Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
1 Структура и функции теломер 12
1.1 Структура теломерной ДНК у разных организмов .12
1.1.1 Типичная структура теломерной ДНК 12
1.1.2 Нетипичная структура теломерной ДНК 15
1.2 Шелтерин .17
1.3 Функции теломер 18
2 Длина теломерной ДНК и ее изменение 19
2.1 Концевая недорепликация ДНК 19
2.2. Механизмы регуляции длины теломер 20
2.2.1 Теломераза и ее роль в регуляции длины теломер . 20
2.2.2 Поддержание длины теломер с помощью ретротранспозонов 26
2.2.3 Роль гомологичной рекомбинации в регуляции длины теломер.27
2.2.4 Тримминг 28
2.3 Длина теломерной ДНК у разных организмов и возможные причины ее вариабельности .30
2.4 Динамика теломерной ДНК .36
3 Биология теломер и пол .38
4 Биология теломер в свете экологии .40
5 Биология теломер плоских червей и моллюсков 44
6 Байкальские планарии и моллюски .47
Материалы и методы 49
1 Объекты исследования 49
1.1 Байкальские планарии .49
1.2 Байкальские моллюски 51
2 Методы исследования 53
2.1 Морфологический анализ 53
2.2 Методы молекулярной и клеточной биологии 54
2.2.1 Выделение тотальной ДНК 54
2.2.1.1 Выделение тотальной ДНК из планарий 54
2.2.1.2 Выделение тотальной ДНК из моллюсков 55
2.2.2 Определение нуклеотидной последовательности теломерной ДНК у планарий 55
2.2.3 Определение типа теломерного повтора посредством ПЦР с одним праймером 56
2.2.4 Определение длины теломерной ДНК с помощью метода TRF (Terminal Restriction Fragments) 57
2.2.4.1 Получение теломерных проб с помощью безматричной ПЦР .57
2.2.4.2 Радиоактивное мечение теломерных проб 57
2.2.4.3 Нерадиоактивное мечение теломерных проб .58
2.2.4.4 Рестрикция ДНК 59
2.2.4.5 TRF анализ 60
2.2.5 Dot гибридизация .60
2.2.6 Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 61
2.2.6.1 Получение препаратов для FISH .61
2.2.6.2 FISH 61
2.2.7 ПЦР на фрагмент гена актина 62
2.2.7.1 Конструирование праймеров на фрагмент гена актина моллюсков и планарий 62
2.2.7.2 ПЦР и секвенирование фрагмента гена актина планарий 63
2.2.7.3 ПЦР и секвенирование фрагмента гена актина моллюсков 64
2.2.8 ПЦР в реальном времени 64
2.2.8.1 ПЦР в реальном времени с ДНК планарий 65
2.2.8.2 ПЦР в реальном времени с ДНК моллюсков 66
2.2.9 Определение активности теломеразы 67
2.2.9.1 Выделение экстракта, содержащего РНК и белки 67
2.2.9.2 TRAP (Telomeric repeat amplification protocol) и окраска продуктов нитратом серебра 68
2.2.10 Филогенетический анализ 70
2.2.10.1 ПЦР на фрагменты генов рибосомальной РНК 70
2.2.10.2 Филогенетическая реконструкция на основе генов рРНК и актина планарий 71
2.3 Статистический анализ 72
Результаты 73
1 Теломерный повтор у байкальских планарий. 73
2 Теломерные повторы в тотальной ДНК планарий и моллюсков 74
3 Локализация теломерных повторов TTAGGG в хромосомах моллюсков и планарий 77
4 Вариабельность количества теломерной ДНК у ювенильных особей планарий и эмбрионов моллюсков 79
5 Длина теломерной ДНК и возрастные изменения ее количества у моллюсков .80
6 Длина теломерной ДНК и возрастные изменения ее количества у планарий 86
6.1 Активность теломеразы у моллюсков 92
6.2 Активность теломеразы у планарий 93
7 Длина теломерной ДНК и филогения байкальских планарий. 94
Обсуждение .97
1 Структура теломерного повтора .97
2 Локализация теломерных повторов в хромосомах 98
3 Длина теломерной ДНК и ее связь с филогенией 99
4 Динамика теломерной ДНК и активность теломеразы у планарий .102
5 Динамика теломерной ДНК и активность теломеразы у моллюсков 105
Заключение 110
Выводы 112
Список сокращений 113
Список литературы 114
- Теломераза и ее роль в регуляции длины теломер
- Биология теломер в свете экологии
- Длина теломерной ДНК и возрастные изменения ее количества у моллюсков
- Динамика теломерной ДНК и активность теломеразы у моллюсков
Теломераза и ее роль в регуляции длины теломер
Основным участником механизма поддержания длины теломер является теломераза – фермент, который осуществляет синтез ДНК цепи на РНК-матрице, входящей в его состав (рис. 5). Этот уникальный белок был впервые обнаружен у инфузорий в 1985 г. К. Грейдер и Э. Блэкборн [Greider, Blackburn, 1985]. Позже его идентифицировали в экстрактах иммортальных клеточных линий человека и в большинстве раковых опухолей [Shay, Wright, 2010]. А в 1998 г. была доказана возможность продления жизни клеточных популяций путем встраивания в геном активных генов теломеразы [Bodnar et al., 1998; Vaziri, Benchimol, 1998].
Теломераза состоит из двух компонентов, кодируемых разными генами – геном обратной транскриптазы (telomerse reverse transcriptase – Tert) и геном РНК-компонента (telomerase RNA component – Terc), один из участков которого служит матрицей для синтеза новых теломерных повторов. Кроме того, в теломеразный комплекс входит еще целый ряд вспомогательных компонентов, которые необходимы для ее функционирования [Зверева, Щербакова, Донцова, 2010].
Теломераза использует 3 -выступ в качестве праймера для добавления G-богатых повторов в соответствии со своей РНК-матрицей. C-богатая цепочка тДНК достраивается репликативным аппаратом клетки по принципу комплементарности. Синтез теломерных повторов происходит в поздней S-фазе клеточного цикла [Tomlinson et al., 2006]. Теломеразы разных организмов различаются по каталитическим свойствам, таким как процессивность и точность, а у некоторых организмов они способны к ди- и мультимеризации [Autexier, Lue, 2006]. Подробный, пошаговый механизм взаимодействия теломеразы и теломер до сих пор не описан. По общепринятой модели, теломераза может соединиться с теломерой только после того, как репликативная вилка трансформирует теломерный хроматин. Прямое взаимодействие происходит с TPP1 компонентом шелтерина, при этом важную роль играет и белок POT1. Предполагается, что опосредованное взаимодействие компонентов шелтерина с теломеразой и регулирование синтеза тДНК осуществляется тремя способами: 1. через белок TIN2; 2. через CST комплекс и альфа праймазу (PP); 3. через 5 -3 экзонуклеазу Apollo [Hockemeyer, Collins, 2015].
Многочисленные исследования корреляции уровня активности теломеразы и длины теломер не дали однозначных результатов: некоторые из них выявили строгую зависимость длины теломер от активности теломеразы, а некоторые поставили эту зависимость под сомнение [Autexier, Lue, 2006]. Причина этих несоответствий до сих пор не найдена, однако для решения возникшей проблемы может быть важно следующее обстоятельство. Показано, что длина теломер влияет на способность теломеразы их удлинять: на более длинные теломеры в отдельно взятом кариотипе теломераза не действует [Marcand, Brevet, Gilson, 1999]. В тоже время выявлено, что короткие теломеры более восприимчивы к удлинению [Teixeira et al., 2004]. В итоге была предложена модель равновесного состояния длин теломерных районов, по которой средняя скорость укорочения теломер уравновешивается средним увеличением длины теломер. Последняя является произведением вероятности инициации синтеза повторов и средней длины, на которую теломера увеличилась. В случае, когда потеря нуклеотидов превышает их добавление, вероятность инициации работы теломеразы увеличивается, и наоборот [Autexier, Lue, 2006]. Эта модель указывает на существование особых механизмов, регулирующих как процессивность теломеразы в отношении теломерных повторов, так и структуру самих теломер. Все больше данных подтверждает роль теломерных белков в этом процессе. На основе данных по биологии теломер дрожжей была предложена другая модель, учитывающая количество определенных белков, ассоциированных с тДНК, так называемая «protein counting model» [Marcand, Brevet, Gilson, 1997; Teixeira et al., 2004], но и она не объясняла все экспериментальные данные [Greider, 2016]. Поэтому была предложена альтернативная модель, получившая название «replication fork model», которая учитывает связь репликации ДНК и длины теломеры [там же]. Эта модель также призвана объяснить равновесное состояние длины теломер, но не за счет количества репрессирующих теломеразу теломерных белков, а за счет удаленности или близости к концу хромосомы ориджина репликации и репликативной вилки, с которой связана теломераза, вероятно, через RPA белки. Перемещаясь с репликативной вилкой, теломераза достигает конца хромосомы и синтезирует теломерные повторы, если до этого не отсоединится под влиянием теломерных белков и нуклеосом. Чем ближе репликативная вилка к концу теломеры, тем у теломеразы больше шансов достигнуть места назначения. Модель репликативной вилки объясняет не только факты преимущественного удлинения коротких теломер, влияния теломерных белков на длину концевых районов хромосом и стохастический характер удлинения, что, в принципе, в силах объяснить и модель количества белка, но она проливает свет на давно существующие загадочные связи репликации ДНК и длины теломер. Например, разное влияние разных субтеломерных областей у дрожжей (X и Y ) на длину теломер оставалось долгое время необъяснимым [Craven, Petes, 1999]. Однако, применяя выше описанную модель, можно понять, почему существует такая разница: X и Y прителомерные области содержат сайты начала репликации на разном расстоянии от конца хромосомы, что по-разному влияет на длину теломер. Более того, эта модель объясняет синтез теломерных повторов в конце S фазы клеточного цикла, а также отвечает на вопрос, почему мутации в генах, кодирующих репликативный аппарат отстающей цепи, влияют на длину теломер [Greider, 2016]. В связи с такой сложной картиной равновесного состояния длины тДНК говорить о непосредственной связи активности теломеразы и динамики длины теломер нужно очень осторожно. Наличие активной теломеразы в клетке еще не является гарантом поддержания средней длины теломер, что и доказывают некоторые данные, полученные в основном на рыбах: медаке [Hatakeyama et al., 2008], нотобранхиусе [Hartmann et al., 2009] и данио [Anchelin et al., 2011]. В некоторых работах обнаружение активной теломеразы на фоне укорочения теломер объясняют некой гомеостатической активностью этого фермента, которая несущественна для поддержания теломер [Tan et al., 2012]. Правомерно ли это? Можно ли исключить роль теломеразы в поддержании самых коротких теломер, хотя бы и средняя длина тДНК постепенно уменьшалась?
Об осторожности в выводах нужно говорить и при выявлении отсутствия теломеразной активности. Концентрация теломеразы in vivo очень низкая. Например, в одной клетке дрожжей S. cerevisiae содержится около 20 молекул теломеразы, а в раковой клетке человека – 250 [Mozdy, Cech, 2006; Xi, Cech 2014]. Какова вероятность того, что при анализе активности теломеразы в нормальных делящихся соматических клетках, в которых этого белка должно быть намного меньше, чем в раковых, не будет ложного отрицательного результата? Доказательством сложности подобного анализа являются работы, посвященные определению активности теломеразы в букальном эпителии человека, выполненные с помощью разных методологических подходов, в которых показано, что у одних индивидов активность теломеразы есть, а у других нет [Kannan et al., 1997; O Flatharta et al., 2002].
Профиль активности теломеразы в разных клетках и тканях человека в настоящее время изучен довольно хорошо. Не вызывает сомнений наличие активной теломеразы в потенциально иммортальных клетках, таких как эмбриональные, стволовые, раковые, а также в клетках полового пути [Kim et al., 1994; Ozturk, Sozen, Demir, 2014; Ozturk, 2015]. В некоторых других типах клеток и тканей человека также была обнаружена функциональная теломераза: в эпителиоцитах [Bachor, Bachor, Boukamp, 1999], в тканях молочной железы [Liu, Baykal, Fung, 2004], в фибробластах [Masutomi et al., 2003], B-лимфоцитах [Lobetti-Bodoni et al., 2010] и некоторых других.
Многие организмы, начиная от беспозвоночных и заканчивая растениями, имеют в соматических клетках активную теломеразу. Например, у хвойных растений [Flanary, Kletetschka, 2005], губок [Koziol et al., 1998], креветок [Lang et al., 2004], морских ежей [Francis et al., 2006], лягушек [Bousman, Schneider, Shampay, 2003], летучих мышей [Wang, McAllan, He, 2011], птиц [Haussmann et al., 2007] была выявлена положительная реакция на функциональную теломеразу. Это может говорить, с одной стороны, о широком распространении среди эукариот механизма поддержания коротких теломер посредством балансирования их длины и доступности для теломеразы. С другой стороны, наличие функциональной теломеразы у большого числа эукариот указывает и на то, что этот фермент выполняет некоторые дополнительные функции, не связанные с поддержанием длины теломер. Последний вывод подтверждается многочисленными данными. Теломераза участвует в регуляции клеточного цикла, в предотвращении апоптоза, в защите от повреждений активными формами кислорода (АФК), в развитии мозга, в пролиферации нервных клеток и дифференциации мышечных клеток [Bollmann, 2008; Cong, Shay, 2008; Sykorova, Fajkus, 2009; Hrdlickova, Nehyba, Bose, 2012]. Этот фермент работает не только в кариоплазме, но и в митохондриях, участвуя в ответе на окислительный стресс [Santos, Meyer, Van Houten, 2006; Passos, Saretzki, von Zglinicki, 2007; Ahmed et al., 2008].
Биология теломер в свете экологии
Все живые существа являются открытыми системами. То, что они потребляют, какой образ жизни ведут и как реагируют на изменения в окружающей среде, – все это находит свое отражение в биологии теломер. В настоящее время существует много работ, подтверждающих чувствительность теломерной системы к разным факторам. Влияние внешних факторов на динамику теломерных районов может быть значительным. Одним из ярких примеров такой связи является изменение длины теломер во время неблагоприятных климатических условий. Одни организмы приобретают особые адаптации, позволяющие им переживать неблагоприятный сезон (листопад, спячка, накопление жира и др.), другие предпочитают избегать его, мигрируя в теплые и богатые пищей регионы. На теломерах эти стратегии отражаются по-разному.
В период с сентября по октябрь у разных видов древесных растений наблюдается резкое укорочение теломерных районов и уменьшение активности теломеразы в листьях [Song et al., 2010; Mu et al., 2014]. Причем такая динамика была характерна как для молодых, так и для вековых деревьев, что указывает на связь этого процесса с возрастом листа, а не с возрастом всего растения. Чтобы пережить трудные времена некоторые виды животных в осенний период впадают в спячку. Исследования динамики теломер до, в течение и после гибернации проводились на трех видах маленьких грызунов – джунгарском хомяке [Turbill et al., 2012], соне-полчке [Turbill et al., 2013] и садовой соне [Giroud et al., 2014]. Было обнаружено, что как в периоды оцепенения, так и в течение спячки длина теломер у них остается постоянной или даже увеличивается. Однако у садовой сони при пробуждении, то есть когда происходит так называемое оттаивание и температура тела повышается, происходит усиление метаболизма, которое опосредуется окислительным стрессом и укорочением теломер [там же]. Существуют данные о том, что маленькие впадающие в спячку грызуны имеют бльшую максимальную ПЖ и медленнее стареют, по сравнению с грызунами того же размера, не впадающими в спячку [Turbill, Bieber, Ruf, 2011]. Тем не менее, самая большая ПЖ характерна для невпадающего в спячку голого землекопа, который живет до 30 лет и обладает особыми адаптациями к долгожительству [Kim et al., 2011]. В отличие от сонь, голый землекоп, по сути, является пойкилотермным животным с низким уровнем метаболизма и не испытывает стресса, связанного с повышением обмена веществ, так как обитает в довольно стабильных условиях под землей. В фибробластах у землекопа и у близких к нему по образу жизни и некоторым молекулярным адаптациям слепышей была обнаружена активная теломераза, а укорочение теломер с возрастом не происходило [Seluanov et al., 2007; Gomes et al., 2011; Gorbunova et al., 2012]. Эти примеры говорят не только о связи теломерной биологии с условиями обитания, но и о вовлечении этих взаимодействий в регуляцию ПЖ животных.
На человека сезонные изменения также оказывают влияние. На примере костариканцев было показано, что в дождливый сезон у испытуемых длина теломер была короче, чем в остальное время года [Rehkopf et al., 2014]. Сезонная динамика длины теломер была обнаружена у другого примата Mandrilllus sphinx, у которого в течение длинного засушливого периода происходила потеря теломерных повторов [Beaulieu et al., 2017].
Другая стратегия избегания неблагоприятных условий – миграция. Приспособления к длительным переходам или перелетам затрагивают многие структуры и функции организма, в том числе и теломеры. Исследование на обыкновенных моевках Rissa tridactyla показало, что перелет птиц в края зимовки оказывает положительное влияние на длину теломер [Schultner et al., 2014]. Перед перелетом у птиц происходит накопление жира, в то же время обмен веществ замедляется. Это, вероятно, позволяет птицам расходовать энергию оптимально, уменьшать окислительный стресс и сохранять теломеры.
Непосредственное влияние отдельных внешних факторов было продемонстрировано на некоторых простейших, грибах и даже на позвоночных животных [Ahmed et al., 1998; Bernards et al., 1983; McEachern, Hicks, 1993; McLennan et al., 2016]. У тетрахимены, например, при повышении температуры культивирования длина теломер увеличивалась почти в три раза [Ahmed et al., 1998]. А представители лосося Salmo salar, выращенные при 5С, имели более короткие теломеры по сравнению с рыбами, обитающими при 7С [McLennan et al., 2016]. Другие воздействия, например УФ излучение, приводят к ускоренной потере теломер в клетках кожи человека [Yin, Jiang, 2013].
У Homo sapiens уменьшение длины тДНК связано не только с неблагоприятными внешними условиями, но и с курением, метаболическим синдромом [Huzen et al., 2014], гипертонией [Jeanclos et al., 2000], диетой [Mukherjee et al., 2009], депрессией [Simon et al., 2006], другими заболеваниями и стрессом любого генезиса [Shalev et al., 2013; Aviv, Shay, 2018]. К счастью для человека, все эти воздействия можно корректировать и снижать нагрузку на защитные системы организма, максимально продлевая хорошее самочувствие. В отличие от ситуации в сообществе людей с развитой врачебной индустрией, любое заболевание, приобретенное животными в диких условиях, существенно влияет на их жизнеспособность. К болезням с негативными экологическими последствиями можно отнести заражения разными паразитами, которые постоянно присутствуют в окружающей среде. Такие заражения также оказывают значительное влияние на динамику тДНК. При исследовании популяции птиц камышовок было выявлено, что особи, инфицированные малярийным плазмодием, жили меньше, производили меньше потомства и быстрее теряли теломерные повторы по сравнению со здоровыми индивидами [Asghar et al., 2016]. Подобным образом, барсуки, больные туберкулезом, имели более короткие теломеры [Beirne et al., 2014]. Корреляция длины тДНК с выживаемостью была отмечена при анализе длины теломер у других птиц. Особи ласточек Tachycineta bicolor и галок Corvus monedula с более длиной тДНК имели большую вероятность выжить и оставить потомство [Haussmann et al., 2005; Salomons et al., 2009].
Не менее удивительна связь длины теломер со структурой сообщества. Иерархическое устройство определенным образом коррелирует с протяженностью теломерных районов. У находящихся на верху иерархии доминантных гиен длина теломер была больше, чем у особей внизу иерархии. Возможно, это связано с низким уровням стрессовых гормонов у доминантных самок или с лучшим качеством питания [Lewin et al., 2015].
Рассмотренные выше факторы указывают на чувствительность теломерных районов хромосом, которые, по всей видимости, являются своеобразными индикаторами состояния организма при его взаимодействии с окружающей средой.
Длина теломерной ДНК и возрастные изменения ее количества у моллюсков
Размеры тяжей теломерного повтора на концах хромосом байкальских гастропод определяли с помощью TRF метода. Была проанализирована ДНК 5-6 особей каждого вида (рис. 21А). Полученные результаты свидетельствуют о вариабельности размеров тДНК у каждого из исследуемых видов. Размах изменчивости минимальных значений тДНК составил 3-7 тпн у K. martensiana, 3-9 тпн у B. baicalensis и 5-11 тпн у B. fragilis, средних – 9-12.3, 14-17.8 и 11.6-20 тпн и максимальных – 11-16.5, 15-23 и 18-25 тпн, соответственно [Королева и др., 2015]. Статистический анализ показал, что у особей K. martensiana с маленькой раковиной максимальные и средние значения длины тДНК (13.3±2.2 и 10.5±1.5 тпн) достоверно меньше, чем у представителей рода Benedictia (B. fragilis и B. baicalensis), имеющих более крупные раковины и близкие значения тДНК (максимальная длина тДНК – 20.5±3.1 и 18±3.2 тпн, средняя – 16±2.9 и 15±2.1 тпн, соответственно) (Kruskal-Wallis test: H (1, n=17)=8.49-9.73, p 0.005; рис. 21В). По минимальным значениям длины тДНК отличий между этими моллюсками не было обнаружено (Kruskal-Wallis test: H (1, n=17)=1.98, p 0.05).
Возрастную динамику тДНК у моллюсков анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты анализа представлены на рисунке 22 и в таблице 9. Вариабельность длины теломер выявлялась у каждого вида моллюсков независимо от пола, возраста и стадии развития (рис. 22А). ОДТ варьировала у самок B. fragilis от 0.6 до 1.52, а у самцов того же вида – от 0.46 до 1.47. У B. baicalensis самки, самцы и эмбрионы имели значения ОДТ в диапазоне 0.44-2.14, 0.41-1.17 и 0.58-1.69, соответственно. Для самок K. martensiana были характерны значения ОДТ от 0.82 до 1.83, а для самцов – от 0.66 до 2.13. Максимальные, средние и минимальные значения ОДТ для особей всех возрастов трех видов представлены в Приложении 3. Коэффициенты вариации значений ОДТ для выборочных совокупностей всех трех видов указаны в таблице 9.
Результаты возрастной динамики тДНК моллюсков опубликованы в [Maximova et al., 2017]. У самок B. fragilis мы видим поддержание количества тДНК в течение онтогенеза, тогда как у самцов наблюдается ее уменьшение в возрасте 4-6 лет на 30%, когда они становятся половозрелыми, а потом разница у молодых и старых особей сокращается до 12% (рис. 22). При анализе динамики ОДТ B. baicalensis обнаруживается значительное уменьшение количества тДНК в первый год жизни у самок по сравнению с эмбрионами на 39%. У самцов также теломерные повторы теряются в первые три года жизни примерно на тот же порядок (на 47%). Далее в процессе онтогенеза у самок наблюдается увеличение количества тДНК и в возрасте 4-6 лет оно становится сопоставимым с количеством тДНК у эмбрионов. У самцов ОДТ больше не меняется (рис. 22, табл. 9). Возрастная динамика количества тДНК у K. martensiana отличается от таковой у видов рода Benedictia тем, что как у самцов, так и у самок ОДТ увеличивается с возрастом примерно на 20% (рис. 22, табл. 9). Однако у самцов в возрасте 4-6 лет при достижении половозрелости, как у самцов B. fragilis, наблюдается потеря тДНК, которая компенсируется в следующие годы жизни и достигает такой же длины, что и у самок (рис. 22В).
Межполовые отличия в количестве тДНК были обнаружены у всех исследуемых видов в возрасте 4-6 лет, когда моллюски становятся половозрелыми: самки в этот период жизни имели больше теломерных повторов в геноме, чем самцы (рис. 22В, табл. 9). У B. fragilis ОДТ у женских особей была больше на 33%, у B. baicalensis – на 44% (эти отличия сохранились и у 7-8 летних особей), а у K. martensiana – на 17%.
Чтобы оценить влияние полового созревания на длину теломер были проанализированы неполовозрелые и половозрелые особи. При сравнении значений ОДТ моллюсков, сгруппированных по признаку незрелости (0.5-3 года) или зрелости (4-8 лет) отдельно для самок и самцов, было обнаружено, что ОДТ у неполовозрелых самцов B. fragilis больше, чем у половозрелых. В тоже время длина тДНК у неполовозрелых самок B. baicalensis, наоборот, меньше, чем у половозрелых. Подобная ситуация наблюдается у неполовозрелых самцов и самок K. martensiana (табл. 9).
Таким образом, было показано, что, во-первых, длина тДНК и значения ОДТ у моллюсков – довольно вариабельные параметры (SD достигало 15-34%). Во-вторых, максимальная и средняя длина тДНК была больше у более крупных видов бенедикций по сравнению с таковой у мелкого вида K. martensiana. В-третьих, возрастная динамика ОДТ у самок и самцов исследованных моллюсков имела видоспецифичный характер: самцы одного вида теряли теломерные повторы, а самки нет (B. fragilis); у другого вида уменьшение количетсва тДНК происходило в первые несколько лет жизни после рождения у обоих полов, а потом у самок количество тДНК восстанавливалось до уровня эмбрионов, тогда как у самцов этого не происходило (B. baicalensis); у третьего вида наблюдалось увеличение количества тДНК как у самок, так и у самцов (K. martensiana). Наконец, самки в возрасте 4-6 лет у всех трех видов имели большее количество тДНК, чем самцы того же возраста.
Динамика теломерной ДНК и активность теломеразы у моллюсков
Возрастная динамика тДНК у моллюсков может отличаться между видами и популяциями, которые имеют различные и схожие биологические и экологические характеристики [Estabrooks, 2007; Godwin et al., 2012; Gruber et al., 2014]. Исследуя изменения ОДТ во время онтогенеза у байкальских моллюсков, мы обнаружили как специфичные для каждого вида особенности, так некоторые общие черты [Maximova et al., 2017].
При сравнении количества тДНК у особей одного из исследованных видов моллюсков B. baicalensis на эмбриональной стадии развития и в возрасте 0.5-3 лет была выявлена значительная потеря теломерных повторов, как и в вышеописанных случаях с Ph. sibirica и R. arecepta. Причем уменьшение количества тДНК происходило независимо от пола особей: как самки, так самцы очень быстро теряли теломерные повторы (рис. 22В, табл. 9). У самок в первый год жизни количество тДНК уменьшалось на 38% по сравнению с тДНК эмбрионов, со второго года начиналось увеличение, а у самцов в первые три года жизни потеря тДНК составила практически 50%, и количество тДНК после этого не менялось (рис. 22В). Интересно отметить, что у гермафродитного моллюска Saccostrea glomerata наблюдалась схожая с самками B. baicalensis динамика тДНК: в первые два года жизни происходило укорочение теломер на 27%, а в возрасте 3-4 лет отличий по длине теломер с молодью уже не было [Godwin et al., 2012]. Укорочение на первых этапах постнатального развития и последующее восстановление тДНК было выявлено у рыбы медаки Oryzias latipes [Hatakeyama et al., 2016] и пингвина Spheniscus magellanicus [Cerchiara et al., 2017], что указывает на некоторые универсальные механизмы регуляции длины тДНК на ранних этапах постнатального развития. Так как активность теломеразы была обнаружена у особей разного возраста, то очень вероятно, что именно она отвечает за восстановление тДНК у самок B. baicalensis (рис. 25). У самцов, у которых также была выявлена функциональная теломераза, вероятно, уровень активности этого фермента является недостаточным для восстановления тДНК до длины на эмбриональной стадии развития, но достаточным, чтобы поддерживать теломерные районы хромосом в процессе последующего онтогенеза (рис. 22В). Мужские и женские особи другого представителя бенедикций B. fragilis также имели разную динамику тДНК и активную теломеразу: у самок количество тДНК оставалось неизменным в течение онтогенеза, а у самцов происходила потеря теломерных повторов (рис. 22, рис. 25). У K. martensiana, в отличие от других моллюсков, полового диморфизма в динамике тДНК не было обнаружено: у самок и самцов количество тДНК увеличивалось с возрастом на фоне активной теломеразы (рис. 22А, рис. 25). Однако, отличия в ОДТ между особями разного пола были выявлены в возрасте 4-6 лет, когда моллюски становятся половозрелыми. Такие половые различия в ОДТ были характерны не только для K. martensiana, но и для бенедикций (рис. 22В, табл. 9). Вероятно, половое созревание самцов байкальских гастропод вносит значительный вклад в потерю тДНК в этот период жизненного цикла. К тому же самки и самцы могут затрачивать разные энергетические ресурсы на размножение и по-разному реагировать на изменения в окружающей среде.
Исследуемые виды байкальских моллюсков имеют определенные экологические особенности (рис. 29). B. fragilis и B. baicalensis обитают в разных биотопах оз. Байкал. B. fragilis - эврибатный вид, живущий на мягких субстратах на глубине от 30 до 1300 м при постоянно низких температурах воды (+4C). Вид B. baicalensis обитает на разных субстратах в более узком диапазоне глубин (1.5-30 м) и подвержен значительным колебаниям внешних факторов. K. martensiana, также как и B. baicalensis, живет в литорали озера, но обнаруживается только на твердых субстратах с обрастаниями губок. ПЖ этих трех видов, несмотря разницу в условиях обитания и размерах, одинакова и сотавляет около 8 лет. Разница в размерах достигается за счет разной скорости роста (рис. 29), что может влиять на динамику тДНК. Вид B. fragilis отличается самыми быстрыми темпами роста, он имеет самый маленький протоконх (зародышевую раковину), который увеличивается в 20 раз во время онтогенеза. При этом потеря тДНК, которая непосредственно связана с делением клеток, происходит только у самцов этого вида (рис. 22). Раковина другой бенедикции B. baicalensis во время роста увеличивается в 7 раз. И у этого вида уменьшение количества тДНК происходит только вначале роста у обоих полов. Возможно, скорость роста в этот период максимальна. У K. martensiana раковина растет медленнее, чем у бенедиктиид (протоконх увеличивается всего в 4 раза, рис. 29), и потери теломерных повторов не наблюдается. Возможно, именно разная скорость делений клеток обусловливает разницу в динамике ОДТ у разных видов, а возможно и у разных полов.
Тот факт, что самки этих байкальских моллюсков, если не учитывать период первого года жизни B. baicalensis, не теряют теломерные повторы, а самцы имеют разные возрастные тренды изменения количества тДНК, может указывать на связь биологии теломер этих организмов с факторами, определяющими половые отличия. К ним можно отнести влияние половых гормонов на активность теломеразы, которая, также как и длина теломер, может меняться в процессе роста и развития [Calado et al., 2009]. Изменение в длине теломер коррелирует с изменением активности теломеразы в течение онтогенеза у некоторых организмов (например, у сосны Pinus longaeva [Flanary, Kletetschka, 2005], рыбы Oryzias latipes [Hatakeyama et al., 2016]) и с изменением в уровне половых гормонов [Gopalakrishnan et al., 2013].
С другой стороны, размножение и связанные с ним изменения в физиологии организма также могут отражаться на длине тДНК. Размножение практически всегда ассоциировано с очень серьезными энергетическими затратами и, как правило, связано с сильным стрессом для организма. В то же время показано, что теломеры очень чувствительны ко многим стрессовым воздействиям [Bateson, 2016], в том числе и к размножению. На мышах, например, было установлено, что у размножающихся самок тДНК укорачивается быстрее, чем у не размножающихся [Kotrschal, Ilmonen, Penn, 2007]. Повышенная продукция яиц у некоторых рыб и птиц, многодетность у человека также были связаны с укорочением тДНК [Gao, Munch, 2015; Bauch, Becker, Verhulst, 2013; Gray et al., 2014]. Однако восприимчивость к стрессу такого рода может носить видоспецифичный характер, так как известны организмы, у которых связь размножения и укорочения теломерных районов хромосом отсутствует [Boudreau et al., 2014; Beaulieu et al., 2011]. Полученные данные для байкальских моллюсков также не отражают зависимости динамики тДНК от плодовитости самок исследованных видов. У самок всех трех видов ОДТ с возрастом поддерживается или увеличивается (рис. 22). При учете размера организма и размера яйцевой капсулы (рис. 29) наибольшее стрессовое воздействие должны испытывать самки B. baicalensis, однако у них мы видим увеличение количества теломерных повторов с возрастом, причем они способны восстанавливать ОДТ после того, как произошло ее укорочение в период, когда организм быстро растет (рис. 22). Вероятно, у байкальских гастропод контроль за количеством тДНК осуществляется очень эффективно. Это позволяет поддерживать характерный для каждого вида размер теломер, не выходя за верхние и нижние его границы.