Введение к работе
. Актуальность темы
Вирус гепатита Дельта (ВГД) распространен во всем мире, и на сегодня известны нуклеотидные последовательности ряда изолятов ВГД, полученных из различных географических регионов, таких как: Западная Европа, Центральная и Южная Америки, Азия, Ближний Восток. В соответствии с классификацией, предложенной J.L.Casey, большинство изолятов принадлежат к первому типу ВГД, второй тип, наряду с первым, встречается в Японии, ВГД третьего типа циркулирует в Южной Америке. Последовательности, принадлежащие к одному типу, гомологичны примерно на 94%, дивергенция между последовательностями разных типов достигает 30%. Внутри ВГД первого типа выделяются два субтипа. Субтип IA представляет азиатский субтип и включает изоляты из Японии и Тайваня. Субтип IB объединяет изоляты из Северной Америки и Франции. Тип и нуклеотидная последовательность генома ВГД, циркулирующего в России, не известны.
Клинические проявления ВГД инфекции могут колебаться от фульминангных гепатитов до бессимптомного носительства. Имеются данные, что особенности течения заболевания могут быть обусловлены генотипическими вариациями ВГД. Так, ВГД третьего типа вызывает крайне тяжелое повреждение печени с характерными гистологическими изменениями, зачастую приводящее к смерти. "Предполагается, что исключительная патогенность этого вируса обусловлена измененным, по сравнению с ВГД типов I и II, сайтом редактирования РНК, что приводит к нарушению баланса между малой и большой формой антигена ВГД и накоплению цитотоксической малой формы (Casey J., 1993). С другой стороны, гепатит Дельта, вызванный ВГД типа II, характеризуется довольно легким течением, с крайне редким исходом в хроническую форму (Wu G., 1996), в отличии от ВГД типа I, который в случае суперинфекции приводит к хроническому гепатиту у 80% больных (Rizzetto М., 1995). Таким образом, определение генотипа возбудителя является важной предпосылкой прогноза течения гепатита Дельта (Д).
Разнообразие генотипов ВГД, документированное на глобальном уровне, с большой долей вероятности влечет за собой разнообразие антигенных свойств ВГД различных типов. Известно, что сыворотки крови больных гепатитом Дельта, находящихся на излечении в клиниках С.Петербурга, демонстрируют различную авидность по отношению к антигенам ВГД некоторых известных изолятов типа I (Родин В., 1996). Отсюда с неизбежностью следует вывод о предпочтительном использования для диагностики ВГД адекватных тест-систем, созданных на основе последовательности либо близкородственного, либо аутентичного изолята, что в свою очередь предполагает не-
4 обходимость определения нуклеотидной последовательности и генотипической принадлежности ВГД, циркулирующего в конкретной популяции.
Наряду с традиционными методами серодиагностики, все большее развитие получает метод генодиагностики, основанный на амплификации вирус-специфических последовательностей в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Благодаря высокой специфичности и уникальной чувствительности, ПЦР является на сегодня самым эффективным средством выявления вирусов в организме и может быть использована для быстрой и надежной констатации вирусной инфекции, в том числе в отсутствии серологических маркеров, как, например, на ранних стадиях заражения или у больных с имму-носупрессией. Кроме того, ПЦР позволяет осуществлять оперативный мониторинг эффективности действия терапевтических препаратов, обеспечивая достоверный контроль виремии. Несмотря на явные преимущества, ПЦР детекция ВГД в России не проводится.
Таким образом, определение нуклеотидных последовательностей генома ВГД, циркулирующего в Северо-западном регионе России, изоляция аутентичного антигена ВГД и развитие новых подходов к гено- и серодиагностике представляется безусловно важной задачей как для изучения молекулярной эпидемиологии ВГД, так и для клинической диагностики.
Цели и задачи исследования
Цель работы состояла в определении генотипа ВГД, изоляции гена антигена аутентичного изолята ВГД и развитие на основе полученных знаний и материалов новых подходов к гено- и серодиагностике Дельта инфекции.
В соответствии с целями исследования были сформулированы следующие задачи:
-
Разработать метод амплификации фрагментов генома ВГД из сыворотки крови инфицированных пациентов.
-
Применить разработанный метод амплификации к ПЦР-диагностике гепатита Дельта.
-
Используя отработанный метод амплификации, определить нуклеотидные последовательности фрагментов генома российских изолятов ВГД.
-
Провести компьютерный анализ полученных последовательностей, определить гено-типическую принадлежность российских изолятов.
-
Выделить и проклонировать полноразмерный геи антигена ВГД.
-
Создать бактериальные продуценты рекомбинантного антигена ВГД.
-
Изучить возможности получения бактериальных штаммов, экспрессирующих одновременно малую и большую формы антигена ВГД.
8. Разработать систему детекции антител к ВГД в крови пациентов методом имму-ноблота с использованием полученного рекомбинантного антигена.
Научная новизна работы
Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей четырех нзолятов ВГД, циркулирующих в Северо-Западном регионе России. Установлено, что все российские изоляты 1) принадлежат к первому типу ВГД; 2) характеризуются высокой генетической однородностью, что, учитывая относительную стабильность ВГД по сравнению с другими РНК-содержащими вирусами, позволяет предположить однородность популяции ВГД в регионе; 3) близки к итальянскому изоляту и могут быть объединены с последним в еще один подтип.
Практическая значимость работы
В результате проведенного исследования разработан метод генодиагностики ВГД, основанный на амплификации фрагментов генома ВГД в РТ-ПЦР реакциях. Предложен новый способ получения РНК-матрицы для РТ-ПЦР детекции с использованием аффинной хроматографии сыворотки, который позволяет существенно экономить трудовые и временные затраты, связанные с этой стадией анализа, а также избежать использования вредных для здоровья реагентов, таких как фенол и хлороформ. Данный способ получения матрицы может быть легко автоматизирован и в перспективе использован при постановке полностью автоматизированного диагностического метода.
На основе полученных в работе бактериальных систем, одновременно продуцирующих малую и большую формы антигена аутентичного ВГД, разработан оригинальный подход к серодетекции Дельта инфекции. Принцип детекции антител к ВГД в данном анализе основан на визуализации на нитроцеллюлозном фильтре двух или даже четырех полос фиксированной локализации, что резко уменьшает вероятность ложно-положительного ответа. Кроме того, разработанная система может рассматриваться как модельная для создания комплексных диагностикумов, основанных на использовании НЦ фильтров с иммобилизованными различными антигенами какого-либо вируса или антигенами сразу нескольких вирусов. Такие диагностикумы позволят одномоментно получить полную серологическую картину для данного вируса или обнаружить наличие множественного инфицирования.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Отработка метода амплификации фрагментов генома ВГД из сыворотки крови инфицированных пациентов.-
-
Применение разработанного метода к генодиагностике Дельта инфекции.
-
Оптимизация стадии приготовления РНК-матрицы с применением аффинной хроматографии сыворотки.
-
Определение фрагментов нуклеотндной последовательности и генотипа российских изолятов ВГД.
-
Выделение и клонирование гена антигена аутентичного изолята ВГД.
-
Получение бактериальных систем, экспрессирующих одновременно малую и большую формы рекомбинантного антигена.
-
Разработка нового способа серодетекции Дельта инфекции, основанного на использовании обеих форм антигена ВГД.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на IV международной конференции "Current trends in chronically-evolving viral hepatitis", Перуджи, 1995, и на международном симпозиуме "IX triennial intrenational simposium on viral hepatitis and liver disease", Рим, 1996.
Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения; обзора литературы, включающего две главы; результатов собственных исследований, включающих разделы "Материалы и методы" и "Результаты и обсуждение", изложенные в 5 главах; выводов и списка литературы. Работа изложена надатраницах машинописного текста, содержит л.таблиц, <^жсунков; список литературы содержит /.^наименований на русском и английском языках.