Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Мультифункциональный белок YB-1 11
1.1 Краткая история открытия Y-бокс-связывающих белков 11
1.2 Структурно-функциональная организация белка YB-1 12
1.3 Обзор функций YB-1 в организме 15
1.4 Функции YB-1 в цитоплазме
1.4.1 Упаковка мРНК и её стабилизация 16
1.4.2 Регуляция трансляции 19
1.4.3 Участие в формировании цитоплазматических гранул 23
1.5 Функции YB-1 в ядре 25
1.5.1 Транскрипция 25
1.5.2 Репарация ДНК 31
1.5.3 Сплайсинг пре-мРНК 1.6 Секреция YB-1 и функции внеклеточного белка 34
1.7 Регуляция ядерно-цитоплазматического распределения YB-1 36
1.8 Роль YB-1 в онкологических заболеваниях человека 1.8.1 YB-1 как прогностический маркер при онкологических заболеваниях 39
1.8.2 YB-1 как фактор лекарственной устойчивости раковых клеток 41
1.8.3 YB-1 в развитии онкологических заболеваний 42
2. Химиотерапия в лечении онкологических заболеваний 46
2.1 Доксорубицин 47
2.2 Этопозид 49
Материалы и методы 52
1. Генетические конструкции 52
2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 55
3. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК 55
4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli 55
5. Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli 56
6. Обработка плазмид эндонуклеазами рестрикции 57
7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 57
8. Лигирование ДНК 58
9. Электрофорез ДНК в агарозном геле 10. Получение радиоактивно меченной ДНК 58
11. Обработка ДНК доксорубицином 59
12. Анализ изменения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (гель-шифт) 59
13. Связывание на фильтрах 60
14. Выделение рекомбинантного YB-1 и его мутантных форм из E. coli 60
15. Выделение белков GST и GST-NLS 61
16. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS 62
17. Иммунологический анализ препаратов белков (иммуноблоттинг) 62
18. Расщепление YB-1 20S протеасомой in vitro 63
19. Коиммунопреципитация YB-1 и 20S протеасомы 63
20. Масс-спектральный анализ продуктов расщепления YB-1 20S протеасомой 64
21. Поддержание клеточных культур 64
22. Трансфекция клеток генетическими конструкциями 65
23. Получение NIH3T3, стабильно синтезирующих HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219) 65
24. Получение клеточных, цитоплазматических и ядерных экстрактов 66
25. Иммунофлуоресцентная микроскопия 67 26. Построение кривых роста клеточных линий 67
27. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла 68
28. Тест на клоногенность 68
29. Обработка клеток доксорубицином 68
30. Анализ транскриптома 69
31. Пул-даун YB-1 с компонентами репарационных комплексов 34. Модельная система для изучения ядерного импорта белков in vitro 70
35. Получение цитоплазматического экстракта клеток HeLa для модельной системы ядерного импорта белков in vitro 71
Результаты 72
1. Определение места связывания YB-1 с 20S протеасомой 72
2. Расщепление YB-1 20S протеасомой происходит в соответствии с моделью шпильки 74
3. В молекуле YB-1 есть два альтернативных сайта расщепления 20S протеасомой 75
4. Укороченная форма белка YB-1 не влияет на пролиферацию клеток, но защищает их от повреждающего действия доксорубицина 78
5. Устойчивые к расщеплению 20S протеасомой формы YB-1 не защищают клетки от действия доксорубицина 82
6. Укорочения YB-1 под действием 20S протеасомы достаточно для его перехода в ядро 83
7. Укороченный и полноразмерный YB-1 по-разному изменяют профиль экспрессии генов 85
8. Укороченный белок YB-1 входит в состав ДНК-репарационных белковых комплексов 88
Обсуждение результатов и заключение 91
Выводы 96
Список литературы
- Упаковка мРНК и её стабилизация
- Этопозид
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- Масс-спектральный анализ продуктов расщепления YB-1 20S протеасомой
Упаковка мРНК и её стабилизация
Совсем недавно были опубликованы данные по картированию мест посадки YB-1 на мРНК в клетках U251-MG методом iCLIP (individual nucleotide-resolution crosslinking immunoprecipitation) с последующим глубоким секвенированием (Wu et al., 2015). Было установлено, что более 90% идентифицированных сайтов связывания приходится на мРНК кодирующих генов, при этом 51% этих сайтов находится в 3 -НТО, а 36% – в кодирующих областях мРНК. Сайты связывания YB-1 были обнаружены в большинстве транскриптов (15000 кодирующих генов). Авторам также удалось установить сайт, с которым YB-1 ассоциирован чаще прочих – UYAUC. Около 20% всех исследованных мест связывания YB-1 содержат эту последовательность. Эти данные хорошо согласуются с моделью, объясняющей селективность YB-1 в отношении мРНК: относительно небольшая разница в аффинности связывания специфичных и неспецифичных сайтов многократно усиливается его кооперативностью. В результате, сайты специфичной посадки YB-1 выступают в качестве затравки для мультимеризации белка на мРНК, которая заканчивается формированием насыщенных комплексов (Kretov et al., 2015). Возможно, последовательность UYAUC как раз и представляет собой такую затравку.
Известно несколько мРНК, трансляция которых специфично регулируется YB-1. Участки связывания YB-1 были обнаружены в G/C-богатой 5 -НТО мРНК TGF, в 3 -НТО мРНК YB-1 и (+)-цепи РНК вируса Денге (Skabkina et al., 2003; Skabkina et al., 2005; Paranjape and Harris, 2007; Jenkins et al., 2010; Lyabin et al., 2011). Во всех случаях YB-1 ингибирует трансляцию соответствующих мРНК при достаточно низкой концентрации, которая ещё не ингибирует тотальный биосинтез белка (Lyabin et al., 2014). YB-1 стимулирует трансляцию мРНК компонента стресс-гранул G3BP, взаимодействуя с её 5 -НТО (Somasekharan et al., 2015).
Изучен интересный механизм регуляции трансляции мРНК ферритина, в котором YB-1 выступает в качестве положительного регулятора трансляции. Эта мРНК содержит шпильку IRE (iron-responsive element) в 5 -НТО, с которой в условиях низкой концентрации железа связан белок IRP-2 (iron regulatory protein), при этом её трансляция заингибирована. При высокой концентрации железа YB-1 связывается с окисленной формой IRP-2 и предотвращает его взаимодействие мРНК, в результате чего активируется трансляция мРНК ферритина (Ashizuka et al., 2002).
YB-1 может стимулировать инициацию трансляции по механизму внутренней посадки рибосомы на IRES-элементы (internal ribosome entry segment). Судя по всему, белок стимулирует IRES-зависимую трансляцию при достаточно высокой концентрации, которая несовместима с активной кэп-зависимой трансляцией (Evdokimova et al., 2009; Lyabin et al., 2014). По такому механизму YB-1 контролирует трансляцию мРНК протоонкогенов семейства Myc и регулятора эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) Snail 1 (Cobbold et al., 2008; Evdokimova et al., 2009; Cobbold et al., 2010; Bommert et al., 2013).
YB-1 обнаружен в двух типах РНК-содержащих цитоплазматических гранул: в тельцах процессинга (PB, processing bodies) и стресс-гранулах (SG, stress granules).
Тельца процессинга – это места деградации и хранения мРНК в цитоплазме. В их состав входит собственно мРНК, факторы трансляции, РНК-связывающие белки и белки, вовлеченные в деградацию мРНК: Xrn1, DCP1/DCP2, Hedls/GE-1, Lsm1, SMG5, SMG7, UPF1, GW182, RISK, Ago2 и другие (Kedersha and Anderson, 2007). Тельца процессинга присутствуют в клетках в нормальных условиях роста, но их количество увеличивается при стрессовых воздействиях на клетку.
Стресс-гранулы – это места хранения мРНК в цитоплазме. Они образуются в неблагоприятных для трансляции условиях (при тепловом шоке, окислительном стрессе и пр.) и содержат преинициаторные комплексы, РНК-связывающие белки и другие компоненты. Предполагается, что в составе этих гранул мРНК защищена от действия рибонуклеаз и находится там до окончания неблагоприятных для клетки условий (Kedersha and Anderson, 2007). Тельца процессинга и стресс-гранулы могут обмениваться компонентами.
Было показано, что YB-1 присутствует в тельцах процессинга в клетках карциномы Hep-2 (Yang and Bloch, 2007). Для локализации в составе этих телец необходимы A/P-домен, CSD и фрагмент CTD (205–281). В условиях окислительного стресса, вызванного солями мышьяка, YB-1 перемещается из телец процессинга в стресс-гранулы. Для этого важен фрагмент CSD (44–128). При возвращении к нормальным условиям роста YB-1, в отличие от белка RAP55, который быстро перемещается обратно в тельца процессинга, некоторое время остаётся в стресс-гранулах, где предположительно участвует в запуске трансляции.
Несколько групп исследователей показали важность YB-1 для формирования стресс-гранул. Во-первых, YB-1 принимает участие в образовании стресс-гранул, опосредованном производными тРНК, индуцированными стрессом (tiRNA) (Ivanov et al., 2011; Ivanov et al., 2014). tiRNA образуются при расщеплении тРНК РНКазой ангиогенином по антикодоновой петле. Некоторые 5 -фрагменты расщеплённых тРНК, например 5 iRNAAla, в комплексе с YB-1 вытесняют eIF4F с мРНК и вызывают глобальное подавление трансляции и формирование стресс-гранул. Во-вторых, YB-1 стимулирует трансляцию мРНК ключевого компонента стресс-гранул G3BP (Somasekharan et al., 2015). В-третьих, стесс-гранулы первоначально формируются в виде многочисленных, но мелких структур, которые быстро сливаются в более крупные. Процесс слияния протекает активно и требует участия микротрубочек. YB-1 предположительно может локализовать мРНП стресс-гранул на микротрубочках за счёт взаимодействия с тубулином (Chernov et al., 2009).
С другой стороны, есть данные и о негативном влиянии YB-1 на формирование стресс-гранул. Недавно была предложена новая гипотеза, описывающая роль РНК-связывающих белков в образовании стресс-гранул (Bounedjah et al., 2014). Согласно ей, первым последствием стрессового воздействия на клетку является массовая диссоциация полисом. При этом высвободившаяся мРНК оказывается в избытке по отношению к мРНК-стабилизирующим белкам типа YB-1. В результате с ней могут связываться белки, склонные к агрегации, такие как TIA-1, и неправильно свёрнутые белки, что инициирует формирование стресс-гранул. YB-1 может препятствовать этому процессу, образуя изолированные мРНП, не склонные к агрегации. Эта гипотеза подтверждается тем, что оверэкспрессия YB-1 в клетках почки крысы и клетках NG108-15, обработанных солями мышьяка, приводит к снижению количества
Этопозид
В работе использовали штаммы E. coli DH5 и BL21 (DE3) pLysS. Для получения компетентных клеток бактерии сеяли на чашки Петри с агаризованной средой LB (10 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 1 мМ NaОН, 1,5% агара). Через 16 часов колонию переносили в 100 мл среды LB, клетки культивировали до достижения A590 0,35-0,4. Клетки переносили в стерильные пробирки и охлаждали до 0С инкубацией на льду в течение 15 минут. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в 30 мл 0,1 М CaCl2 и инкубировали 30 минут на льду. Клетки повторно осаждали центрифугированием и ресуспендировали осадок в 4 мл 0,1 М CaCl2, 15% глицерина. Стерильными носиками переносили по 100 мкл суспензии в стерильные микроцентрифужные пробирки и замораживали в жидком азоте. Хранили компетентные клетки при - 80С.
Компетентные клетки E. coli, полученные по методике, описанной в п. 2 раздела «Материалы и методы», размораживали на льду, добавляли 100 нг плазмидной ДНК или 20 мкл лигазной смеси (п. 8 раздела «Материалы и методы») и инкубировали 40 минут на льду. Затем клетки подвергали тепловому шоку: 42С в течение 2 минут. После этого клетки быстро переносили на лёд на 1-2 минуты, добавляли 1 мл среды LB и инкубировали 40 минут при 37С при постоянном покачивании. Клетки собирали центрифугированием в настольной микроцентрифуге при 13200 об/мин в течение 15 секунд, сливали надосадочную жидкость, оставляя примерно 100 мкл. Осадок клеток ресуспендировали и сеяли на чашки Петри, содержащие агаризованную среду LB с 0,1 мг/мл ампициллина. Колонии анализировали через 12-16 часов.
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса. Клетки E. coli DH5, трансформированные соответствующей плазмидой, выращивали в течение 12-16 часов в 250 мл среды LB с 0,1 мг/мл ампициллина при 37С при постоянном покачивании. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут при 4С в роторе JA-14 (Beckman), ресуспендировали в 6 мл раствора, содержащего 25 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 15% сахарозы, 10 мг/мл лизоцима (AppliChem), и инкубировали на льду в течение 20 минут. К лизату клеток добавляли 12 мл свежеприготовленного раствора 0,2 М NaOH, 1% SDS, осторожно перемешивали и инкубировали 5 минут. Затем добавляли 7,5 мл ледяного раствора 3 М NaCH3COO (рН 5,2), перемешивали и инкубировали на льду в течение 20 минут. Клеточный дебрис и хромосомную ДНК осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в роторе AC 100 (Thermo Electron Corporation) в течение 15 минут при 4С. Супернатант переносили в пластиковую пробирку, плазмидную ДНК осаждали добавлением двух объёмов 96% этанола, инкубировали в течение 1 часа при -80С. Осадок собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, растворяли в 1 мл деионизированной воды. Затем добавляли 20 мкл раствора РНКазы А (10 мг/мл) (USB). Смесь инкубировали в течение 2-6 часов при 37С. Депротеинизацию плазмидной ДНК проводили двукратной обработкой смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1. Затем ДНК осаждали добавлением 1/10 объёма 3 М NaCH3COO (рН 5,2) и двух объёмов 96% этанола в течение 1 часа при -80С. Осадок собирали центрифугированием в настольной микроцентрифуге (Eppendorf) при 14500 об/мин в течение 15 минут при 4С и растворяли в 100 мкл деионизированной воды. Для повторного осаждения плазмидной ДНК к раствору добавляли NaCl до 0,8 М и полиэтиленгликоль-6000 до 6,5%, 40 минут инкубировали на льду. Осадок собирали центрифугированием при 13200 об/мин в течение 20 минут при 4С и растворяли в деионизированной воде. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, принимая, что 1 о.е. А260 соответствует 50 мкг ДНК в 1 мл.
Клетки E. coli трансформировали лигазной смесью (п. 8 раздела «Материалы и методы») и высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина и инкубировали при 37С. Через 12-16 часов отдельные колонии пересевали в 2 мл жидкой среды LB с ампициллином (0,1 мг/мл) и растили ещё 12-16 часов. Клетки из 1,5 мл жидкой культуры осаждали центрифугированием при 13200 об/мин в течение 15 секунд. Надоосадочную жидкость сливали, оставив 50-100 мкл, клетки суспендировали на шейкере (Vortex). Добавляли 300 мкл раствора состава 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,1 М NaOH, 0,5% SDS, перемешивали, 5 минут инкубировали на льду. Добавляли 150 мкл 3 М NaCH3COO (рН 5,2), перемешивали, центрифугировали для отделения хромосомной ДНК и дебриса при 14500 об/мин в течение 5 минут при 4С. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку, добавляли два объёма 96% этанола, перемешивали, инкубировали 5 минут при -20С. Осадок собирали центрифугированием при 14500 об/мин в течение 10 минут при 4С. Осадок дважды промывали 70% этанолом, высушивали, растворяли в 20 мкл буфера ТЕ с РНКазой А (10 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 1 мМ ЭДТА, 0,1 мкг/мкл РНКазы А).
Реакционная смесь объёмом 15 мкл содержала 5 мкг плазмидной ДНК, 1x буфер для эндонуклеазы рестрикции (Fermentas) и 5 ед. соответствующей эндонуклеазы (Fermentas). Смесь инкубировали в течение 2 часов при температуре, оптимальной для работы фермента. ДНК высаживали добавлением NaCH3COO (pH 5,2) до конечной концентрации 0,3 М и двух объёмов 96% этанола, инкубировали 2 часа при -80С. Осадок плазмидной ДНК собирали центрифугированием при 14500 об/мин в течение 15 минут при 4С, промывали 3 раза 70% этанолом, а затем растворяли в требующемся объёме деионизированной воды.
ПЦР проводили в 20 мкл буферного раствора 20 мМ Tris-HCl (pH 8,8), 10 мМ KCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100, 1 мг/мл БСА (Fermentas) с добавлением 5 нг ДНК-матрицы, 20 пкмоль соответствующих 5 - и 3 -концевых праймеров, по 0,25 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата и 0,3 ед. Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas). Для каждой пары праймеров проводили оптимизацию по содержанию MgSO4 в реакционной смеси (0-2,5 мМ). В качестве ДНК-матрицы для получения мутантных генов YB-1 использовали ген YB-1 дикого типа из плазмиды pET3-1-YB-1. Реакцию проводили в следующих условиях: первичная денатурация - 3 минуты при 94С, а затем 25 циклов: отжиг праймеров - 1 минута при 50С, элонгация - 3 минуты при 72С, денатурация - 40 секунд при 94С. После окончания последнего цикла полимеризации в реакционную смесь добавляли 2 мкл 10х буфера для образцов, продукты реакции разделяли в 1% геле агарозы. Продукт ПЦР необходимого размера выделяли из геля агарозы набором DNA Extraction Kit (Fermentas) в соответствии с протоколом фирмы. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, принимая, что 1 о.е. А260 соответствует 50 мкг ДНК в 1 мл.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Мультифункциональный белок YB-1 принимает участие во множестве ДНК-и РНК-зависимых процессов в клетках млекопитающих. Исследование его биологии представляет большой интерес с фундаментальной точки зрения. Во многих работах было показано участие белка в формировании и развитии злокачественных опухолей. Известно, что YB-1 может стимулировать пролиферацию некоторых типов клеток, рост без контакта с подложкой, миграцию клеток и метастазирование опухолей (Eliseeva et al., 2011; Lasham et al., 2013). Кроме того, YB-1 является важным фактором в формировании устойчивости раковых клеток к лекарственным препаратам, которая является частой причиной неэффективности химиотерапии (Inoue et al., 2012). В свете последних открытий, представляется особенно важным, что YB-1 защищает от действия лекарств стволовые клетки, в том числе и стволовые клетки опухолей, что может быть причиной рецидивов рака (Shibahara et al., 2004; To et al., 2010). Ранее нашей группой было продемонстрировано, что ДНК-повреждающие препараты стимулируют расщепление YB-1 20S протеасомой и накопление укороченного белка в ядре клетки. Было выдвинуто предположение, что именно укороченный белок отвечает за повышенную устойчивость клеток к действию лекарств. В данной диссертационной работе мы исследовали механизм расщепления YB-1 и биологическую роль укороченного белка.
До недавнего времени было известно лишь несколько примеров ограниченного убиквитин-независимого протеолиза белков 20S протеасомой: кроме YB-1, такое расщепление было показано для предшественника p105 NF-B и факторов инициации трансляции eIF4G и eIF3a (Baugh and Pilipenko, 2004; Sorokin et al., 2005; Moorthy et al., 2006). Однако позднее в группе Пилипенко было показано что до 20% всех белков лизата ретикулоцитов кролика убиквитин-независимо расщепляются 20S протеасомой in vitro (Baugh et al., 2009). При этом во многих случаях был детектирован ограниченный протеолиз. Анализ показал, что места расщепления белков 20S протеасомой, как правило, лежат в их неструктурированных участках и что нативно неструктурированные белки являются естественными субстратами 20S протеасомы (Erales and Coffino, 2014). Наличие протяжённого практически неструктурированного C-концевого домена позволяет отнести YB-1 к категории нативно неструктурированных белков. Мы идентифицировали участок нестабильности YB-1 (PEST-мотив), который отвечает за расщепление белка 20S протеасомой, хотя и не участвует в связывании с ней. В составе PEST-мотива мы обнаружили помимо ранее известного сайта расщепления – пептидной связи между E219 и G220 – дополнительный сайт между E216 и V217. PEST-мотив лежит в середине неструктурированного C-концевого домена YB-1. Отсутствие жёсткой вторичной и третичной структуры в этой области обеспечивает сворачивание этого региона в виде шпильки, которая может проникать в полость 20S протеасомы. Таким образом, YB-1 хорошо соответствует описанию естественных субстратов протеасомы, данному Пилипенко.
Попытки исследовать биологическую роль укороченных форм YB-1 предпринимались и ранее как в нашей группе, так и в других лабораториях. Однако при этом использовались разные укороченные варианты YB-1, включая YB-1 (1–202) (Bader and Vogt, 2005), YB-1 (1–204) (Sorokin et al., 2005) и YB-1 (1– 205) (Stenina et al., 2001; Guay et al., 2008a). В то же время было показано, что присоединение всего двух дополнительных C-концевых аминокислотных остатков к YB-1 (1–205) приводит к потере его активности в качестве фактора транскрипции гена PDGFB (Stenina et al., 2001). Это указывает на важность структуры вновь сформированного C-конца молекулы YB-1 для его функций. Поэтому в данной работе мы впервые использовали фрагмент YB-1 (1–219), который соответствует продукту расщепления белка 20S протеасомой.
Мы обнаружили, что оверэкспрессия и полноразмерного, и укороченного YB-1 стимулирует выживание клеток NIH3T3, обработанных низкой концентрацией доксорубицина. Однако укороченный белок давал клеткам существенное преимущество по сравнению с полноразмерным при более высокой концентрации препарата. Более того, оверэкспрессия HA-YB-1 (1–219) была сопряжена с меньшим количеством двухцепочечных разрывов ДНК при обработке доксорубицином. Эти данные хорошо согласуются с опубликованными ранее сведениями, что YB-1 (1–205) более эффективен в защите клеток рака молочной железы от действия цисплатина, чем полноразмерный белок (Guay et al., 2008a). Также в данной работе мы показали, что внеклеточный YB-1, добавленный в культуральную среду, не влияет на выживание клеток рака молочной железы при обработке ДНК-повреждающими препаратами, что указывает на принципиальное различие в действии внутриклеточного и внеклеточного белка (Moiseeva et al., 2013a).
Исходя из факта преимущественно цитоплазматической локализации полноразмерного YB-1 и ядерной локализации YB-1 (1–219), мы предположили, что процессинг 20S протеасомой может выступать в качестве механизма, обеспечивающего быстрый переход YB-1 в ядро, где он выполняет особые функции при ДНК-повреждающем стрессе. Используя модельную систему для исследования ядерного импорта белков in vitro, мы показали, что процессинг 20S протеасомой действительно является достаточным условием для перехода YB-1 в ядро и никаких дополнительных посттрансляционных модификаций белка для этого не требуется. В соответствии c этим заключением, YB-1 терял своё защитное действие, если ферментативная активность протеасомы в клетке была заингибирована, в то время как укороченный белок продолжал действовать. Нерасщепляемые мутантные формы YB-1 также были не способны увеличить выживание клеток при ДНК-повреждающем стрессе, в отличие от белка дикого типа.
Чтобы разобраться в механизме YB-1-опосредованной устойчивости к ДНК-повреждающим препаратам, мы провели транскриптомное профилирование клеток, оверэкспрессирующих полноразмерный либо укороченный белок. Были выявлены наборы мРНК, количество которых регулируется обеими формами YB-1, а также наборы, специфичные для каждой формы. В соответствии с данными литературы, мы обнаружили, что оверэкспрессия YB-1 приводит к снижению количества мРНК -актина и CXCL1 (Kelm et al., 1999; Kelm et al., 2003; Zhang et al., 2005; Liu et al., 2009; Hanssen et al., 2013). Однако в остальном наши данные мало похожи на ранее опубликованные. Известно, что регуляция профиля экспрессии генов под действием YB-1 очень сильно зависит от типа клеток и что даже внутри одного типа наборы регулируемых мРНК могут сильно различаться. Большинство аналогичных исследований было проведено на линиях клеток рака молочной железы, лёгких, яичников и толстой кишки, поэтому их результаты плохо подходят для сравнения с полученными нами (Basaki et al., 2007; Guay et al., 2008a; Lasham et al., 2012). Однако существует одно сообщение об изменениях в транскриптоме эмбриональных фибробластов мышей, лишённых YB-1 (Lu et al., 2005). В данной работе авторы выявили только пять мРНК, количество которых изменялось более чем в два раза. Мы обнаружили, что количество двух из этих мРНК (-актина и FLT1) изменяется и в фибробластах NIH3T3 при оверэкспрессии YB-1. В целом можно заключить, что полноразмерный и укороченный YB-1 могут прямо или непрямо регулировать количество мРНК многих генов. В литературе есть противоречивые сведения о влиянии YB-1 на транскрипцию гена ABCB1, кодирующего белок множественной лекарственной устойчивости 1: по одним данным, YB-1 стимулирует транскрипцию данного гена, а по другим, не принимает в ней участия (п. 1.5.1 раздела «Обзор литературы»). Мы не обнаружили изменения количества мРНК ABCB1 ни в одном из образцов.
Масс-спектральный анализ продуктов расщепления YB-1 20S протеасомой
Фракции, содержащие наибольшее количество целевого белка, отбирали для дальнейшей очистки. К ним добавляли LiCl до концентрации 3 М и инкубировали ночь при 4С. Образцы центрифугировали 30 минут при 14500 об/мин для осаждения РНК. Препарат YB-1 дополнительно очищали хроматографией на колонке Superose 12 HR/10/30 (GE Healthcare), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 2 M NaCl. Максимальный объём наносимого образца составлял 500 мкл. Хроматографию проводили при скорости 1 мл/мин. Чистоту полученного препарата YB-1 анализировали электрофорезом.
Наиболее чистые фракции белка YB-1 объединяли, диализовали против буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl и концентрировали центрифугированием через мембрану Ultracel-10 в концентраторе Amicon Ultra-4 (Millipore). Концентрацию белка определяли с помощью набора Micro BCA (Pierce) согласно протоколу фирмы.
Клетки E. coli (штамм BL21 (DE3), pLysS) трансформировали вектором pGEX или pGEX-NLS и выращивали на среде LB до А590 0,8. Синтез GST и GST-NLS индуцировали инкубацией с 0,5 мМ IPTG в течение 3 часов. Все последующие операции проводили при комнатной температуре. Клетки собирали центрифугированием при 4000 об/мин 10 минут в роторе JA-10. Осадок клеток ресуспендировали в 15 мл фосфатного буфера (PBS) 1,7 мМ KH2PO4, 5,2 мМ Na2HPO4 и 150 мМ NaCl. Добавляли лизоцим до 1 мг/мл и инкубировали 30 минут на льду. К гомогенату добавляли MgCl2 до концентрации 10 мМ, PMSF до концентрации 0,5 мМ и 5 мкл ДНКазы I (10 мг/мл). Клетки лизировали добавлением 10 мл 0,2% водного раствора Triton X-100 на льду в течение 15 минут.
Для осаждения дебриса клеточный лизат центрифугировали 30 минут при 10000 об/мин. К супернатанту добавляли ДТТ до концентрации 1 мМ и наносили на колонку с глутатион-сефарозой 4В (Amersham), уравновешенную фосфатным буфером. Колонку промывали 10 объёмами PBS, 250 мМ NaCl. GST и GST-NLS элюировали с колонки буфером, содержащим 20 мМ HEPES (pH 7,3), 110 мМ CH3COOK, 2 мМ (CH3COO)2Mg и 15 мМ глутатиона, собирали фракции по 1,5 мл. Фракции анализировали электрофорезом.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) проводили по методу Лэмли.
Белки разделяли в полиакриламидном геле толщиной 1 мм, состоящем из двух частей: 15% нижнего разделяющего и 5% верхнего концентрирующего слоёв. Для заливки нижнего слоя (АА:МБАА=40:0,6) использовали буферный раствор состава 380 мМ Tris-HCl (pH 8,7), 0,1% SDS, 0,1% персульфата аммония (ПСА), 0,03% тетраэтилметилендиамина (TEMEД). Верхний слой содержал 126 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 5% AA, 0,13% MБАА, 0,1% SDS, 0,1% ПСА, 0,05% ТЕМЕД. Высота разделяющего слоя 70 мм, концентрирующего – 20 мм.
В препараты белка добавляли пятикратный буферный раствор для образцов до конечной концентрации его компонентов: 80 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 196 мМ 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,0012% бромфенолового синего.
Электродный буферный раствор имел состав: 1,44% глицина, 0,3% Tris-основания, 0,1% SDS. Электрофорез проводили при напряжении 100 В до выхода бромфенолового синего из геля. Гели окрашивали 0,04% Coomassie R-250 (Pierce) в 20% этаноле и 5% уксусной кислоте.
После разделения SDS-ПААГ электрофорезом белковые препараты переносили методом электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану (Whatman). Электроперенос проводили при 50 мА (для мембраны размером 710 см) в течение 40 минут в буфере состава 25 мМ Tris-HCl (рН 8,7), 90 мМ глицина, 10% изопропанола, 0,1% SDS на приборе SemiPhor для полусухого переноса (Hoefer Scientific). Для контроля качества переноса белки визуализировали 2% раствором Понсо C (Reanal) в 30% ТХУ. Для предотвращения неспецифической сорбции мембрану инкубировали в течение 30 минут при слабом покачивании в 5% растворе сухого обезжиренного молока в буфере TBS (10 мМ Tris-HCl (рН 7,6), 140 мМ NaCl, 0,05% Tween-20). Первые антитела разбавляли до рекомендованной производителем концентрации в 0,5% растворе сухого обезжиренного молока в TBS и инкубировали с мембраной при слабом покачивании в течение 16 часов при 4С или в течение 1 часа при комнатной температуре. Несвязавшиеся антитела отмывали 3 раза по 10 минут буфером TBS при покачивании со средней скоростью. Для детекции иммунокомплексов использовали соответствующие вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Promega, Sigma-Aldrich) и набор ECL (GE Healthcare) согласно рекомендациям производителей. В работе использовали антитела против YB-1 (получены в нашей группе) (Davydova et al., 1997), HA-тага, -тубулина, GST, Flag и Rad50 (Sigma-Aldrich), субъединицы 5 20S протеасомы (BioMol), PABP (любезно предоставлены N. Sonenberg), гистона H3, H2A.X и Mre11 (Abcam). 1–1,5 мкг белка YB-1 или его фрагментов инкубировали с 0,1 мкг 20S протеасомы (BioMol) в течение 1 часа при 30С. Реакцию расщепления проводили в суммарном объёме 20 мкл в буфере для расщепления: 30 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 100 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 10% глицерина (v/v). Реакцию останавливали добавлением 5 мкл пятикратного буферного раствора для образцов и анализировали SDS-ПААГ электрофорезом.
200 нг белка YB-1 (а также его фрагментов или форм с точечными мутациями) инкубировали с 200 нг 20S протеасомы (BioMol) в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ HEPES-KOH (pH 7,6), 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,25% NP-40 и 20 мкМ MG-132, в течение 30 минут при 30С. 20 мкл Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) предварительно отмывали три раза натрий-фосфатным буфером (PBS). Реакционную смесь смешивали со смолой, добавляли антитела против YB-1 и инкубировали 12 часов при 4С при постоянном помешивании. Несвязавшиеся антитела и белки трижды отмывали буферным раствором состава 10 мМ Tris-HCl (рН 7,6), 140 мМ NaCl, 0,05% Tween-20. Связанные со смолой комплексы элюировали двухкратным раствором для образцов (160 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 4% SDS, 392 мМ 2-меркаптоэтанола, 20% глицерина и 0,0024% бромфенолового синего). Белки разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и детектировали окрашиванием антителами против YB-1 и субъединицы 5 20S протеасомы.
Белки YB-1 (WT) и YB-1 (E219A) расщепляли 20S протеасомой, как описано в п. 18 раздела «Материалы и методы». После завершения реакции белки были высажены добавлением 10% трихлоруксусной кислоты (ТХУ), осадок растворён в деионизированной воде. Масс-спектральный анализ белковых препаратов был проведен в Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им. Ореховича РАМН к.х.н. М.В. Серебряковой. Масс-спектральный анализ был проведён на приборе типа MALDIOF (Reflex III, Bruker Analytic GmbH), оснащённом 337-нанометровым лазером. Поиск пептидов YB-1 среди детектированных молекул проводили с помощью программы MASCOT (Matrix Sciences).
В работе использованы клетки линий NIH3T3, Phoenix A и HeLa. NIH3T3 и Phoenix A выращивали на среде DMEM (ПанЭко) с содержанием 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone) и 1х антибиотика-антимикотика (Gybco) при постоянной температуре 37С, влажности воздуха около 100% и доле CO2 5% (v/v). Клетки HeLa выращивали в таких же условиях, но на среде DMEM/F12 (ПанЭко). По мере роста клетки периодически пересевали, предварительно обработав раствором трипсина и ЭДТА (ПанЭко) для отсоединения от пластика.