Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Инициация транскрипции 13
1.2. Эволюция механизма инициации транскрипции 15
1.2.1. Инициация транскрипции у бактерий 15
1.2.2. Инициация транскрипции у архей 16
1.3. Особенности инициации транскрипции у эукариот 22
1.4. Специфичность связывания TBP с TATA-боксом 25
1.5. SAGA или TFIID? 27
1.6. Паралоги TBP в геноме 29
1.7. Промоторы 34
1.7.1. Коровый промотор 35
1.8. Комплексы ремоделирования хроматина 37
1.9. Транскрипционные факторы 41
1.9.1. ДНК-связывающий домен типа «цинковый палец» C2H2-типа 43
1.10. Архитектура хроматина 45
2. Материалы и методы 51
2.1. Общие методы работы с ДНК 51
2.1.1. Приготовление компетентных клеток E. Coli, штамм DH5 51
2.1.2. Трансформация клеток DH5 51
2.1.3. Выделение плазмидной ДНК из большого объёма бактерий (50 мл) 52
2.1.4. Получение плазмидных векторов 52
2.1.5. Препаративная рестрикция ДНК 53
2.1.6. Лигирование ДНК 53
2.2. Дрожжевая двугибридная система (ДДС) 53
2.2.1. Принцип создания делеционных производных для ДДС 55
2.3. Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq)56
2.3.1. Получение хроматина для иммунопреципитации 56
2.3.2. Анализ данных ChIP-seq 59
2.4. Наработка и выделение рекомбинантных белков из E. Coli 59
2.5. Глютаральдегидная сшивка 60
2.6. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле при денатурирующих условиях (SDS-PAGE) 60
2.7. Метод смещения электрофоретической подвижности ДНК в геле (EMSA) 61
2.8. Визуализация белков в акриламидном геле с помощью Coomassie Blue R250 61
2.9. Визуализация белков в акриламидном геле с помощью окрашивания серебром 62
2.10. Визуализация белков методом Вестерн-блот 62
2.11. Коиммунопреципитация (CoIP) 63
2.12. Получение антител 64
2.13. Получение линий мух с заменой гена на последовательность для сайт-специфической рекомбинации 64
2.14. Получение конструкций для сайт-специфической интеграции в геном 65
3. Результаты 67
3.1. Дополнительный N-концевой домен длинной изоформы TRF2 является эволюционно новым доменом, состоящим из повторов 67
3.2. Экспрессия длинной изоформы trf2 p175 более эффективно восстанавливает функции удаленного trf2 гена, чем экспрессия короткой изоформы trf2 p75 68
3.3. Участок в составе N-концевого домена длинной изоформы и общий для обеих изоформ C-концевой домен способны взаимодействовать с ДНК-связывающими белками в ДДС 71
3.4. Терминальная часть C-концевого домена консервативна среди насекомых 73
3.5. Opbp как модельный белок для изучения TRF2-зависимых промоторов 75
3.6. Доменная организация белка Opbp 75
3.7. Картирование участков взаимодействий Opbp, CP190, Pzg и TRF2 77
3.8. Делеция гена Opbp летальна 82
3.9. Эффекты делеций взаимодействующих с CP190 и Pzg участков Opbp 83
3.10. Opbp связывает небольшое число сайтов в геноме 84
3.11. Определение специфичного ДНК-мотива, связываемого Opbp 85
3.12. Opbp колокализуется с CP190/Pzg/TRF2 на промоторах генов рибосомальных белков 87
3.13. Opbp напрямую регулирует экспрессию рибосомальных белков in vivo 89
3.14. Opbp содержит димеризационный домен 92
3.15. Эффект делетирования димеризующегося участка Opbp 93
3.16. Мотивы для связывания Opbp способны опосредовать дистанционные взаимодействия 94
3.17. Мотивы для связывания Opbp обладают энхансер-блокирующей активностью 97
Заключение 101
Выводы 105
Список литературы 106
Приложение 120
- Инициация транскрипции у архей
- Комплексы ремоделирования хроматина
- Экспрессия длинной изоформы trf2 p175 более эффективно восстанавливает функции удаленного trf2 гена, чем экспрессия короткой изоформы trf2 p75
- Мотивы для связывания Opbp обладают энхансер-блокирующей активностью
Инициация транскрипции у архей
Археи являются прокариотическими организмами, однако сочетают в себе как черты бактерий, так и эукариот, занимая промежуточное положение с точки зрения организации базового транскрипционного аппарата. Согласно современным представлениям, эукариоты произошли от близкой к археям группы [18] и для инициации транскрипции у архей и эукариотической РНК-пол II необходим схожий минимальный набор GTF [19]. Возможно археи возникли как гипертермофилы, с чем связано появление у архей специализированных белков, связывающих и уменьшающих плавкость ДНК при высоких температурах и способствующих её компактизации – гистонов, Alba, Cren7 и других [20], однако в отличии от эукариотических гистонов, формирующих октамеры и, в зависимости от посттрансляционных модификаций и расположения, репрессирующих инициацию и элонгацию транскрипции, для гистонов архей, существующих в растворе в виде димеров и способных формировать полимеры in vivo, не показано значительного влияния на инициацию транскрипции и связывание общих факторов транскрипции.
Инициация транскрипции у архей начинается со связывания TBP (TATA binding protein), гомолога главной субъединицы TFIID у эукариот, с последовательностью T-A-A-(A/T)-A-(A/T)-(A/G) (TATA-бокс) в коровой части промотора, и TFB, гомолога -фактора бактерий и TFIIB-фактора эукариот, с последовательностями BRE (TFB responsible element) выше и ниже от ТАТА-бокса. Оба белка, взаимодействуя, стабилизируются на промоторе; показано, что в отличие от TBP эукариот, ассоциация TBP архей с ДНК носит транзиентный характер [21]. Далее, TFB рекрутирует РНК-пол в комплексе с TFE. У архей, в отличие от системы РНК-пол II эукариот, для плавления ДНК внутри ПИК не требуется АТФ [22]. Значение TFE недостаточно изучено, однако известно, что он способствует инициации транскрипции при более низких температурах и способен компенсировать дефекты структурных частей TFB необходимых для плавления ДНК [23]. В известных геномах архей не обнаруживается гомологов для TFIIA, TFIIF, TFIIH и TBP-ассоциированных факторов [22], в виду чего, TBP, TFB и TFE можно рассматривать как прототипический набор общих факторов для инициации транскрипции у эукариот [24].
TBP
TBP состоит из консервативной части, размером около 180 а.о., и слабо консервативных N- и C-концевых последовательностей, длина которых незначительна у архей. Консервативная часть представлена двумя TBP-доменами, образующими симметричную, седлообразную структуру, вогнутая часть которой сформирована -листом, составленным из 10-ти -тяжей, и участвует во взаимодействии с ДНК; внешняя поверхность этой структуры составлена из 4-х -спиралей, и участвует во взаимодействии с белковыми факторами. Несмотря на консервативность этого домена между археями и эукариотами, его гомологов не обнаруживается у бактерий, однако подобные /-структуры, соответствующие единичному TBP-домену, представлены среди некоторых бактериальных нуклеаз (РНКаза HIII) и ДНК-гликозилаз (Рисунок 1). Согласно современным представлениям TBP возник в результате дупликации подобной структуры [25].
TBP с помощью набора гидрофобных аминокислот -листа связывает содержащую ТАТА-бокс малую бороздку ДНК, при этом два набора консервативных фенилаланинов вклиниваются между двумя цепями внутри сайта TATA, приводя к изгибу ДНК примерно на 90 градусов (Рисунок 2) [26]. Вследствие этого, после сборки ПИК, ДНК оборачивается вокруг РНК-пол, сближая точку начала транскрипции и активный центр. Транзиентность ассоциации TBP с ДНК возможно связана с более кислым аминокислотным составом по сравнению с эукариотическими гомологами [27]. Взаимодействие с TFB стабилизирует данный процесс и является необходимым для некоторых TBP архей [21].
TFB
Общий фактор транскрипции TFB архей является гомологом TFIIB эукариот и -факторов бактерий [29]. Однако, в то время как TFB и TFIIB имеют значительное сходство по аминокислотной последовательности и структуре, при сравнении с -факторами обнаруживается в основном лишь структурное и топологическое сходство (Рисунок 3). Первые данные о структуре TFIIB были получены при обработке белка протеазами, согласно которым TFIIB состоит из неустойчивого к протеазам N-конца и устойчивого C-домена [30].
Согласно современным данным рентгеноструктурного анализа N-конец включает в себя B-цинковую ленту (B-ribbon) и B-палец, который подразделяют на B-ридер (B-reader) и B-линкер (B-linker); C-концевой домен, также называемый кором, составляет примерно 2/3 белка и представлен двумя повторами, каждый из которых состоит из 5 -спиралей (называемых BH1-BH5 для первого повтора и BH1`-BH5` для второго) и имеет циклиноподобную третичную структуру (циклиновый фолд). Структуры, полученные для комплекса TBPFIIB-РНК-пол II на промоторной ДНК, позволили определить функции данных участков. TFIIB взаимодействует с докинг-доменом РНК-пол II с помощью B-ленты; B-ридер, располагающийся рядом с каналом выхода РНК и активным центром, участвует в выборе сайта начала транскрипции, B-линкер контактирует с доменами «зажим» и «руль» полимеразы и участвует в плавлении ДНК, коровые повторы взаимодействуют с двумя участками ДНК с обеих сторон от TATA-бокса (первый повтор с BRE, второй повтор с PPE (promoter proximal element)), TBP и контактируют с доменом «стенка» полимеразы [31]. Взаимодействия с BRE и PPE определяют направление транскрипции. Образующийся транскрипт упирается в B-палец, создавая напряжение в комплексе, достаточное для его диссоциации.
TFE
TFE архей – это общий фактор транскрипции, состоящий из двух субъединиц TFE и TFE (Рисунок 4), каждая из которых содержит WH (winged HTH) мотив, широко представленный среди транскрипционных факторов прокариот, и наиболее близкий к семейству MarR бактерий [25]. Для данных мотивов археального TFE показана способность неспецифически связывать одноцепочечную ДНК [32]. Другой структурной частью этого фактора являются домены «цинковая лента», которые способствуют ассоциации TFE с доменом «зажим» РНК-пол. Согласно современным данным [33], TFE, ассоциируясь с полимеразой, способствует конформационным изменениям в домене «зажим», приводящим к его открытию, а также связывает одноцепочечную ДНК образующуюся при плавлении промотора, тем самым препятствуя схлопыванию «транскрипционного пузыря» [23]. Предположительно, изначальная функция TFE – компенсировать мутации или отсутствие B-пальца у некоторых TFB факторов архей, а также способствовать поддержанию «транскрипционного пузыря» при нефизиологических для гипертермофилов температурах [23].
Регуляция инициации
Несмотря на схожесть базового транскрипционного аппарата у архей и эукариот, регуляция инициации транскрипции у архей аналогична регуляции у бактерий; геномы архей могут содержать множество паралогов TBP и TFB, каждый из которых, или комбинация TBPFB, может быть специализирован в транскрипции определённой сети генов, экспрессия которых требуется в данных физиологических условиях, или функционально дублировать друг друга, что напоминает систему -факторов бактерий. Механизмы работы транскрипционных факторов также схожи – имеются репрессоры, блокирующие последовательности корового промотора или взаимодействующие с компонентами ПИК и препятствующие их ассоциации. Активаторы могут стабилизировать транзиентные взаимодействия TBP и TFB с ДНК [21].
Комплексы ремоделирования хроматина
Отличительной особенностью эукариот является плотная упаковка ДНК за счёт образования нуклеосом – гистоновых октамеров, состоящих из тетрамера гистонов H2A, H2B и двух гетеродимеров гистонов H3, H4, вокруг которых оборачивается около 147 пар нуклеотидов ДНК. Дальнейшая компактизация возможна за счёт связывания с гистоном H1, замыкающим участки ДНК на входе и выходе от нуклеосомы [69]. Нуклеосомы как структурный компонент хроматина появляются ещё у архей, однако, в отличие от архей, у эукариот гистоны являются основными белками регулирующими степень компактизации ДНК, стабильно образуют октамеры, и имеют дополнительные N-концевые последовательности аминокислот – гистоновые «хвосты», посттрансляционные модификации которых влияют на прочность ассоциации гистонов с ДНК, возможность передвижения нуклеосом по нити ДНК, необходимы для митотической конденсации хроматина, а также могут служить метками для привлечения регуляторов транскрипции [70]. Плотность, распределение, модификации и динамика обмена нуклеосом на ДНК влияет на все процессы, связанные с хроматином, – репликацию, репарацию и экспрессию генов, поскольку влияет на доступность последовательностей для транскрипционных факторов и привлечение необходимых комплексов [71].
В настоящее время описаны три основных механизма, регулирующих организацию хроматина. Содержащие АТФазный домен мультисубъединичные комплексы способны активно перемещать и заменять нуклеосомы используя энергию гидролиза АТФ [72] (Рисунок 13). Модифицирующие гистоны комплексы способны ацетилировать, фосфорилировать, убиквитинилировать, сумоилировать и полиАДФ-рибозилировать гистоновые хвосты, изменяя структурную конфигурацию, заряд и другие характеристики гистонов. Наконец, для позвоночных животных охарактеризовано метилирование цитозина в парах CpG-нуклеотидов ассоциированное с более плотной представленностью нуклеосом и репрессированным состоянием генома [73].
Каталитические субъединицы комплексов ремоделирования состоят из АТФазного домена, окружённого некоторым набором других доменов, в зависимости от которых ремоделирующие комплексы делят на 4 семейства – SWI/SNF, CHD, ISWI и INO80. АТФазный домен включает две тандемных RecA-подобных структуры DExx и HELICc, содержащие консервативные последовательности, обнаруживаемые обычно в хеликазоподобных белках[75]. Дополнительные домены, такие как bromo- и chromo-домен, являются доменами, способными взаимодействовать с посттрансляционными модификациями гистонов и хроматином [76].
Семейство SWI/SNF характеризуется наличием на N-конце каталитической субъединицы домена HSA (helicase-SANT), который, согласно [77], способен связывать актиноподобные белки ядра, а также наличием на C-конце bromo-домена, способного связывать ацетилированные лизины гистонов [78]. Ремоделирующие комплексы этого семейства способны перемещать или удалять гистоновый октамер с ДНК, но не способны осуществлять загрузку ДНК на октамеры, и обычно представляют собой большие, мультисубъединичные комплексы из 8-ми и более компонентов.
Семейство ISWI (Imitation SWItch) имеет со стороны C-конца примыкающие друг к другу домены SANT и SLIDE, которые вместе формируют структуру, способную связывать ДНК и немодифицированные «хвосты» гистона H4 [72]. Известно несколько ремоделирующих комплексов у D. melanogaster, в которые входит каталитическая субъединица ISWI, это такие комплексы как NuRF, CHRAC, ACF и RSF. Дополнительные субъединицы этих комплексов содержат домены, способные взаимодействовать с гистонами, в том числе с гистоновыми метками. Многие комплексы ISWI-семейства осуществляют загрузку ДНК на нуклеосомы, контролируют чёткое позиционирование нуклеосом и участвуют в образовании более компактизованных форм хроматина; в целом, за исключением NuRF-комплекса, для которого характерно участие в активации транскрипции, комплексы этого семейства вовлечены в процессы репрессии транскрипции.
Семейство CHD (Chromodomain-Helicase-DNA binding) характеризуется наличием двух тандемных chromo-доменов на N-конце АТФазной субъединицы. Дополнительные структурные мотивы позволяют разделить это семейство на три подсемейства – CHD1, Mi-2 и CHD7 [79]. Подсемейство CHD1 содержит C-концевой ДНК-связывающий домен, преимущественно связывающий AT-богатые последовательности in vitro [80], и необходимый для ремодулирующей активности комплексов этого подсемейства [81]. АТФазные субъединицы Mi-2 подсемейства имеют на N-конце два PHD (plant homeodomain)-домена, участвующих в связывании с нуклеосомами [82]. Наконец, CHD7-подсемейство включает дополнительный, C-концевой, SANT- или BRK-домен. АТФазные субъединицы данного семейства могут существовать как мономеры in vivo, однако часто они формируют мультисубъединичные комплексы вовлечённые в различные биологические процессы [83]. Наиболее изученным является ремоделирующий комплекс NuRD (nucleosome remodeling and deacetalase), содержащий у D. Melanogaster АТФазную субъединицу Mi-2, гистоновую деацетилазу Rpd3, и белки p55, MBD-like, MTA-like и Simjang [84]. Для данного комплекса показано участие в репрессии дифференцировочных генов во время эмбрионального развития [83,85]. Семейство INO80 (inositol requiring 80) характеризуется наличием вcтавки в АТФазном домене, которая не препятствует каталитической функции, и служит площадкой для ассоциации RuvB-подобных белков, формирующих двойной гексамер, обладающий АТФ-зависимой ДНК-хеликазной активностью. Комплексы INO80 обычно обнаруживаются в процессах, требующих хеликазной и нуклеосоморемоделирующей функций, таких как репликация, гомологичная рекомбинация, репарация [86]. Однако для таких комплексов также показана способность перемещать, удалять и вводить нуклеосомы, в частности содержащие гистоны H2A.Z/H2B, обогащённые в промоторных областях активных генов, влияя таким образом и на транскрипцию [87]. Комплексы семейства INO80 также могут быть вовлечены в механизмы регуляции генов развития [88].
Экспрессия длинной изоформы trf2 p175 более эффективно восстанавливает функции удаленного trf2 гена, чем экспрессия короткой изоформы trf2 p75
Несмотря на значительное количество работ, посвящённых TRF2, функциональное отличие длинной изоформы от короткой оставалось невыясненным. Для решения этой задачи была создана платформа, позволяющая заменить эндогенный ген trf2 на его различные производные, в том числе на последовательности, приводящие к формированию мРНК только для длинной и только для короткой изоформ. Используемый для этого подход (см. раздел 2.13, материалы и методы) заключается в делеции кодирующей белок последовательности и её одновременной замене на последовательность attP для сайт-специфической интеграции и ген репортерного флуоресцентного белка mCherry за счёт вносимых Cas9 двух двуцепочечных разрывов и гомологичной рекомбинации с вводимой матрицей. Для делеции trf2 мишени для Cas9 располагались в интроне перед кодирующими экзонами и в 3`НТР, на расстоянии 6,7 т. п. н. (Рисунок 21).
Полученная делеция, изначально идентифицируемая по флуоресценции mCherry, была верифицирована с помощью ПЦР с праймерами к близлежащим к встройке геномным участкам и к самой интегрированной репортерной конструкции с attP сайтом. Мухи, содержащие делецию были скрещены с балансёрной по первой хромосоме линией FM0, т.к. ген trf2 расположен на X хромосоме
Как и ожидалось, делеция кодирующей части гена trf2 приводила к эмбриональной летальности гемизиготных самцов trf2{attP} /Y и гомозиготных самок trf2{attP} /trf2{attP}. Однако гетерозиготные самки trf2{attP} /FM0 имели нормальный фенотип и жизнеспособность, что повторяет фенотип некоторых ранее описанных мутаций по гену trf2 [150].
Для выяснения функционального различия короткой и длинной изоформ белка TRF2 было создано две конструкции для C31-опосредованной интеграции по attP-сайту. Конструкции содержали акцепторный сплайс-сайт интрона trf2 (по которому ранее происходил 5` разрыв), кодирующие части короткой (trf2 p75) или длинной (trf2 p175 ) изоформ гена trf2, а также сигнал полиаденилирования из вируса SV40 (Рисунок 22). События встройки детектировались с помощью репортерного гена white и верифицировались ПЦР.
При интеграции длинной изоформы, даже при нахождении в интроне перед кодирующей частью trf2 p175 двух репортерных генов mCherry и white, наблюдалось полное восстановление активности гена trf2. Мухи имели нормальную жизнеспособность и фенотип. Таким образом, длинная изоформа TRF2p175 может полностью компенсировать инактивацию гена trf2.
При интеграции короткой изоформы не происходило полного восстановления функции TRF2 в случае нахождения в интроне перед кодирующей частью репортерных генов. Встройка данной конструкции приводила к нерасхождению хромосом во время мейоза, феномену, описанному для слабых мутаций в регуляторной области гена trf2 [51]. Фенотипически это проявлялось повышенной эмбриональной летальностью, появлением самок с генотипом XX/Y, и, как следствие, наблюдаемому низкому количеству самцов относительно самок (около 5%). При этом как самки, так и самцы, имели нормальную выживаемость и фенотип. При удалении репортерных генов из интрона с помощью Cre-опосредованной рекомбинации loxP сайтов происходило полное восстановление функции гена, что согласуется с известными данными о способности обеих изоформ TRF2 компенсировать мутацию гена при оверэкспрессии под промотором гена Su(Hw) [53], а также с тем, что что обе изоформы TRF2 могут привлекаться на одни и те же модельные промоторы [6,56] и одинаково представленны на политенных хромосомах [53].
Очевидно, что стимулируемая актиновым промотором транскрипция репортерных генов mCherry и white в интроне trf2 снижает экспрессию интегрируемой конструкции. Однако, различие двух изоформ TRF2, p75 и р175, экспрессирующихся под собственными промоторами и в нативном геномном окружении, в способности восстановления делеции гена проявляются именно при сниженной экспрессии. Фенотип, наблюдаемый при сниженном количестве TRF2p75, объясняется нарушением в системе регуляции экспрессии перицентромерных и теломерных транспозонов, вовлечённых в поддержание организации хромосом [3,51,52]; хотя TRF2 участвует во множестве функциональных систем, данная система, по-видимому, является наиболее чувствительной к количеству и изоформе TRF2. Способность сниженного количества TRF2p175 так же компенсировать делецию, как и физиологически нормальное количество короткой изоформы TRF2p75 предполагает, что неконсервативная N-концевая часть взаимодействует с ДНК-связывающими белками, образуя более стабильный преинициаторный комплекс, и/или обладает дополнительной активирующей способностью.
Мотивы для связывания Opbp обладают энхансер-блокирующей активностью
Ещё одним свойством, характерным для архитектурных белков, является способность блокировать взаимодействие энхансера и регулируемого им промотора при размещении нескольких сайтов связывания архитектурного белка между ними. Для того, чтобы определить способен ли Opbp блокировать энхансер-промоторные взаимодействия была использована модельная система, описанная ранее в [172,173]. Она представляет собой трансгенную конструкцию, содержащую репортерные гены yellow (проявляется в тёмной пигментации кутикулы и её производных) и white (проявляется в красной пигментации глаз), а также три энхансера: (w) и (b) – крыловой (wing blade) и кутикулярный (body cuticle) энхансеры гена yellow соответственно, а также (e) – глазной (eye) энхансер гена white, фланкированный frt-сайтами и расположенный между (w) и (b) на расстоянии -1870 п. н. от точки инициации транскрипции гена yellow. Шесть сайтов связывания для Opbp (Opbpx6), фланкированные loxP-сайтами, были включены в конструкцию между энхансерами и стимулируемыми ими промоторами, на расстоянии -893 п.н. от точки инициации транскрипции гена yellow (Рисунок 45 А).
Три независимых линии мух, содержащих трансгенную конструкцию, были получены аналогично линиям, описанным в разделе 3.16, и имели слабую экспрессию репортерных генов. Удаление энхансера (e) с помощью Flp-опосредованной рекомбинации приводило к ещё большему уменьшению пигментации глаз, что свидетельствует о том, что экспрессия репортерных генов, стимулируемая энхансерами, блокируется сайтами Opbpx6 не полностью. Однако удаление Opbpx6-сайтов с помощью Cre-опосредованной рекомбинации значительно усиливало экспрессию репортерных генов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в данной модельной системе сайты связывания Opbp лишь частично блокируют действие энхансеров на экспрессию стимулируемых генов.
Из [174,175] известно, что расположение опосредующих дистанционные взаимодействия элементов по обе стороны от энхансера, а не только между энхансером и промотором, может приводить к значительному усилению энхансер-блокирующего эффекта за счёт выпетливания энхансер-содержащего участка генома. Чтобы окончательно подтвердить способность Opbp к установлению дистанционных взаимодействий, была использована модельная система, сходная с описанной выше, однако содержащая только репортерный ген white и его энхасер (e), окружённый двумя группами сайтов Opbpx6, каждая из которых, в свою очередь, фланкирована последовательностями frt или loxP, для возможности их независимого удаления (Рисунок 45 Б).
Из полученных 5 независимых линий мух, несущих трансгенную конструкцию, одна линия имела оранжевую (Or), две линии бледно-жёлтую (pY) и одна линия тёмно-жёлтую (dY) пигментацию глаз, обусловленную эффектом положения при встройки трасгена. При вырезании группы сайтов Opbpx6, расположенных снаружи от энхасера (e), происходило частичное усиление экспрессии во всех трансгенных линиях до коричневой (Br) (3 линии) и тёмно-оранжевой (dOr) (2 линии) пигментации. В то же время, удаление группы сайтов Opbpx6, расположенных между глазным энхансером и промотором гена white приводило к полному восстановлению взаимодействия энхасера (e) с регулируемым им промотором, и пигментации, варьирующей от красной (R) до тёмно-оранжевой (dOr). Данные результаты подтверждают способность белка Opbp опосредовать контакты между элементами генома.