Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 11
ГЛАВА 1. ДНК-регуляторные элементы Drosophila melanogaster 11
1.1. Элементы коровых промоторов, транскрибируемых РНК-полимеразой II.11
1.2. Преинициаторный комплекс на промоторах генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II
1.3. Энхансеры 15
1.4. Сайленсеры (PRE – элементы) .18
ГЛАВА 2. Комплексы белков группы Polycomb 21
ГЛАВА 3. Белки группы Trithorax 28
ГЛАВА 4. Механизмы Polycomb-зависимой репрессии 32
ГЛАВА 5. Переключение активности PRE 39
5.1. Переключение PRE в Bithorax-комплексе 39
5.2. Переключение PRE в трансгенных моделях 42
5.3. Проходящая транскрипция и переключение PRE 50
5.4. Белковые комплексы на PRE в разных статусах 54
Материалы и методы 58
ГЛАВА 1. Генетические методы 58
1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе .58
1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий .59
1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и white в трансгенных линиях 59
1.4. Генетические скрещивания .61
ГЛАВА 2. Биохимические методы 66
2.1. Методы работы с ДНК .66
2.1.1. Определение концентрации ДНК 66
2.1.2. Спиртовое осаждение ДНК 66
2.1.3. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле 66
2.1.4. Выделение фрагментов ДНК из геля 67
2.1.5. Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC 67
2.2.Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 67
2.2.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы 67
2.2.2. ПЦР в реальном времени с использованием Hot-Start Taq-ДНК-полимеразы. 2.3. Анализ активности гена -галактозидазы в мухах. 68
2.4. Иммунопреципитация хроматина на разных стадиях развития 69
2.5. Выделение РНК из взрослых мух и обратная транскрипция 72
2.6. Получение антител
2.6.1. Экспрессия и очистка антигенов 74
2.6.2. Список антител, использованных в работе 76
Результаты 78
ГЛАВА 1. Исследование стабилизации активности регуляторных элементов терминаторами транскрипции SV40 78
ГЛАВА 2. Исследование эффектов проходящей транскрипции на сайленсер bxdPRE 81
2.1. Экспериментальная система для запуска транскрипции через bxdPRE 81
2.2. Репрессионные белки остаются на bxdPRE в присутствии проходящей траснкрипции 88
2.3.Привлечение Trithorax-белков на bxdPRE в присутствии проходящей
транскрипции 95
Обсуждение 98
Заключение 103
Выводы 105
Список литературы 107
- ДНК-регуляторные элементы Drosophila melanogaster
- Переключение PRE в трансгенных моделях
- Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и white в трансгенных линиях
- Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC
Введение к работе
Актуальность работы
Экспрессия генов является отправной точкой в обеспечении жизнедеятельности клетки. Уникальный набор экспрессируемых генов определяет тип клетки, её функциональные возможности. Для клеток многоклеточных организмов установление и сохранение во времени характерного набора экспрессирующихся генов является основой правильной и стабильной дифференцировки. Реактивация молчащих генов может привести к нарушениям в организме вследствие неконтролируемого деления клеток и изменения их физиологии. Нарушение работы генов является причиной аномалий развития и многих форм онкологических заболеваний.
У многоклеточных организмов тканеспецифичная экспрессия генов
обеспечивается набором ДНК-регуляторных элементов, которые принято делить на
несколько классов: энхансеры, сайленсеры и инсуляторы. Энхансеры активируют
транскрипцию генов, сайленсеры её репрессируют. В геноме Drosophila
melanogaster находятся тысячи таких ДНК-элементов. Способностью ограничивать
действие энхансеров и сайленсеров обладают инсуляторы. Предполагается, что они
принимают участие в разграничении областей генома, на которые могут
действовать эти регуляторные элементы. У многоклеточных организмов на стадии
раннего эмбрионального развития устанавливается характерный набор
транскрибируемых генов в клетках разных частей эмбриона. Этот процесс обеспечивает начало разделения тканей и закладку органов. Для большинства клеток после завершения дифференцировки основной набор активных генов остаётся неизменным. Сайленсеры играют ключевую роль в обеспечении этого постоянства. После того как сайленсер репрессирует ген, состояние репрессии сохраняется на протяжении многих клеточных делений. Работа этих элементов обусловлена действием белков группы Polycomb (PcG). Они образуют комплексы, связывающиеся с ДНК-последовательностями сайленсеров. Поэтому такие элементы также называют PRE (от англ. Polycomb Response Elements, элементы ответа Polycomb). Белки PcG обладают рядом активностей, способствующих репрессии генов. Среди них: модификация гистонов и компактизация нуклеосом. За счёт этого PRE способен эффективно репрессировать ген. Тем не менее, каждый конкретный сайленсер активен не во всех клетках организма, поскольку многие гены должны быть репрессированны в одних типах клеток, но активны в других. Таким образом, PRE – переключаемый элемент. Однако чёткий механизм инактивации его репрессионной активности не известен.
Существует группа белков Trithorax (TrxG), являющихся по генетическим данным антагонистами белков PcG. Некоторые из них связываются с PRE. Есть модель, согласно которой соотношение PcG- и TrxG-белков на PREопределяет его статус. Широко распространена гипотеза о том, что проходящая через PRE транскрипция приводит к эпигенетически наследуемой инактивации PRE-элемента. Предполагается, что при этом происходит смещение PcG-белков с сайленсера, что приводит к нейтрализации репрессии. Несмотря на популярность этого взгляда, влияние проходящей транскрипции на обогащение PRE белками PcG и TrxG не проверялось.
Система PcG-репрессии присутствует у всех многоклеточных организмов. Нарушения в её работе ассоциированы с развитием онкологических заболеваний, в
том числе и у людей. Таким образом, исследование PcG-репрессии является важной задачей. Drosophila melanogaster - один из удобных объектов для изучения PcG-репрессии, так как содержит значительно меньшее число паралогов белков группы PcG, чем млекопитающие, и позволяет проводить генетические манипуляции с целым организмом.
Изучение PRE-элементов Drosophila часто проводят с использованием
трансгенных конструкций, интегрированных в геном. При этом активность
PRE-элемента зависит от места интеграции конструкции в геноме: PRE-элемент
может быть активен или неактивен. Это затрудняет исследования сайленсеров и
интерпретацию полученных результатов. Влиянию геномного окружения в составе
трансгенных конструкций так же подвержены другие ДНК-элементы: энхансеры и
инсуляторы. Воздействие на элементы в конструкциях может оказывать идущая со
стороны геномного окружения транскрипция; либо статус хроматина,
окружающего место встройки; другие регуляторные элементы. Важной задачей является поиск способа нейтрализации влияния геномного окружения на активность регуляторных ДНК-элементов.
В данной работе показана способность терминаторов транскрипции вируса SV40, окружающих трансген, стабилизировать работу сайленсера bxdPRE из регуляторной области гена Ubx. Продемонстрировано, что транскрипция не является ключевым фактором для эпигенетически наследуемой инактивации элемента bxdPRE. Кроме того, даже интенсивная проходящая транскрипция не приводит к смещению с bxdPRE PcG-белков.
Цели и задачи исследования
Основной целью работы было исследование влияния проходящей транскрипции на PRE-элемент на примере сайленсера bxd 660 п.н. из регуляторной области гена Ubx.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать влияние терминаторов транскрипции SV40 на репрессионную активность bxdPRE в составе трансгенных конструкций.
-
Определить роль проходящей транскрипции в эпигенетически наследуемом переключении bxdPRE.
-
Проанализировать влияние проходящей транскрипции на связывание белков групп PcG и TrxG c bxdPRE.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
В работе впервые проанализировано влияние проходящей транскрипции на
сборку белковых комплексов на bxdPRE Drosophila. Показано, что белки PcG (PH,
dSFMBT, PC), гистоновая модификация H3K27me3, белки TrxG (TRX и GAF)
остаются ассоциированными с элементом bxdPRE вне зависимости от его статуса и
от присутствия проходящей через bxdPRE транскрипции. Установлено, что
проходящая транскрипция не осуществляет наследуемого эпигенетического
переключения bxdPRE. В работе также показано, что терминаторы транскрипции
SV40 стабилизируют репрессионную активность bxdPRE в трансгенных
конструкциях. Результаты работы показывают несостоятельность гипотезы,
предполагающей, что проходящая транскрипция является универсальным
механизмом эпигенетически наследуемого переключения PRE-элементов
Drosophila. Данные работы о стабилизации активности bxdPRE в трансгене с помощью терминаторов транскрипции SV40 могут быть использованы при создании трансгенных конструкций, содержащих ДНК-регуляторные элементы.
Методология и методы исследования
Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и генетики. В ходе выполнения диссертационной работы был использован широкий спектр методов, включающих методики обратной транскрипции РНК, иммунопреципитации хроматина, экспрессии и очистки белков и другие.
Положения, выносимые на защиту
-
Терминаторы транскрипции SV40 стабилизируют репрессионную активность bxdPRE в трансгенных конструкциях.
-
Проходящая транскрипция не осуществляет наследуемого эпигенетического переключения bxdPRE.
3) Белки PcG (PH, dSFMBT, PC), гистоновая модификация H3K27me3, белки TrxG
(TRX и GAF) остаются ассоциированными с элементом bxdPRE вне зависимости
от его статуса и от присутствия проходящей через bxdPRE транскрипции.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Результаты работы были представлены на двух научных конференциях и опубликованы в двух рецензируемых научных журналах (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованных по теме диссертации»).
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 215 наименований.
ДНК-регуляторные элементы Drosophila melanogaster
Для инициации транскрипции РНК-полимераза II эукариот вместе с основными факторами транскрипции собирается в преинициаторный комплекс [18]. Далее согласно классической схеме (применимой к TATA-содержащим промоторам) происходит ряд последовательных событий. В начале белок TBP комплекса TFIID узнает ТАТА-бокс. Вспомогательный комплекс TFIIA стабилизирует взаимодействие TFIID с ДНК. Белки TAF комплекса TFIID обеспечивают взаимодействие преинициаторного комплекса с активаторами и ко-активаторами транскрицпии) [36–38]. Для некоторых TAF у Drosophila показана тканеспецифичная экспрессия [39,40]. Предполагается, что смена TAFs в составе TFIID участвует в регуляции транскрипции.
Сборка транскрипционного комплекса на многих промоторах, не содержащих ТАТА-бокс, также происходит с участием TFIID. В таком случае привлечение на промотор может осуществляться за счет TAFs в составе TFIID, взаимодействующих с Inr [41,42] и DPE [30,43].
Фактор TFIIB способен взаимодействовать с TBP, РНК-полимеразой II и ДНК. Рентгеноструктурный анализ комплексов TFIIB с РНК-полимеразой II продемонстрировал участие этого фактора в позиционировании РНК-полимеразы в области инициатора и расплетении цепей ДНК для начала транскрипции [44]. После синтеза первых 12-13 нуклеотидов РНК происходит диссоциация TFIIB [45].
Фактор TFIIF взаимодействует с ДНК и РНК-полимеразой, участвуя в позиционировании фермента на ДНК и стабилизации преинициаторного комплекса [18]. Фактор TFIIE стабилизирует расплетённое состояние цепей ДНК и обеспечивает привлечение TFIIH, взаимодействуя с ним. TFIIH обладает ДНК-зависимой АТФазной активностью, обеспечивающей транслокацию ДНК.
Преинициаторные комплексы in vivo могут отличаться по составу от классических модельных систем. Так у Drosophila обнаружены белки TRF1 (TATA-box-binding protein related factor 1) и TRF2, являющиеся парологами TBP [46]. In vitro TRF1 может связываться с TATA-содержащими промоторами вместе с TFIIAFIIB и эффективно заменять TBP в транскрипции с таких промоторов. Однако в геноме Drosophila TRF1 колокализуется преимущественно с РНК-полимеразой III [47]. Белок TRF2 также способен напрямую взаимодействовать с TFIIA и TFIIB. Этот фактор необходим для активности ряда генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II и не содержащих ТАТА-бокс [48], в том числе рибосомальных.
РНК-полимераза II на промоторах может быть подвержена паузингу (от англ. pausing, задержка) [49–51]. Для сотен промоторов Drosophila на эмбриональной стадии развития и в культуре клеток S2 показан паузинг РНК-полимеразы II и остановка транскрипции на 20-60 п.н. ниже её старта [52–54]. При этом фермент синтезирует характерные короткие РНК. Такой транскрипционный комплекс на промоторе очень стабилен, время его полужизни может измеряться минутами, доходя до одного часа для небольшого количества генов [55]. Предполагается, что паузинг является важным механизмом в регуляции транскрипции. Приводя к накоплению фермента на промоторе, он способствует одновременной и быстрой активации генов при появлении активирующего сигнала. Так происходит, например, с промоторами генов теплового шока Drosophila, быстро активирующихся при повышении температуры за счёт появления активатора транскрипции HSF (heat shock factor) [49,56]. Механизмы, обеспечивающие паузинг РНК-полимеразы, до конца не ясны. Выявлен ряд белков, участвующих в паузинге промоторов. Среди них NELF [57], DSIF [58], GAF [59], M1BP [60].
Транскрипция большинства генов зависит от типа клеток, времени и внешних условий. Связь внешних сигналов с промотором осуществляется с помощью привлечения к нему транскрипционных факторов, активирующих транскрипцию, либо влияющих на неё негативно. Такие факторы могут влиять на сборку преинициаторного комплекса, скорость выхода РНК-полимеразы из паузинга. Также существенная роль отводится компактизации хроматина, снятию/сдвигу нуклеосом в области промотора, модификациям гистонов. Характерной гистоновой меткой для активных промоторов является триметилирование лизина в четвёртом положении гистона Н3 (H3K4me3) [61]. В экспериментах на позвоночных показано, что эта метка способствует формированию преинициаторного комплекса за счёт взаимодействия с белком TAF3 комплеса TFIID [62]. Также с ней взаимодействуют белки-компоненты комплексов ремоделинга хроматина и ацетилтрансферазного комплекса [63,64].
Транскрипция многих генов изменяется в зависимости от внешних стимулов. Такая регуляция часто осуществляется за счёт действия транскрипционных факторов, связывающихся с ДНК и взаимодействующих с аппаратом транскрипции. Коровые промоторы большинства регулируемых генов являются слабыми, и активная транскрипция с них возможна только с участием активаторов транскрипции [65].
У многоклеточных организмов появились энхансеры - последовательности ДНК, связывающие белки-активаторы транскрипции и способные взаимодействовать с промоторами на удалённых расстояниях [4,66]. Энхансеры способны взаимодействовать с промоторами на больших расстояниях, достигающих десятки т.п.н. Так, например, у Drosophila ген сut активируется энхансером, расположенном на расстоянии около 90 т.п.н. [67,68]. У одного гена может быть множество энхансеров, каждый из которых активен в определённом типе клеток, обеспечивая тканеспецифичную экспрессию [69]. Недавние исследования пространственных взаимодействий энхансеров с помощью методов на основе подхода 3С (chromatin conformation capture, фиксация конформации хромосом) говорят о возможности взаимодействия одного энхансера с несколькими промоторами [70]. Продемонстрировано сближение одного энхансера с промоторами нескольких генов, предполагается, что такое взаимодействие может быть функциональным [70].
Энхансеры представляют собой последовательности ДНК длиной несколько сотен п.н. [71]. Они могут быть расположены как между генами, так и внутри них, в том числе и в экзонах. Исследования в трансгенных системах и плазмидных конструкциях показали, что энхансеры способны активировать промоторы независимо от ориентации [72].
Переключение PRE в трансгенных моделях
Контроль активности под действием PRE-элементов был продемонстрирован и для энхансеров Bithorax-комплекса, работающих в имагинальных дисках [192]. Имагинальные диски являются зачатками, из которых развиваются органы взрослой мухи (глаза, крылья, ноги и т.д.). В свою очередь, они являются потомками клеток разных парасегментов эмбрионов. Например, имагинальные диски крыльев и второй пары ног, относящиеся ко второму грудному сегменту (Т2) личинки и взрослой мухи, формируются из posterior части 4-го парасегмента и anterior части 5-го (рис. 10). Имагинальные диски халтер и третьей пары ног, относящиеся к третьему грудному сегменту (Т3), формируются из posterior части 5-го парасегмента и anterior части 6-го.
В составе Bithorax-комплекса энхансеры имагинальных дисков расположены в непосредственной близости от PRE-элементов и эмбриональных энхансеров. Было продемонстрировано, что PRE обеспечивают передачу статуса активности эмбриональных энхансеров энхансерам имагинальных дисков [91].
В составе трансгенов энхансеры имагинальных дисков на стадии эмбриогенеза не работают (рис. 9В), но бесконтрольно активируют экспрессию репортерного гена на стадии личинки. В то же время эти энхансеры сами не определяют паттерн активности репортера, и в присутствии PRE не активны. Только в присутствии также эмбриональных энхансеров и PRE-элемента происходит формирование пространственно-специфичной активации транскрипции энхансерами имагинальных дисков. Было показано, что поздний эмбриональный энхансер в присутствии PRE также не может обеспечить активность репортерного гена в трансгенных конструкциях [193]. Хотя по силе использованный энхансер сравним с ранними эмбриональными. Таким образом, PRE способны репрессировать ген на разных стадиях, инактивируя действие энхансеров с разной стадиоспецифичностью. При этом статус PRE определяется на раннем этапе эмбриогенеза (0-6 часов) под действием ранних энхансеров, после чего сохраняется неизменным на всех стадиях развития. Открытым остаётся вопрос о том, как энхансер сообщается с PRE-элементом, инактивируя его.
Описанные эксперименты показывают, что PRE может быть выключен на ранних этапах эмбриогенеза таким активаторным элементом, как энхансер. Только ли ранние эмбриональные энхансеры Bithorax-комплекса могу переключать PRE? Трансгенные системы позволяют размещать рядом с репортерным геном и PRE любые ДНК-элементы, подобные энхансерам. Таким элементом является последовательность UAS (Upstream Activated Sequences) дрожжей. Она содержит сайты связывания для дрожжевого белка активатора транскрипции GAL4. В работах с переключением PRE в трансгенных конструкциях часто использовались искусственные UAS, содержащие мультиплицированные ДНК-сайты для GAL4. При экспрессии этого белка у Drosophila UAS становится мощным активатором транскрипции, действуя подобно сильному энхансеру. Такая система даёт большую свободу в постановке экспериментов, поскольку геном мух не кодирует GAL4, а без этого белка UAS – не более, чем линкерная последовательность. Управляя экспрессией GAL4, можно управлять работой энхансера UAS. На основе трансгенных конструкций, содержащих ген GAL4 под разными промоторами, создано множество драйверов экспрессии этого белка. GAL4 можно экспрессировать стадиоспецифично, используя эмбриональный, либо личиночный энхансер. Можно осуществлять экспрессию тканеспецифично, используя энхансеры соответствующих свойств. Отдельно стоит сказать о драйвере, в котором ген GAL4 расположен под промотором гена hsp70 (рис. 11А). У таких мух тепловой шок запускает повсеместную интенсивную транскрипцию гена, прекращающуюся вскоре после окончания теплового шока.
В ряде работ проверялась способность UAS при экспрессии GAL4 переключать PRE в трансгенных конструкциях.
Эпигенетическое переключение PRE на эмбриональной стадии [194], [90], с изменениями. А) Экспериментальная система для индуцированной активации UAS.
Тепловой шок приводит к активации промотора hsp70, контролирующего экспрессию GAL4 в трансгенной конструкции. Во второй трансгенной конструкции содержатся UAS, PRE и репортерные гены. Б) Без экспрессии GAL4 наблюдается репрессия репортерных генов lacZ и white. В) При экспрессии GAL4 на личиночной стадии наблюдается активность lacZ только на этой стадии. Г) При экспрессии GAL4 на эмбриональной стадии происходит наследуемое переключение PRE: активность гена lacZ наблюдается не только на эмбриональной, но и на личиночной стадии; активность гена white видна на взрослой стадии.
Пример такого эксперимента приведён на рисунке 11. В ряде работ использовали трансген с PRE и парой репортеров – геном -галактозидазы (lacZ) и геном white. Также в конструкции между PREи репортерами был встроен UAS. Ген white отвечает за окраску глаз у Drosophila. При высокой экспрессии этого гена глаза у мух имеют нормальную ярко-красную окраску. При слабой экспрессии гена наблюдается жёлтый, либо оранжевый цвет глаз. При отсутствии экспрессии глаза имеют белый цвет. В исходном трансгене PREрепрессирует репортерные гены (рис. 11Б), что выражено в слабой пигментации глаз. Для экспрессии GAL4 трансген с PRE с помощью скрещиваний мух совмещали с трансгеном, несущим ген GAL4 под контролем промотора hsp70 (рис. 11А). Кратковременный тепловой шок на разных стадиях развития, сопровождающийся экспрессией GAL4, имитирует в этой системе работу стадиоспецифичных энхансеров. Как показано на рис. 11В, экспрессия GAL4 на личиночной стадии приводит к активации гена -галактозидазы только на стадии личинки. Анализ по фенотипу глаз работы гена white на взрослой стадии демонстрирует, что во времени за пределы личиночной стадии эта активация не распространяется. Однако при тепловом шоке на эмбриональной стадии (рис. 11Г) репрессия с репортерных генов снимается на всех последующих стадиях развития. В данном случае можно говорить о наследуемом эпигенетическом переключении PRE, которое происходит под действием GAL4 на эмбриональной, но не на личиночной стадии развития. Интересно, что в данной системе PRE не только выключается как репрессор, но и становится активатором транскрипции репортерных генов, имитируя действие UAS-активатора после исчезновения GAL4 [90].
Несколько фактов из упомянутых экспериментов заслуживают особого внимания. Прежде всего, это разные эффекты при переключении PRE с помощью энхансеров из Bithorax-комплекса и UAS. В случае, если на эмбриональном этапе развития ген, расположенный рядом с PRE, не подвергался активации, PRE эффективно его репрессирует в любой системе. При этом последующая активация гена с помощью энхансера личиночной стадии из Bithorax-комплекса не удаётся. В то же время при использовании UAS с экспрессией GAL4 на личиночной стадии можно включить репортерный ген. Хотя при этом не происходит наследуемого эпигенетического переключения – вскоре после исчезновения GAL4 PRE снова становится репрессором. Таким образом, наследуемое эпигенетическое переключение возможно только на эмбриональной стадии, но сильный энхансер может инактивировать PRE на любой стадии развития на то время, пока этот энхансер активен. Причём не каждый энхансер способен на это. Белок GAL4, связанный с UAS – очень эффективный активатор транскрипции. Вероятно, энхансеры личиночной стадии из комплекса Bithorax – более слабые активаторы и не могут противостоять PcG-репрессии. Подобные эксперименты проводились с разными PRE из Bithorax-комплекса: bxdPRE, Fab7PRE [194,195], McpPRE [9]. А также для PRE из промоторной областиг гена hedgehog [196].
Стоит разделять два типа эпигенетического переключения. При использовании эмбриональных энхансеров Bithorax-комплекса наблюдается выключение PRE там, где активен энхансер. Но когда этот эмбриональный энхансер прекращает работу, транскрипция репортерного гена также прекращается. В этой ситуации PRE обеспечивает память только репрессионного состояния гена. Однако при использовании в системе UAS с экспрессией GAL4 на эмбриональной стадии PRE обеспечивает также память активного состояния репортеров на последующих стадиях развития. Причина такого различия в действии UAS и эмбриональных энхансеров на PRE не ясна.
Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и white в трансгенных линиях
Очистку антител, афинных к исследуемому антигену, проводили из иммунной сыворотки с помощью хромотографии на колонке с сефарозой, несущей ковалентно пришитый антиген. Использовали триазиновый метод посадки белка на сефарозу. Посадка белка на сефарозу
Для ковалентного связывания антигена с сефарозой использовали цианурхлорид – соединение из группы триазинов. Замещение атомов хлора в молекуле цианурхлорида на функциональные группы сефарозы и молекул белка позволяет осуществить ковалентную пришивку антигена к сефарозе. На первом этапе производили активацию сефарозы – к ней ковалентно пришивали цианурхлорид. Для создания сорбента для одной хромотографической колонки брали 5 мл сефарозы (CL-4B General Electric), промывали сефарозу 25 мл воды, затем 25 мл NaOH 12%. Промытую сефарозу суспендировали в 5 мл NaOH 12% и перемешивали на магнитной мешалке во льду. 1 г цианурхлорида (Sigma) растворяли в 10 мл ацетона. Добавляли полученный раствор к суспензии сефарозы и перемешивали на магнитной мешалке в течение 2 часов. Далее отмывали сефарозу последовательно 40 мл 50% ацетона и 50 мл воды. Полученную таким образом сефарозу до дальнейшего использования хранили в 20% этаноле.
Белок, предназначенный для посадки на сефарозу, с помощью диализа переводили в буфер для связывания (50 мМ ацетат натрия, 0.5 М NaCl, 4 М мочевина, pH 5.2). После диализа цетрифугировали препарат белка в течение 10 минут 14000 g, далее использовали супернатант. 2 мл суспензии активированной сефарозы переносили в колонку и промывали 30 мл буфера для связывания. Далее добавляли препарат белка (1-10 мг на 1 мл сефарозы). Доводили конечный объём суспензии до 5-10 исходных объёмов суспензии сефарозы, инкубировали при медленном вращении на ротаторе 2-3 часа при комнатной температуре, либо в течение ночи при +4 C. Сливали из колонки препарат белка.
Из проскока для анализа отбирали аликвоту объёмом 5 мкл. Эта аликвота анализироваллась вместе с аликвотой белкового препарата до инкубации с сефарозой с помощью окрашивания красителем Кумасси: 5 мкл препарата наносили на бумагу 3ММ, дожидались высыхания капли и инкубировали в течение 30 секунд в растворе красителя Кумасси R-250 (2.5 г/л Кумасси R-250, 10 % уксусная кислота). После этого промывали бумагу горячей водой. В случае успешного ковалентного связывания белка с колонкой наблюдали уменьшение окрашивания на бумаге 3ММ аликвоты проскока в сравнении с препаратом белка до инкубации с сефарозой.
Промывали сефарозу последовательно 30 мл буфера для связывания и 20 мл буфера для забивки активных центров (2 М имидазол, 50 мМ ацетат натрия, pH 5.0-5.5). Добавляли 10 мл буфера для забивки, инкубировали в течение 2-3 часов, либо ночи при медленном вращении на ротаторе. После инкубации промывали колонку попеременно 10 мл высокосолевых буферов с высоким и низким pH. Высокосолевой буфер с низким pH: 0.1 М глицин, pH 2.5, 0.5 М NaCl, охлаждённый до +4 C. Высокосолевой буфер с высоким pH: 0.1 М Трис-HCl pH 8.0, 0.5 М NaCl, охлаждённый до +4 C. Попеременную отмывку этими буферами повторяли 3 раза. Промывали сефарозу 30 мл буфера PBS (1.7 мМ KH2PO4, 5.2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, pH 7.4). Полученную сефарозу с ковалентно пришитым белком хранили в 20% этаноле.
Афинная очистка антител из сыворотки Перед целевой чисткой иммуноглобулинов из сывороток во всех случаях предварительно проводилась «холостая» чистка антител из тех же препаратов сывороток. Это связано с тем, что подготовленный сорбент – сефароза с ковалентно пришитым антигеном работает оптимально со второго использования.
Для «холостой» чистки антител сефарозу в колонке промывали 30 мл PBS. Далее к сефарозе добавляли 2 мл иммунной сыворотки и 2 мл PBS. Инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре при медленном вращении на ротаторе. Промывали сефарозу последовательно 10 мл PBS, 40 мл высокосолевого буфера с низким pH, 10 мл высокосолевого буфера с высоким pH, 20 мл PBS. После этого считали сефарозу готовой для целевой чистки антител. В случае, если очистка не предполагалась сразу, хранили сефарозу в колонке в 20% этаноле.
Добавляли к промытой сефарозе 5 мл иммунной сыворотки и 5 мл PBS, инкубировали 2 часа при комнатной температуре при медленном вращении на ротаторе. Сливали из колонки сыворотку, промывали сефарозу 30 мл PBS. Далее элюировали с колонки связавшиеся белки. Проводили серию последовательных элюций 1,9 мл 0.1 М глицина pH 2.7 в пробирки с 50 мкл 1 М Трис-HCl pH 9.5. После элюции для отмывки сефарозы пропускали через колонку последовательно 20 мл высокосолевого буфера с низким pH, 10 мл высокосолевого буфера с высоким pH, 10 мл PBS, 20 мл 20% этанола. Хранили сефарозу в колонке с 20% этанолом.
Полученные фракции элюции предварительно анализировали с помощью окрашивания их аликвот на бумаге 3ММ раствором кумассии. Фракции, содержащие белок, диализовали при +4 С в PBS с однократной заменой буфера на свежий, далее – в PBS с 30% глицерином. Полученные препараты очищенных антител хранили при -20 С.
Антитела были получены путём иммунизации кроликов препаратом белка-антигена с добавлением адъюванта Фрейнда. Для гистоновой модификации H3K27me3 использовались коммерческие антитела Abcam (артикул ab6002).
Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC
Репрессия генов за счёт активности белков PcG часто встречается в геноме Drosophila. Центральную роль в привлечении этих белков на хроматин играют последовательности ДНК, называемые PRE [90]. PRE являются точками связывания PcG-белков в геноме, наличие этого элемента способно обеспечивать репрессию окружающих генов. Обнаружены и биохимически охарактеризованы три основных комплекса PcG-белков: PRC2, PRC1 и PHO-RC [5]. Все они локализуются на PRE, однако лишь PHO-RC содержит ДНК-связывающий белок – PHO, либо его гомолог PHO-like. PHO-RC участвует в привлечении комплексов PRC1 и PRC2 на хроматин, однако не для всех PRE. Другой компонент комплекса PHO-RC – белок dSFMBT. Комплекс PRC2 состоит из белков E(Z), SU(Z)12, ESC (либо его близкий гомолог ESC-like) и NURF55. Белок E(Z) вносит гистоновую модификацию H3K27me3. С этой меткой способен связываться белок PC – компонент комплекса PRC1. Другие белки, входящие в состав корового PRC1 – PSC, PH и SCE.
Репрессионный эффект PRE на транскрипцию хорошо изучен в трансгенных конструкциях [90]. Как правило, в составе трансгена эти элементы подавляют экспрессию репортерных генов. При этом PRE-элементы в копиях конструкции на гомологичных хромосомах могут взаимодействовать, что обеспечивает усиление репрессионной активности. В естественном контексте генома PRE могут как репрессировать ген, так и не делать этого. Таким образом, существует механизм переключения PRE, снимающий его репрессионную активность. Как реализуется это переключение неизвестно. Примером сайленсера, переключающегося в естественном контексте генома, является bxdPRE из регуляторного домена bxd/pbx регуляторной области гена Ubx. В парасегментах эмбриона с первого по пятый bxdPRE репрессирует регуляторный домен bxd/pbx, содержащий энхансеры для гена Ubx. В остальных девяти парасегментах bxdPRE неактивен и работают энхансеры регуляторного домена, активирующие транскрипцию Ubx. Для области bxd/pbx в состоянии PcG-репрессии характерен высокий уровень гистоновой модификации H3K27me3, вносимой PcG-комплексом PRC2. В то же время, в парасегментах, где bxdPRE не активен, метка H3K27me3 практически отсутствует. Стоит отметить, что регуляторные области гена Ubx содержат не только bxdPRE, но и ещё один PRE - bx. Оба этих сайленсера могут быть синхронно выключены в пределах одного парасегмента. Предположительно, для них инактивация PcG-репрессии происходит схожим образом.
В пределах регуляторного домена присутствует так называемый инициатор – раннеэмбриональный энхансер, работа которого делает регуляторный домен активным [98]. В случае, если инициатор не работает, домен оказывается подверженным PcG-репрессии. Инициатор в регуляторном домене активен только в определённых парасегментах. Активность инициатора зависит от присутствия транскрипционных факторов, кодируемых генами из групп maternal, gap и pair-ruled. Именно они являются наиболее ранней детерминантой идентичности парасегментов. Инициатор активирует регуляторный домен, блокируя установление в нём PcG-репрессии. Важный вопрос заключается в том, как инициатор сообщается с PRE и переключает его активность. Распространена гипотеза о том, что инициатор активирует транскрипцию через PRE-элемент. Предполагается, что проходящая транскрипция способна смещать с PRE репрессионные белки и таким образом менять его статус. Есть ряд данных, косвенно подтверждающих эту модель. У Drosophila обнаружены некодирующие РНК, комплементарные последовательностям PRE-элементов Bithorax-комплекса [197]. Есть положительная корреляция между активностью регуляторного домена и транскрипцией в нём некодирующих РНК. Они транскрибируются в тех парасегментах, в которых активен содержащий их последовательности домен. В трансгенных системах было показано, что присутствие дрожжевого активатора транскрипции GAL4 на ДНК вблизи PRE может осуществлять переключение этого элемента в неактивное состояние. При этом с последовательностей, окружающих коровый PRE-элемент, запускается транскрипция через PRE [9]. Возможно, эти последовательности содержат нелокализованные пока промоторы, активируемые GAL4. По литературным данным, переключение с помощью GAL4 наблюдалось для нескольких PRE. Предполагается, что оно могло происходить именно за счёт активации транскрипции через элемент. Тем не менее, влияние проходящей транскрипции на репрессионные комплексы на PRE не проверялось. Также не ясно, всегда ли переключение PRE сопровождается проходящей транскрипцией. Открыт вопрос о роли некодирующих транскриптов Bithorax-комплекса: являются они причиной, либо следствием инактивации PRE.
В данной работе напрямую были проанализированы эффекты проходящей транскрипции на PRE. Для этого был использован bxdPRE 660 п.н. и индуцируемый белком GAL4 минимальный промотор гена hsp70. Как и в предыдущих исследованиях, в этой системе связывание GAL4 в области конструкции вызывало инактивацию репрессионной активности PRE. Однако это переключение активности не зависело от того, направлена ли индуцируемая GAL4 транскрипция в сторону bxdPRE. Также обнаружено, что транскрипция через PRE не способна осуществлять эпигенетическое переключение данного сайленсера. Как только в системе исчезал белок GAL4 и активируемая им транскрипция через PRE, репрессия репортерного гена white восстанавливалась.
Анализ белковых комплексов на PRE с помощью иммунопреципитации хроматина даёт возможное объяснение указанным наблюдениям. Эти эксперименты показали, что даже в случае непрерывного прохождения интенсивной транскрипции через bxdPRE PcG-белки PH, dSFMBT и PC остаются связанными с bxdPRE. Эффект проходящей транскрипции на ассоциацию белка PC с PRE был минимален. Для белков PH и dSFMBT наблюдалось приблизительно двукратное уменьшение связывания. Также при транскрипции снижалось обогащение меткой H3K27me3. Данный эффект был выражен сильнее на взрослой стадии развития Drosophila. При этом полного исчезновения H3K27me3 не происходило. Таким образом, проходящая транскрипция не способна осуществлять снятие PcG-комплексов с bxdPRE, а также препятствовать внесению модификации H3K27me3. Вне зависимости от наличия проходящей транскрипции при инактивации bxdPRE на этом элементе происходило увеличение обогащения белками TRX и GAF в 1,5-2 раза. Такая ситуация наблюдалась на взрослой стадии развития. На эмбриональной стадии обогащение белками TRX и GAF достоверно не изменялось. Эти два белка относятся к семейству Trithorax, и увеличение их присутствия на PRE может быть частью механизма переключения.