [198].
При СКВ было обнаружено нарушение тромбоцитарно-эритроцитарного взаимодействия [11]. Отмечено увеличение содержания в эритроцитах тромбопластических веществ, возрастание выделения ими АДФ — мощного индуктора агрегации тромбоцитов. Нарушение тромбоцитарно-эритроцитарного звена может способствовать развитию синдрома дис-семинированного внутрисосудистого свёртывания крови с блокадой микроциркуляции и дисфункцией жизненно важных органов [199, 200].
Нарушения гемореологических свойств
Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о микроциркуляторных нарушениях при СКВ, которые могут быть связаны с гемореологической патологией [11, 199-203].
С использованием атомного-силового микроскопа была выявлена особенность волчаноч-ных эритроцитов [204]. Так, литературные данные свидетельствуют о сниженной способности клеток к деформации по сравнению с нормой [7, 11, 12, 204], что связано, в частности, с неблагоприятными геометрическими изменениями — формированием стабильных сферических форм (сферостоматоцитов). Такие клетки склонны не только к преждевременно старению и гемолизу, но также к снижению деформационной потенции в связи с минимизацией площади поверхности и, следовательно, невозможностью деформации без существенных натяжений мембраны [205]. Известно также, что при заболевании изменяются физико-химические свойства клеточной мембраны [206-209]. Так, было показано, что активация системы комплемента может приводить к кальций-зависимым изменениям в цитоскелете эритроцитов, увеличивающим жёсткость мембраны эритроцита [209, 210], и, следовательно, ухудшающим его деформационные способности.
Снижение концентрации поверхностных сиаловых кислот и, соответственно, уменьшение заряда эритроцитов может способствовать снижению суспензионной стабильности крови. Была отмечена гиперагрегация эритроцитов [11, 199, 211], хотя она наблюдалась и не во всех исследованных группах больных СКВ [12]. Показано увеличение размера эритроци-тарных агрегатов у больных СКВ [11, 199, 212]. Помимо агрегации, у больных наблюдают и другой вид патологического взаимодействия клеток — их агглютинацию (результат активации иммунологических механизмов и взаимодействия антител плазмы крови с антигенами эритроцитов), сопровождающуюся реакциями гемолиза [211].
В целом, данные, отражающие гемореологические параметры у больных СКВ, несколько противоречивы, что затрудняет оценку гемореологического фактора, играющего не последнюю роль в микроциркуляторных нарушениях [213], которые, в свою очередь, оказывают неоспоримое влияние на процесс развития различных клинических форм системной красной волчанки [211]. Кроме того, анализ нарушений реологических свойств крови при ВН практически отсутствует. Дефицит гемореологических данных, сужая границы возможных объяснений микроциркуляторных нарушений, свойственных больным СКВ с поражением почек, и ограничивает возможность адекватной коррекции почечного кровоснабжения. или болезнь Берже, — это самый частый вид гломерулонефрита у подростков ( 60% пациентов старше 13 лет) [214]. В 1969 году Жан Берже описал отложения IgA в мезангии почечных клубочков детей и взрослых, страдающих макроскопической формой гематурии во время фарингита [215]. Действительно, и сейчас главным диагностическим признаком IgA-нефропатии являются отложения IgA, либо в чистом виде, либо в комбинации с IgG и/или IgM (рис. 1.6) [4].
На сегодняшний день самой современной системой классификации разновидностей IgA-нефрита является Оксфордская система, обобщающая признаки заболевания, которые
Рисунок 1.6. Патология IgA-нефрита [4]. А — гипертрофия клеток мезангия. B — Сегментная эндокапиллярная пролиферация с блокированием люмена капилляра. C — Сегментный гломерулосклероз с накоплением гиалина и разрушением люмена капилляра. D — Канальцевая атрофия и фиброз с рубцеванием и разрушением канальцев. E — Гломерулярное полулуние: периферический слой эпителиальных клеток окружает почечный клубочек. F (иммунофлуоресцентное окрашивание анти-IgA антителами) — диффузное распределение IgA в мезангии. G (электронная микрофотография с контрастированием OsO4) — отложение электронно-плотного материала соответствует почечному отложению иммунных комплексов.
Патогенез гематурии
В группу сравнения вошли 24 больных IgA-нефритом. Диагноз ставили на основании клинических признаков после исключения урологических причин гематурии, включая камни и опухоли мочевого тракта. Признаков нефротического синдрома у обследованных больных выявлено не было (общий белок сыворотки крови — 66.9±6.4 г/л, альбумин — 41.7±5.0 г/л), ведущим клиническим проявлением была выраженная гематурия (51000±45400 мл-1); у одного больного — изолированная, у остальных — в сочетании с протеинурией (1.08±0.98 г/сут). У двух больных отметили протеинурию нефротиче-ского уровня (3.7±0.5 г/сут), у 9 — субнефротического уровня (1.67±0.63 г/сут), у 12 больных — менее 1 г/сутки.
Контрольную группу составили 66 практически здоровых добровольцев (25 мужчин и 41 женщина, средний возраст — 35±9 лет). Критерием исключения из контрольной группы в возрасте до 35 лет было наличие патологических изменений в общем анализе крови и общем анализе мочи, а также присутствие каких-либо соматических заболеваний на момент исследования. Критерием исключения из контрольной группы лиц в возрасте свыше 35 лет было наличие хронических воспалительных процессов и обострение хронических заболеваний на момент исследования.
Специальные методы Исследование гемореологических параметров Исследование гемореологических показателей (вязкости крови, показателей агрегации-дезагрегации и деформации эритроцитов) проводили в образцах венозной крови, полученной из v. mediana cubiti натощак. Объем пробы составлял 12-14 мл. Кровь стабилизировали EDTA (0,002 г/мл). Пробы сохраняли в закрытых пластиковых пробирках при температуре 23 С. Измерение проводили при температуре 25 С через 1.5-4 часа после взятия пробы.
Вязкость плазмы крови определяли с помощью капиллярного вискозиметра с диаметром капилляра 0.8 мм и длинной 118 мм как ПлазмыЛводы х воды? где t — время истечения тестируемой жидкости, а воды=0.9 мПас (при 25 С). Во всех образцах крови контролировали форму эритроцитов под микроскопом Optics Digital Lab USB при сорокакратном увеличении.
Гематокрит (Ht) определяли непосредственно перед гемореологическим тестированием после центрифугирования крови в стандартных капиллярах в течение 6 минут в микроцентрифуге для определения гематокрита НС-702 APEL (12000 мин-1). Для каждой пробы крови измерения производили не менее чем в 3 капиллярах. Гематокрит рассчитывали как отношение объёма эритроцитов к объёму всей крови с помощью специальной отсчётной шкалы с ценой деления 0.5 мм. Ошибка метода составила 0.7%. После определения исходных значений Ht эритроцитарную массу и плазму крови разделяли путем центрифугирования (при температуре 25 С в течение 5 минут) на центрифуге Centrifuge 5417R (2500 мин-1). Из крови забирали необходимый объём или эритроцитарной массы (при исходном Ht 40%), или плазмы (при исходном Ht 40%), получая стандартный Ht=40%.
Агрегацию-дезагрегацию эритроцитов и их деформацию изучали оптическими методами с помощью автоматического коаксиально-цилиндрического лазерного агрегометра-деформо-метра «LADE» (РеоМедЛаб, Россия; реологический зазор — 0.9 мм, i=650 нм). Оценивая агрегацию эритроцитов определяли следующие показатели: ? характерное время спонтанной агрегации эритроцитов (Т); ? эффективный размер эритроцитарных агрегатов (A); ? гидродинамическую прочность основной массы эритроцитарных агрегатов (Р) при скоростях сдвига 2-130 с-1; ? прочность самых крупных эритроцитарных агрегатов (I2.5) при минимальной скорости сдвига; ? эффективную скорость протекания самых начальных моментов процесса агрегации (кТн)
Кинетику агрегации и дезагрегации эритроцитов исследовали путем измерения интенсивности обратного светорассеяния (I) от пробы крови со стандартным Ht=40% [239].
Спонтанную агрегацию (а) эритроцитов изучали, регистрируя изменение I а со временем (t) после остановки потока крови. Экспоненциальную кривую зависимости Iа(t) переводили в полулогарифмические координаты. Оценку характерного времени спонтанной агрегации эритроцитов производили с помощью параметра Т = Дополнительную информацию о скорости первого взаимодействия эритроцитов получали с помощью параметра кТн, вычисляемому аналогичным путем, но после перевода кривой Ia(t) в полуобратных координатах, т.к. эта часть кривой лучше описывалась гиперболой. Для оценки характерного размера эритроцитарных агрегатов использовали параметр А, представляющий собой разность между I а до начала процесса агрегации и Iа после её окончания [38].
Дезагрегацию (d) эритроцитов исследовали в условиях пошагового увеличения скорости сдвига в диапазоне -2-130 с-1. Полученную при этом кривую зависимости интенсивности обратного светорассеяния (Id) от скорости сдвига (у) переводили в полулогарифмические координаты. Вычисляли показатель гидродинамической прочности агрегатов = . Дополнительно, с помощью параметра I2.5, оценивали прочность самых крупных агрегатов эритроцитов. I.5 получался путем сопоставления I в конечный момент агрегации и I при минимальной скорости сдвига 2.5 с-1, и вычислялся как процент агрегатов, распадающихся при у = 2.5 с-1, взятый с обратным знаком (для превращения I2.5 из показателя легкости распада в показатель прочности агрегатов) [38].
Оценивали также следующие деформационные показатели: интенсивность деформации при увеличении скорости сдвига в диапазоне 3 1300 с-1 (tga); максимальная растяжимость клеток при скорости сдвига 2100 с-1 (IDmax). Деформационные свойства эритроцитов изучали методом эктацитометрии [240]. При этом растяжимость эритроцитов в сдвиговом потоке тестировали при скоростях сдвига, возрас тающих в диапазоне 3-1300 с-1. Образцы крови разбавляли в 500 раз — для получения ди фракционной картины от отдельных эритроцитов. В качестве среды использовали вязкий 1.5% раствор высокомолекулярного полиэтиленоксида Polyox WSR-ЪОХ (Union Carbide, США; средняя молекулярная масса — 4106 Да). Регистрируемая дифракционная картина, соответствовавшая контурам эритроцита, по мере возрастания скорости сдвига приобретала вид все более уплощающегося овала. Рассчитывали индекс эллиптичности (index ellipticity) IE = (L-H) I (L+H), где L — длина, Н — ширина овала. Кривую зависимости IE от скорости сдвига (у) переводили в полулогарифмические координаты. В качестве показателя интен сивности деформации эритроцита при пошаговом увеличении скорости сдвига использо вали параметр tga, т.е., тангенс наклона прямой IE (ln (y)). Максимальную растяжимость эритроцитов оценивали с помощью индекса деформируемости (IDmax), представляющего собой IE при у = 2100 с-1 [241 ].
IgA-гломерулонефрит
Результаты проведённого исследования продемонстрировали ухудшение реологических свойств крови как у больных ВН разной степени активности, так и у больных IgA-нефритом. Для всех больных были характерны ускорение и усиление процессов агрегации эритроцитов, выражавшиеся в увеличении эффективного размеров эритроцитарных агрегатов и их прочности (табл. 3.7 и рис. 3.4). Ухудшение деформируемости эритроцитов (табл. 3.8) не противоречит предположению о том, что усиление агрегации не в последнюю очередь связано именно с изменением свойств самых эритроцитов, и это может отражать некоторые общие закономерности патогенеза как СКВ, так и IgA-нефрита, а именно — влияние различных иммунных комплексов на эритроцит.
Действительно, в основе IgA-нефрита лежит нарушение процесса гликозилирования IgA, что приводит к образованию иммунных комплексов (IgA–IgA1, IgA1–IgG), имеющих высокое сродство к эритроцитам. В этом случае аномальный IgA1, образуя комплексы, может связываться с рецепторами мембраны эритроцитов, ускоряя их взаимодействие друг с другом. Вероятно, многообразие антител, образующихся при обострении СКВ, также значительно влияет на мембрану эритроцитов, приводя к их ускоренному взаимодействию и образованию крупных и прочных эритроцитарных агрегатов.
Таким образом, не исключено, что изменение реологических параметров крови в целом может быть одним из признаков системного повреждения эритроцитов при СКВ [244, 245]. Последнее, скорее всего, обусловлено высокой концентрацией серологических маркеров активности болезни (табл. 3.5 и 3.6; рис. 3.1, 3.2 и 3.6). Изменение свойств эритроцитов, проявляющееся, в частности, в гемореологических аномалиях, может способствовать развитию гематурии.
Достаточно показательным для больных ВН оказался эффективный размер эритроцитарных агрегатов (А; рис. 3.6). Данный параметр, характеризующий степень агрегированности клеток, нарастал с увеличением активности заболевания. Сопровождающее ВН усиление агре-гационных свойств эритроцитов можно объяснить изменением свойств их мембран, в том числе, возможно, и рецепторных [245], а также снижением заряда клеток [245, 246]. Усиление «адгезивных» свойств эритроцитов может затруднять циркуляцию крови на уровне капилляров, способствуя прогрессированию заболевания. Эритроциты с такими свойствами могут легче взаимодействовать с эндотелием перитубулярных капилляров, а это может способствовать нарастанию выраженности гематурии. Отсутствие же в нашей работе корреляционной зависимости между гематурией и гемореологическими параметрами в случае IgA-нефрита может быть связано с «недостаточным» влиянием аномального гликозилирован-ного IgA на свойства мембран эритроцитов.
Клиническая значимость гематурии до настоящего времени остаётся предметом дискуссии. Так, по мнению одних авторов, выраженность гематурии является вторичной по отношению к картине морфологических изменений в почечном биоптате [73, 96]. Другие авторы рассматривают гематурию в качестве основного маркера активности ВН, что и отражено при разработке соответствующей классификации [247].
Выявленная нами взаимосвязь между изменением базовой составляющей микроциркуляции, гемореологическими нарушениями и гематурией (рис. 3.7), а также обнаружение аналогичной связи у больных без выраженной протеинурии (р = 0.5, р 0.02), подтверждает, что наличие гематурии может являться весьма значимым показателем активности процесса при ВН, даже в отсутствие значительной протеинурии. Гемореологические свойства у больных волчаночным нефритом, осложнённым анемией При прогрессировании заболевания у пациентов нередко проявляется анемия [248] — осложнение, связанное с утратой почками способности секретировать достаточное количество эритропоэтина, необходимого для стимуляции кроветворения [249]. Из данных литературы известно, что при СКВ возможны неоднозначные гемореологические изменения, связанные с анемией [250], при которой может наблюдаться уменьшение вязкости крови, связанное со снижением гематокрита, и облегчение течения крови, связанное с гемолитическими явлениями [238]. В нашем исследовании у больных ВН с анемией (больные при альтернативной обработке вошли в группу СКВ (39+)) не выявлено снижения вязкости крови
Анализируя агрегационные свойства эритроцитов, мы выявили ухудшение показателей в обеих группах больных (ВНан- и ВНан+) (табл. 3.10). Тем не менее, в случае сочетания ВН с анемией гиперагрегация эритроцитов была выражена сильнее. Последнее могло быть связано с усилением патологических процессов, влияющих на эритроциты такого рода больным [245]. Наши данные показывают, что при наличии анемии, даже в отсутствие изменения вязкости крови в целом, имеются микрореологические нарушения, которые могут приводить к затруднению циркуляции крови на уровне мельчайших сосудов.
Возможные причины гиперагрегации эритроцитов у больных волчаночным нефритом На процесс агрегации эритроцитов у больных ВН могут влиять аутоантитела, образующиеся в большом количестве при обострении заболевания, и изменяющие свойства мембран эритроцитов (табл. 3.5, 3.6 и 3.11; рис. 3.1, 3.2 и 3.5). Кроме того, воздействовать может и снижение концентрации альбумина (табл. 3.6), влияние которого на агрегацию, в общем случае, неоднозначно [23, 251].
У обследованных нами больных агрегация эритроцитов, в большей степени, проявлялась на фоне уменьшения концентрации альбумина (табл. 3.6). Ускорение агрегации и увеличение прочности агрегатов эритроцитов у больных ВН с иммунологическим обострением заболевания (табл. 3.2 и 3.3) объясняется также некоторым увеличением содержания в плазме крови макромолекул (табл. 3.6).
То, что для агрегации эритроцитов необходимы макромолекулы — давно известный и хорошо подтвержденный факт [252, 253]. Показано, что в отсутствие полимеров эритроциты практически не агрегируют, и их агрегируемость возрастает c увеличением молекулярной массы и концентрации полимерных молекул [254]. Тем не менее, до сих пор не решен основной вопрос о том, каким образом макромолекулы способствуют взаимодействию клеток. Согласно теории «истощенного слоя» агрегация эритроцитов происходит под действием осмотических сил.
Более аргументированной экспериментально представляется «мостиковая» теория образования эритроцитарных агрегатов за счёт связующих молекул-«мостиков» [50, 51], где в качестве агрегатообразующих веществ могут выступать фибриноген и некоторые фракции
иммуноглобулинов, причем иммуноглобулины могут играть значительную роль при патологической агрегации эритроцитов [255, 256]. Исходя из представлений теории «истощенного слоя», возрастание вклада в патологическую агрегацию клеток иммуноглобулинов объясняют простым увеличением их концентрации и, следовательно, увеличением сближающих эритроциты осмотических сил, хотя в рамках этой теории остаются неясными реци-проктные отношения между выраженностью агрегации эритроцитов и концентрацией основного белка, определяющего онкотическое давление — альбумина [253, 257]. Согласно «мостиковой» теории, между эритроцитами и полимерными молекулами должно осуществляться непосредственное взаимодействие. В случае иммуноглобулинов это, как известно, может запускать каскад реакций, приводящих к уничтожению клетки [258]. Впрочем, известно, что связь макромолекул с агрегирующими эритроцитами осуществляется, преимущественно, неспецифическим образом, за счет слабых водородных и ван-дер-ваальсовых связей [20], на которые способны и иммуноглобулины [259]. Кроме того, не исключено, что у пациентов, страдающих волчаночным нефритом, рецепторное взаимодействие иммуноглобулинов с эритроцитами несколько ослаблено. В пользу этого свидетельствует и найденная у больных СКВ патология рецепторного аппарата эритроцитов [245].
Возможное прогностическое значение гемореологических параметров для больных волчаночным нефритом
Проведенное исследование показало, что волчаночный нефрит сопровождается ухудшением гемореологических показателей, усугубляющимся с увеличением как иммунологической активности заболевания, так и активности патологического процесса в почках (рис. 3.3, 3.4, 3.6–3.8; табл. 3.7, 3.8, 3.12). Последствия этого ухудшения могут быть неоднозначными. Как было выявлено в экспериментах на животных, в норме система кровообращения способна «изымать» аномально жёсткие эритроциты из кровотока [260, 261]. В почках увеличение вязкости крови может приводить к компенсаторной вазодилатации, вызываемой секрецией ренина [262]. Вместе с тем, при патологии, когда компенсаторные реакции организма нарушены, ужесточение мембраны эритроцитов и усиление их агрегируемости способны существенно влиять на циркуляцию крови на уровне микрососудов [47].