Введение к работе
Актуальность темы. Одной из центральных проблем современной вирусологии является познание молекулярных механизмов взаимодействия вируса с клеткой. Несмотря на то, что фаги Т-серии стали ключевыми моделями, сыгравшими исключительно важкую роль в решении таких вопросов; как репликация, транскрипция н трансляция вирусных нуклеиновых кислот, тем не менее молекулярные механизмы фагоспецнфнческой деградации клеточного генома и вирусепецифичес-кне механизмы защиты вирусной ДНК /to сих дар остаются невыясненными.
Цнанофогн, как модельные системі, уникальны в своем роде» К изучению этой специфической группы фагов исследователей привлекают следующие два наиболее значимых аспекта.
1. Выявленные в настоящее время циакофагн поражают однокле
точные, нитчатые и гетероцистные формы цианобактерий, принадлежа
щие к различным таксонам. В этом отношении экспериментальные сис
темы цианобактерия-циансфаг являются чрезвычайно удобной моделью
для исследования вопросов вирусного паразитизма в различны* так
сонах единой группы фотосинтезирующих микроорганизмов. Прокариот-
ное строение клеток цианобактерий и аволюционно сложившаяся спо
собность к фототрефному росту делает их практически идеальной мо
делью для молекулярно-биологических исследований*
Продолжительность лнтического цикла развития цианофагов в клетках цианобактерий в несколько раз превышает таковой у бактериофагов, являющихся традиционными объектами в молекулярной биологии. Этот феномен во многом облегчает исследование молекулярных механизмов взаимодействия вирусного и клеточного геномов. Раскрытие механизмов, лежащих в основе регуляции временной реализации генетической информации цианофагов до сравнению с другими фагами, по-видимому, может привести к новым концепциям в бактериофагии, в частности, и вирусологии вообще,
2. Цианобактерии являются богатыми источниками рестриктаз.
Однако проблема поиска новых ферментов не потеряла своей актуаль
ности. Это объясняется, во-первых, необходимостью расширения ар
сенала ферментов с уникальной специфичностью и, во-вторых, поиском
новых продуцентов рестриктаз с уже известной сайтовой специфич
ностью. Кроме того, одним из важных звеньев взаимодействия между
| центра; жаЇГ ';
І И ''" '': I" " "'- І'іімА ; , *....' .'-...ч-
геномами фага и клетки хозяина при литической инфекции является вирусспецифическая деградация бактериального генетического аппарата хозяина. Несмотря на очевидную актуальность, вопрос о селективной деградации клеточного генома специфическими фаговыми нуклеаэами остается малоисследованным, а имеющееся на сегодняшний день понимание энзиштических механизмов этого процесса ограничивается результатами экспериментов в системе фаг Т4-клетки В. coll (Kutter, Wlbers, 1968).
Отсутствие фундаментальних сравнительных исследований процессов репродукции цианофагов в клетках различного эволюционного усложнения) а также крайне ограниченная информация о молекулярных механизмах воздействия вирусной инфекции на геном клетки визвали, настоятельную необходимость проведения настоящих исследований.
Цель и задачи работы. Целью напей работы было изучение некоторых аспектов взаимодействия вирулентного цианофага л-г о клетками гетероцнстной нитчатой цианобактерви Hostoc linckia, шт. Eleot За7/7 При этом основное внимание было уделено изучению клеточных И вируоиндуцированных ферментов рестрикции и энзиматн-ч ее ного гидролиза ДНК хозяина в процессе инфекции.
Исходя из вышеизложенного в задачу наших исследований входиш,
-
Провести скрининг рестриктазной активности в клетках цианобактерий A.variabilis, N.liackla, Р.Ьогуапшп, .c«4roium.
-
Разработать схему очистки и изучить каталитические и некоторые физико-химические свойства эндсмуклеаэ рестрикции циано-бактерии Hoetoo Unckla,
-
Определить сайты узнавания и точку разрезания очищенных ферментов рестрикции.
-
Изучить динамику ферментативной деградации цианобактери-ального генома в процессе инфекции в четырех вирус-клеточных' системах.
-
Осуществить поиск эндонуклеаэ рестрикции в инфицированных клетках цианобактерий.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение влияния вирусной инфекции на геном цианобактерий:
изучена вирусиндуцированная активация нуклеазной активности в четырех вирус-клеточных системах;
впервые разработана высокоэффективная схема очистки
_ з -
энвонуклеаз рестрикции ніі -387/7 їй Mil 307/7 II» позволившая очистить их в 400 раз и получить чистые ферментные препараты. Установлены сайты узнавання, а для ферментами 587/7 I— точка разрезания. Показано, что Mil 5W/7 і является ложным иэошиаоме-ром рестриктазы Av& I;.
- впервые показано участие в деградации клеточного генома цианобактерии Koetoc Іідс&іа неспецифичесних нуклеаэ вирусного происхождения.
Практическая ценность работы. Разработанный метод получения высокоочнщенных рестриктаз рекомендуется для выделения ферментов кз цианобактерии Host о с liacJcia, Рестриктазы НІ і 337/7 I и irii 367/7 II успешно используются в исследовательских работах в Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР, Институте биоорганической химии и нефтехимии АН УССР и Институте микробиологи» и вирусологии АН УССР.
Полученные в диссертационной работе данные о взаимодействии цианофагов с клетками цианобактерии, а также информация об участии неспецнфнческой вирусной активности в деградации клеточного цианобактериалького генома расширяют современные представления об особенностях репродукции бактериальных вирусов.
Апробация работы,, материалы диссертации докладывались на I Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы современной альгологии" (Черкассы, 1987), 10 Международном микробиологическом конгрессе ( Szeged, 1987), Всесоюзной конференции "методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990).
Публикация результатов исследований. Основные положения дно-. оертацни отражены б б опубликованных работах.
Структура и объем работыт Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы 2,3 И 4), обсуждения, выводов и списка использованной литературы (128 источников иэ них 28 отечественных и 100 зарубежных). Работа изложена на 140 страницах машинописного текста иллюстрирована 3 таблицами и 18 рисунками.