Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является возбудителем тяжелого инфекционного заболевания - синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), поразившею практически все ораны мира. По расчетам экспертов Совместной программы ООП по ВИЧ/СПИД (UNAIDS) в настоящее время более 20 млн. люден заражены или больны СПИДом, а 2 млн. жителей Земли уже умерли от тгого заболевания.
На сегодняшний день, когда в арсенале практической медицины отсутствуют эффективные средства специфической профилактики и лечения СПИДа, выявление ВИЧ-инфицированных является одним ні основных средств ограничения распространения этого заболевания.
Основным способом обнаружения ВИЧ-инфекции, применяемым в практическом здравоохранении в настоящее время является тестирование сывороток крови людей на наличие антител к белкам вируса методом твердофазного иммуноферментного анализа, с последующим подтверждением результатов методом иммуноблота. Хотя такая комбинация тестов считается достаточной для установления диагноза, несомненный интерес представляет выявление вирусного антигена, поскольку в начальной фазе инфекции или в терминальной стадии заболевания в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных людей антитела к вирусу могут не выявляться. В то же время именно в этот период в крови может быть обнаружено высокая концентрация инфекционного вируса. Поэтому в настоящее время все большее распространение, наряду с методами обнаружения антител, приобретают методы обнаружения вирусного антигена. Основным считается тест на вирусный антиген р24 (мажорный белок вирусной сердцевины - продукт экспрессии гена gag). Он служит не только для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, когда антитела еще не выявляются, но и помогает определить вероятность прогрессировання заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов, поскольку выявление антигена р24 на ранних стадиях ВИЧ-инфекции рассматривается как плохой прогностический симптом, предсказывающий развитие клинических проявлений СПИДа. Тест на выявление антигена р24 используется также для определения инфицированности детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, и при оценки эффективности антиВИЧ-терапии.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, находящихся как в составе комплекса антиген-антитело, так и в свободном состоянии в материалах от ВИЧ-инфицированных пациентов и в инфицированных культурах клеток, а также изучение возможной связи между наличием антигена р24 ВИЧ-1 и стадией заболевания у ВИЧ-инфицированных лиц из различных регионов СНГ.
Исходя из этого решались следующие задачи:
- разработка экспериментальных иммуноферментных тест-систем для определения суммарных вирусных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2;
разработка экспериментальной тест-системы для определения антигена р24 и исследование с се помощью содержания этого антигена в клиническом материале от ВИЧ-инфицированных пациентов.
обнаружение антигена р24 в составе комплекса антиген-антитело с помощью различных методов разрушения иммунных комплексов;
- анализ корреляции между наличием антигена р24 и стадиен
заболевания;
- создание панели сывороток с разным представительством антшел к
индивидуальным белкам ВИЧ методом псютения нативных сывороток
различными антигенами ВИЧ.
Научная новизна работы. Впервые показана возможность специфического выявления антигенов ВІІЧ-1 и ВІІЧ-2 с помощью тест-систем на основе поликлональных сывороток. Проанализирована коллекция и і 7 моноклональных антител к белку р24 ВІІЧ-І на возможность применения в иммуноферментной тест-системе и показана пригодность МКА NS5H4 для создания тест-системы на выявление антигена р24 В1ІЧ-І с чувствительностью 50 пг/мл. Получен патент РФ. Проведены исследования по обнаружению вирусного антигена р24 ВИЧ-1 в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных пациентов из различных регионов СНГ.
Выбран оптимальный способ выявления антигена р24 В.ЧЧ-1 в составе иммунных комплексов, пригодный для анализа клинических образцов. С использованием этого метода впервые было установлено, что частом выявления антигена р24 в сыворотках крови пациентов из различных регионов СИГ повышается на поздних стадиях ВИЧ-инфекции.
Разработаны методические подходы к получению панели положительных контрольных сывороток, используемых для оценки чувствительности тест-системы на выявление антител. В результате проведенных исследований подана заявка на Патент РФ.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработаны экспериментальные иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Тест-системы апробированы в экспериментальных условиях и показали хорошие результаты в исследованиях по контролю за вирусной репродукцией в клеточных культурах. Проведенные параллельно исследования методом непрямой иммунофлюоресцеиции подтвердили специфичность результатов, полученных методом ИФА.
Апробация экспериментальной тест-системы для выявления антигена р24 ВИЧ-1 в НИИ и центрах СПИД показала, что тест-система имеет чувствительность, достаточную для выявления вирусного антигена у бессимптомных вирусоносителей и может быть использована для контроля продукции вируса в организме в процессе лечения.
Экспериментальные тест-системы для выявления суммарных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, а также антигена р24 ВИЧ-1 использовались для оценки ингибирования репродукции вируса различными препаратами в целях поиска эффективных лекарственных средств.
Создана панель «истощенных» сывороток, содержащих антитела преимущественно к оболочечным белкам ВИЧ и характеризующихся низкими значениями оптической плотности при исследовании их в иммуноферментных тест-системах. Использование полученных сывороток позволило эффективно оценивать качество коммерческих тест-систем для определения антител.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на 2-ой Международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека» (Санкт-Петербург, 1993) и представлены на Международной конференции «Молекулярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИД» (Новосибирск, 1991), на YIII и IX Международных конференциях по СПИДу (Амстердам, 1992; Берлин, 1993), Международному конгрессу по иммунореабилитации (Сочи, 1994).
Результаты проведенных исследований отражены в 12 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков и 15 таблиц. Список литературы содержит 123 ссылки на публикации отечественных и зарубежных авторов.