Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Структура и функции митохондрий 9
1.1.1. Общее строение митохондрий 9
1.1.2. Потенциал митохондрий и синтез АТФ 12
1.1.3. Митохондриальные красители 14
1.1.4. Регуляция концентрации ионов Са2+ митохондриями 16
1.1.5. Транспорт в митохондрию 18
1.1.6. Генерация активных форм кислорода 21
1.1.7. Динамика и подвижность митохондрий 23
1.2. Промежуточные филаменты (ПФ) 26
1.2.1. Строение ПФ 27
1.2.2. Сборка ПФ
1.2.2.1. Формирование димеров 30
1.2.2.2. Формирование тетрамеров 31
1.2.2.3. Формирование протофиламентов единичной длины и дальнейшие этапы сборки 1.2.3. Динамика ПФ в клетке 34
1.2.4. Фосфорилирование белков ПФ
1.2.4.1. Фосфорилирование ПФ in vitro 36
1.2.4.2. Фосфорилирование ПФ in vivo 36
1.2.5. Функции виментина. Болезни, связанные с ПФ 38
1.3. Белок Rac1 и его эффектор протеинкиназа РАК1 40
1.3.1. Белок Rac1 42
1.3.1.1. Строение белка Rac1 42
1.3.1.2. Подходы к изучению функций белка Rac1 43
1.3.2. Функции белка Rac1 45
1.3.2.1. Регуляция концентрации АФК белком Rac1 45
1.3.2.2. Регуляция динамики цитоскелета белком Rac1 47
1.3.3. Эффектор белка Rac1 – протеинкиназа РАК1 48
1.3.3.1. Строение протеинкиназы РАК1 48
1.3.3.2. Регуляция киназной активности РАК1 49
1.3.3.3. Функции протеинкиназы РАК1 51
1.4. Перестройки цитоскелета как способ регуляции функционального состояния митохондрий 52
1.4.1. Влияние цитоскелета на распределение и функционирование митохондрий 53
1.4.2. Роль функционального состояния митохондрий в физиологии клетки. Цитотоксические препараты 55
1.4.3. Модель механизма регуляции взаимодействия митохондрий с цитоскелетом 59
Цель и задачи исследования 61
Глава 2. Материалы и методы 62
2.1. Клеточные линии и культивирование клеток 62
2.2. Трансфекция клеток 63
2.3. ДНК-конструкции
2.3.1. Конструкции, кодирующие различные формы белка Rac1 63
2.3.2. Конструкции, кодирующие различные формы виментина 64
2.3.3. Конструкции, кодирующие различные формы протеинкиназы РАК
2.4. Окрашивание клеток митохондриальными потенциалзависимыми красителями 66
2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание 2.5.1. Фиксация клеток 66
2.5.2. Иммунофлуоресцентное окрашивание 67
2.5.3. Антитела к виментину и окраска актиновых микрофиламентов 67
2.6. Микроскопия 67
2.6.1. Методика проведения микроскопии живых и зафиксированных клеток 67
2.6.2. Анализ относительной подвижности митохондрий 68
2.6.3. Определение трансмембранного потенциала митохондрий 70 2.7. Получение линий клеток, стабильно экспрессирующих различные типы виментина 71
2.8. Определение устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам 2.8.1. МТТ-тест 72
2.8.2. Тест с нейтральным красным 73
2.8.3. Построение кривых выживаемости 73
Глава 3. Результаты 75
3.1. Влияние Rac1 на подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий 3.1.1. Сравнение относительной подвижности митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин, в присутствии мутантных форм белка Rac1 75
3.1.2. Влияние мутантных форм белка Rac1 на относительную подвижность митохондрий в клетках с восстановленным виментином 76
3.1.3. Кинетика относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих Rac1-LOV2 78
3.1.4. Влияние Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин
3.2. Поиск эффектора белка Rac1 в регуляции подвижности митохондрий 81
3.3. Проверка участия протеинкиназы РАК1 в регуляции подвижности и трансмембранного потенциала митохондрий
3.3.1. Влияние каталитического домена РАК1 на подвижность митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин 84
3.3.2. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции подвижности митохондрий 85
3.3.3. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции трансмембранного потенциала митохондрий 86
3.4. Изучение роли остатка серина-55 виментина в регуляции взаимодействия митохондрий с виментином 88 3.4.1. Сборка ПФ из точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование 88
3.4.2. Влияние точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование, на подвижность митохондрий 90
3.4.3. Сборка ПФ из нефосфорилируемых аналогов виментина 90
3.4.4. Влияние нефосфорилируемых мутантов виментина на регуляцию подвижности митохондрий белком Rac1 93
3.4.5. Влияние нефосфорилируемых аналогов виментина на эффект Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий 94
3.5. Влияние взаимодействия митохондрий с виментиновыми ПФ на
устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам 95
Глава 4. Обсуждение результатов 100
Выводы 111
Список принятых сокращений 112
Список литературы 115
- Потенциал митохондрий и синтез АТФ
- Влияние цитоскелета на распределение и функционирование митохондрий
- Конструкции, кодирующие различные формы протеинкиназы РАК
- Влияние Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящей работе предложен механизм регуляции взаимодействия митохондрий с виментиновыми промежуточными филаментами (ПФ) малой ГТФазой Rac1. Митохондрии играют особую роль в жизнедеятельности клетки благодаря способности синтезировать АТФ, участвовать в регуляции внутриклеточной концентрации кальция и контролировать апоптоз. Функции митохондрий зависят от их внутриклеточного распределения. С одной стороны, во многих клетках митохондрии располагаются вблизи мест высокого потребления энергии. С другой стороны, известен ряд патологий, при которых неправильная локализация митохондрий приводит к нарушениям в их структуре и функционировании. Нарушение правильной работы митохондрий может влиять на многие клеточные процессы, приводя к уменьшению устойчивости клеток к внешним неблагоприятным воздействиям.
Правильное распределение митохондрий внутри клеток достигается в том числе с помощью взаимодействия с ПФ. ПФ в клетках соединительной ткани состоят из белка виментина (Fuchs et al., 1994). Во многих работах представлены данные о том, что митохондрии взаимодействуют с ПФ (Leterrier et al., 1994; Reipert et al., 1999). Важность ПФ подчеркивается результатами опытов с фибробластами из мышей, нокаутных по гену виментина (Tolstonog et al., 2005). У митохондрий в таких клетках наблюдается прогрессирующее разрушение их матрикса, снижение трансмембранного потенциала и способности синтезировать АТФ. Также фибробласты без виментина сильнее подвержены апоптозу и не способны к спонтанной иммортализации (Tolstonog et al., 2001).
Ранее в нашей лаборатории был обнаружен участок в N-концевой области молекулы виментина, отвечающий за взаимодействие с митохондриями (Nekrasova et al., 2011). Впоследствии оказалось, что взаимодействие митохондрий с ПФ влияет не только на подвижность митохондрий, но и на их трансмембранный потенциал. Восстановление виментиновых ПФ в клетках приводит к увеличению трансмембранного потенциала митохондрий, а удаление их в результате РНК-интерференции – к его снижению (Chernoivanenko et al., 2015). Таким образом, виментиновые ПФ могут влиять не только на распределение митохондрий в клетке, но и на их функциональные свойства, такие как уровень трансмембранного потенциала на внутренней мембране, синтез АТФ и продукцию АФК. Значит, взаимодействие митохондрий с виментином должно находиться под строгим регуляторным контролем внешних и внутренних факторов.
В настоящей работе показано, что главным регулятором переключения митохондрий из стационарного в подвижное состояние является малая ГТФаза Rac1. Когда Rac1 переходит в ГТФ-связанное состояние под действием внешних факторов, она активирует свой эффекторный белок – протеинкиназу РАК1. В результате активации РАК1 происходит фосфорилирование виментина по остатку серина-55. Это нарушает взаимодействие митохондрий с N-концевым участком виментина из-за появления в нем отрицательного заряда. В результате этого меняется их подвижность. Важным следствием такого перехода в подвижное состояние является снижение трансмембранного потенциала митохондрий и уменьшение устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось изучение механизма регуляции взаимодействия митохондрий с виментиновыми промежуточными филаментами в клетках млекопитающих и влияния этого взаимодействия на устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам. Для этого были поставленные следующие задачи:
1. Выяснить, как малая ГТФаза Rac1 влияет на относительную подвижность и
трансмембранный потенциал митохондрий в клетках с виментином и клетках без
виментина.
2. Определить, какой эффектор белка Rac1 отвечает за регуляцию подвижности и
потенциала митохондрий.
-
Изучить роль остатка Ser55 молекулы виментина в регуляции взаимодействия митохондрий с промежуточными филаментами.
-
Выяснить, как связывание митохондрий с виментином влияет на выживаемость клеток в присутствии цитотоксических препаратов.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе выполнения данной работы обнаружен новый механизм регуляции подвижности и трансмембранного потенциала митохондрий. Показано, что центральным звеном этой регуляции является белок Racl - малая ГТФаза семейства Rho. При активации Racl увеличивается подвижность митохондрий и падает их трансмембранный потенциал, причем только в виментин-содержащих клетках. Найдена мишень белка Racl, отвечающая за этот эффект, - протеинкиназа РАК1. Показано, что важную роль в обнаруженном механизме играет аминокислотный остаток серина-55 молекулы виментина, являющийся мишенью протеинкиназы РАК1. Предлагаемый в данной работе механизм является первым известными примером модулирования свойств митохондрий под действием внешних факторов.
Результаты данной работы вносят вклад в понимание роли виментина в регуляции свойств митохондрий и клеток в целом. Полученные результаты говорят о том, что виментин оказывает митопротекторное действие. Эти данные впервые указывают на возможную причину высокой экспрессии виментина в метастатических опухолях и при развитии резистентности к проводимой химиотерапии. Обнаруженный регуляторный каскад, отвечающий за взаимодействие с митохондриями и регуляцию клеточной подвижности, может быть важной мишенью при разработке новых лекарственных препаратов, препятствующих метастазированию и развитию резистентности злокачественных опухолей. Кроме того разработанные и оптимизированные в данной работе методики могут применяться в фундаментальных клеточно-биологических и биомедицинских исследованиях, связанных с исследованием функциональных свойств митохондрий.
Вклад автора. Автором спланированы и выполнены все эксперименты, описанные в диссертационной работе. Автором разработан оригинальный метод одновременной экспрессии в безвиментиновых клетках различных мутантных форм виментина с мутантными формами белка Rac1. Автором лично получены: линии фибробластов, стабильно экспрессирующих различные мутантные формы виментина; линии фибробластов, экспрессирующих различные мутантные формы виментина одновременно с Racl. Совместно с Черноиваненко И. В. был разработан метод определения трансмембранного потенциала митохондрий в полученных клеточных линиях. Совместно с Венковой Л. С. был разработан метод оценки устойчивости полученных клеточных линий к различным цитотоксическим препаратам.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009" (Москва, МГУ имени М. В. Ломоносова, 2009 г.), школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, путей передачи сигнала и цитоскелета (Санкт-Петербург, 2009 г.), I Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2011 г.), Ежегодной встрече Американского общества клеточных биологов (Сан-Франциско, США, 2012 г.), 8 Европейской конференции по промежуточным филаментам в норме и при патологии (Амстердам, Нидерланды, 2013 г.), Конгрессе по вопросам клеточной архитектуры (Париж, Франция, 2014 г.), II Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2015 г.), а также на Ежегодных научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 2011, 2012, 2015 г.).
Публикации. По данным работы опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах, материалов российских и международных конференций - 13.
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 264 источника. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 2 таблицы и 23 рисунка.
Потенциал митохондрий и синтез АТФ
Одной из важнейших вех в понимании природы клеточного дыхания явилось открытие Гансом Кребсом в 1937 году цикла трикарбоновых кислот – аэробного процесса, в ходе которого происходит превращение двух- и трхуглеродных соединений, образующихся как промежуточные продукты при распаде углеводов, жирных кислот и аминокислот, до углекислого газа (Krebs et al., 1937). Позже было показано, что именно матрикс митохондрий является местом локализации ферментов цикла Кребса. Митохондрии могут использовать в качестве источника энергии как пируват, получающийся в ходе расщепления углеводов гликолизом, а также расщепления аминокислот, так и жирные кислоты. Все эти источники энергии превращаются в митохондриях в ацетил-КоА. На первой стадии цикла Кребса ацетил-КоА соединяется с оксалоацетатом, в результате чего образуется шестиуглеродное соединение – цитрат. Далее в семи последовательных ферментативных реакциях происходит окисление цитрата до оксалоацетата. При этом выделяются две молекулы СО2. Освободившиеся электроны восстанавливают молекулы коферментов (NAD+ и FAD) (Alberts et al., 2008).
Восстановительные эквиваленты окисляются затем в электрон транспортной цепи (ЭТЦ). ЭТЦ – это система переносчиков, которые осуществляют перенос атомов водорода или электронов с NADH на молекулу кислорода. В митохондриях перенос атомов водорода или электронов с NADH на кислород происходит в несколько стадий за счет участия дополнительных переносчиков электронов, у которых значения стандартных окислительно-восстановительных потенциалов имеют промежуточное значение по сравнению с парами NAD+/NADH (Е0 = - 0,32 B) и кислород/вода (Е0 = + 0,82 B). Некоторые из этих переносчиков образуют пул (во внутренней митохондриальной мембране – пара убихинон/убихинол, в межмембранном пространстве – пара окисленный цитохром с/восстановленный цитохром с). Но большинство находятся в составе многокомпонентных белковых комплексов внутренней митохондриальной мембраны – так называемых комплексов дыхательной цепи (FMN, железосерные кластеры, гемы и другие) (Berry et al., 2000; Sazanov, 2007; Tsukihara et al., 1996; Wikstrom et al., 2006; Ленинджер, 1985).
Энергия, высвобождающаяся при переносе электронов с одного переносчика на другой в составе комплексов I, III и IV дыхательной цепи, позволяет осуществлять также перенос протонов из матрикса митохондрии в межмембранное пространство (хемиосмотическое сопряжение). Этот перенос приводит к формированию электрохимического градиента протонов – Н+. В обычной клетке электрохимический градиент протонов составляет 220 мВ (Виноградов, 1999; Скулачв, 1989). Существуют два разных способа генерации Н+. Первый механизм носит название окислительно-восстановительной петли. Он основан на чередовании переноса через мембрану восстановительных эквивалентов в форме атомов водорода и в форме электронов (Mitchell, 1961). Примером генерации Н+ по этому механизму является комплекс III.
Второй возможный механизм генерации H+ получил название «протонной помпы». В данном случае энергия окислительно-восстановительных реакций сопрягается с конформационными изменениями в белке и изменением значений рК различных протон-акцепторных групп. За счет этих событий происходит непосредственный трансмембранный перенос ионов Н+. По механизму протонной помпы происходит генерация потенциала комплексами I и IV.
Создавшийся электрохимический градиент протонов (H+) идет на работу АТФ-синтетазы, которая синтезирует АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Этот процесс получил название окислительное фосфорилирование. АТФ-синтетаза представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс с молекулярной массой более 500 кДа, работающий по роторному механизму. Каталитический центр, осуществляющий синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата, находится на -субъединице F1. Синтез АТФ происходит благодаря циклически повторяющимся конформационным изменениям в -субъединицах (Boyer, 1997; Meier et al., 2005; Stock et al., 2000; Weber, 2007).
Кроме синтеза АТФ, H+ служит источником энергии для широкого ряда процессов. К ним относятся транспорт различных ионов и молекул (пирувата, АДФ, АТФ, фосфата и др.) через внутреннюю мембрану, энергозависимый обратный транспорт электронов, а также трансгидрогеназная реакция. Накопленная в виде H+ энергия может быть потрачена в тепло без сопряжения с каким-либо другим процессом. Такая диссипация происходит у млекопитающих в буром жире. Отличительной особенностью митохондрий бурого жира является наличие термогенина. Это белок, имеющий структурное сходство с АТФ-АДФ антипортером и являющийся природным разобщителем дыхательной цепи и синтеза АТФ (Brand, 2005; Nicholls, 2006).
Влияние цитоскелета на распределение и функционирование митохондрий
Одним из основных факторов, позволяющих регулировать внутриклеточный транспорт, является способность цитоскелета к структурным перестройкам в ответ на внешние стимулы (Минин et al., 2004). Центральную роль в регуляции организации компонентов цитоскелета играют Rho-ГТФазы – подгруппа суперсемейства Ras малых ГТФ-гидролаз, а именно белки RhoА, Сdc42 и Rac1 (Hall et al., 2000; Ridley, 1996; Van Aelst et al., 1997). Rho-ГТФазы в клетках активируются в ответ на сигналы, полученные клеточными рецепторами от внешних ростовых факторов. Например, лизофосфатидная кислота активирует RhoА, брадикинин активирует Сdc42. Rho-ГТФазы включают нижестоящие белки-мишени, которые либо непосредственно изменяют структуру актиновых микрофиламентов, микротрубочек и ПФ, либо передают сигнал на дальнейшие эффекторы.
Малые ГТФазы совершают цикл между активной ГТФ-формой, в которой они могут связываться с различными белками-мишенями, и неактивной ГДФ-формой. Переход из одной формы в другую регулируется многочисленными клеточными факторами. Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов (GDP/GTP exchange factors – GEF) стимулируют присоединение ГТФ к Rho-ГТФазам, тем самым активируя их. Белки, активирующие ГТФазу (GTPase-activating proteins – GAP), увеличивают ГТФ-азную активность Rho-белков и инактивируют их (Etienne-Manneville et al., 2002; Schmidt et al., 2002). В клетке часть молекул ГТФаз находятся в цитозоле, а часть связаны с внутренней стороной цитоплазматической мембраны за счет прикрепления геранил-геранильного или фарнезильного остатков к цистеину в С-концевой области в процессе посттрансляционной модификации. Считается, что Rho-белки активны только в случае прикрепления к мембране. Растворенные же молекулы связаны в цитозоле с ингибиторами диссоциации гуаниловых нуклеотидов (GDP dissociation inhibitors – GDI) и поэтому не работают (Moissoglu et al., 2006).
Наиболее хорошо изученной функцией Rho-белков является регуляция динамики актинового цитоскелета. В клетках млекопитающих RhoA, Rac1 и Cdc42 стимулируют образование стресс-фибрилл, ламеллоподий и филоподий, соответственно.
RhoA при активации индуцирует образование стресс-фибрилл и зрелых фокальных контактов, при помощи которых клетки прикрепляются к субстрату. Известными мишенями активированного RhoA является белок mDia1 (Watanabe et al., 1999) и Rho-киназа (Ishizaki et al., 1997). mDia1 с большим сродством связывает белок профилин, являющийся фактором обмена АДФ на АТР в актине, и тем самым вызывает усиленную полимеризацию актина (Wasserman, 1998). Rho-киназа фосфорилирует легкие цепи миозина, что способствует сборке актомиозиновых филаментов (Amano et al., 1996). C другой стороны, Rho-киназа активирует протеинкиназу LIMK. Последняя фосфорилирует и тем самым ингибирует кофилин, что приводит к стабилизации актиновых филаментов (Maekawa et al., 1999).
Cdc42 вызывает образование филоподий в клетках млекопитающих. Он связывает и активирует белок N-WASP. N-WASP, как и WAVE, способен непосредственно связывать G-актин и активировать комплекс Arp2/3. Комплекс Arp2/3 взаимодействует с молекулами актина и функционирует как центр нуклеации нового актинового филамента (Etienne-Manneville et al., 2002). Rho-белки также принимают активное участие в регуляции системы микротрубочек. Активация RhoА стимулирует образование стабильных микротрубочек, направленных к переднему краю клеток, в фибробластах (Cook et al., 1998). Сdc42, помимо участия в образовании актиновых филоподий, стимулирует процесс переориентации центра организации микротрубочек (Palazzo et al., 2001). Таким образом, представители семейства Rho ответственны за разнообразные перестройки цитоскелета. Однако последние данные показывают, что их влияние на клетку намного обширнее, о чем ниже будет рассказано на примере белка Rac1 – наиболее хорошо изученного представителя семейства Rho.
Белок Rac1 (ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) – один из ключевых представителей семейства Rho (Bosco et al., 2009). Rac1 представляет собой небольшой белок (192 аминокислотных остатка). Он содержит высококонсервативный 20 кДа ГТФазный домен, характерный для всех ГТФ-гидролаз. В состав этого домена входят пять -спиралей, шесть -тяжей и пять петель. Наиболее консервативными участками являются именно петли, поскольку они образуют активный центр фермента. Сравнение структуры ГТФазного домена в ГТФ- и ГДФ-связанных состояниях позволило выявить регионы, подвергающиеся наибольшим конформационным изменениям при переходе из одного состояния в другое. Ими оказались участки Switch1 (аминокислотные остатки с 26 по 45) и Switch2 (аминокислотные остатки с 59 по 74). Эти участки являются наиболее важными при взаимодействии Rac1 с его эффекторами (р21-активируемыми киназами (РАКs), арфаптином, NADPH-оксидазой и другими) и регуляторами (GEFs, GAPs, GDIs). Они получили название эффекторных петель. 1.3.1.2. Подходы к изучению функций белка Rac1
Одним из возможных подходов к изучению функций белка Rac1 является внесение точечных мутаций в эффекторные петли или вблизи них. Оказалось, что такие мутации могут существенно изменять работу Rac1 как в отношении гидролиза ГТФ, так и в отношении взаимодействия белка с его эффекторами.
Так, аминокислотный остаток Gln61 играет важную роль в стабилизации -фосфата ГТФ в реакции гидролиза. Мутантный белок с точечной заменой глутамина на лейцин в положении 61 (Rac1Q61L) не способен к спонтанному и GAP-активируемому гидролизу ГТФ (Rittinger et al., 1997). Тем же эффектом обладает замена валина на глицин в положении 12 – остаток валина существенно больше глицина и отталкивает ГТФ от Gln61 в активном центре фермента. Поэтому белки Rac1G12V и Rac1Q61L являются конститутивно-активными формами Rac1. Напротив, ГТФаза с точечной заменой треонина на аспарагин в положении 17 связывает внутриклеточные GEF, однако не способна к обмену гуаниловых нуклеотидов. Комплекс Rac1(T17N)-GEF не активирует нижестоящие белки-мишени (Feig, 1999), то есть обладает свойствами доминантно-негативного мутанта.
В лаборатории L. Van Aelst были получены точечные мутанты белка Rac1 по Switch-регионам, которые способны взаимодействовать с одними эффекторами и не взаимодействовать с другими. Например, мутация Y40H нарушает взаимодействие Rac1 с киназой РАК1, а мутация F37L, напротив, позволяет Rac1 взаимодействовать только с РАК1-киназой, но не с какими-либо другими эффекторами (см. таблицу 1). Эти точечные (в том числе двойные точечные) мутанты Rac1 используются для изучения функций этого белка в различных процессах.
Другим подходом является конструирование химерных белков, в составе которых Rac1 может активироваться в ответ на внешние сигналы. Примером такого подхода служит белок LOV2-Rac1, наряду с собственно Rac1 содержащий домен LOV2 (light, oxygen, voltage) из фототропина овса. Домен LOV2 – это высококонсервативный домен, участвующий в регуляции широкого ряда биологических процессов. В частности, у растений он содержит FMN и является светочувствительным. Он входит в состав белков фототропинов – серин-треониновых протеинкиназ, обеспечивающих фототропизм, открывание устьиц, перемещение хлоропластов и разворачивание листьев (Briggs et al., 2002). Важным свойством LOV2-домена является наличие высокоподвижной части – спирали J. При освещении синим светом (с максимумом длины волны 458 нм) образуется ковалентная связь между консервативным остатком цистеина в LOV2-домене и FMN. Как следствие, происходит разворачивание спирали J. Таким образом, LOV-домен переходит из закрытой конформации в открытую (Harper et al., 2003).
Конструкции, кодирующие различные формы протеинкиназы РАК
Для определения трансмембранного потенциала митохондрий также использовали данные прижизненной флуоресцентной микроскопии. Клетки окрашивали потенциалзависимым красителем TMRE с добавлением верапамила. Полученные изображения анализировали в программе ImageJ.
Чтобы определить яркость отдельных митохондрий, сначала определяли их границы при помощи программы ImageJ. Для определения границ отдельных митохондрий к исходному изображению (рисунок 5 Б) применяли фильтр Gaussian blur с диаметром размытия 7 пикселей (этот показатель соответствует средней ширине митохондрий на получаемых изображениях). В результате получали «размытое» изображение, которое затем вычитали из исходного. Такое преобразование позволяет сделать границы митохондрий более контрастными и уменьшить уровень шума на изображении (рисунок 5 В). Полученное изображение далее конвертировали в бинарное (рисунок 5 Г) при помощи введения порога (thresholding) по алгоритму IsoData. Этот метод разделяет изображение на объекты и фон при помощи введения первоначального порога. Затем рассчитываются средние значения яркости всех пикселей, имеющих значение яркости на границе или выше порога, и всех пикселей, имеющих значение яркости ниже порога. Далее рассчитывается среднее из этих двух значений, значение порога увеличивается, и процесс повторяется до тех пор, пока значение порога не достигнет этого среднего значения. И так далее до тех пор, пока значение порога не будет равняться (среднее значение фона + среднее значение объектов)/2.
На полученном бинарном изображении (рисунок 5 Г) определяли контуры каждой митохондрии (рисунок 5 Д) с помощью анализатора частиц (Particle analyzer) из программы ImageJ. По полученным границам митохондрий определяли их яркость как среднее значение интенсивности флуоресценции по всем пикселям, попавшим в каждый контур. Рассчитанные значения яркости корректировали с учетом уровня фона, который определяли как среднее значение яркости пикселей в области, свободной от клеток. В каждом эксперименте обсчитывали 10-15 участков, содержащих по 15-40 митохондрий. Данные представляли как средние значения интенсивности флуоресценции всех митохондрий с указанием SEM.
Определение трансмембранного потенциала митохондрий в клетках, окрашенных митохондриальным потенциалзависимым красителем TRME, при помощи программы ImageJ. A – исходное изображение. Б – участок исходного изображения А, где митохондрии лежат в один слой и не перекрываются. В – изображение, полученное при вычитании исходного изображения Б, обработанного фильтром Gaussian blur с диаметром 7 пикселей, из исходного изображения Б. Г – бинарное изображение, полученное конвертированием изображения В при помощи введения порога по алгоритму IsoData. Д – контуры каждой митохондрии, полученные с помощью анализатора частиц.
Линии клеток, стабильно экспрессирующие различные формы виментина, получали при помощи ретровирусной трансфекции. Для этого кДНК виментина дикого типа и виментина с точечными заменами S55A, S55E, P56R были клонированы в ретровирусный вектор pBABE-puro (Cell Biolabs, США) согласно инструкции производителя. Вирусные частицы нарабатывали при трансфекции клеток линии HEK293 равными количествами соответствующего конструкта pBABE-puro-Vim и вспомогательной плазмиды pCL-Eco (Imgenex, США). Трансфекцию проводили липосомным агентом TransIT-LT1 (Mirus Bio, США). Через 48 часов после трансфекции снимали супернатант, содержащий вирусные частицы. Им обрабатывали целевые клетки линии MFT-16 в течение 4-8 часов в присутствии 8 мкг/мл полибрена (Sigma, США). Через 48 часов после инфекции клетки подвергали селекции пуромицином в конечной концентрации 2 мкг/мл. Чтобы избежать выброса антибиотика Р-гликопротеином, в среду культивирования добавляли верапамил в конечной концентрации 2,2 мкM. 2.8. Определение устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам
МТТ-тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Клетки, растущие в логарифмической фазе, снимали с подложки версеном-трипсином, тщательно пипетировали и вносили в лунки 96-луночного планшета так, чтобы конечная концентрация клеток составила около 2-20 тыс. клеток в мл. Оставляли планшет в СО2-инкубаторе на 16-24 часа для распластывания. Готовили серийные разведения исследуемого препарата в отдельных эппендорфах как двадцатикратные растворы, вносили в лунки соответствующий объем. Для каждого значения конечной концентрации цитотоксического препарата измерение проводили в трех повторах. Оставляли клетки в СО2-инкубаторе на 72 часа. После вносили в лунки вводный раствор МТТ (до конечной концентрации 50 мкг/мл). Инкубировали 2 часа до развития интенсивной темно-фиолетовой окраски внутри клеток (формазан). Отбирали среду и растворяли формазан в ДМСО, измеряли оптическую плотность при 540 нм. В качестве цитотоксических препаратов использовали два часто применяемых в противоопухолевой терапии лекарства – адрибластин (доксорубицин) и винкристин. Плотность клеток при посадке в 96-луночный планшет составила 2 103 клеток на лунку. Эта величина существенно меньше описанных в литературе, поскольку клетки линии MFT-16 и линий, полученных на ее основе, отличаются высокой скоростью роста. Время инкубации клеток с цитотоксическими препаратами также было увеличено с 48 часов до 72 часов во избежание ложноположительных результатов МТТ-теста.
Для того чтобы сравнивать кривые выживаемости различных клеточных линий и исключить влияние на эксперимент плотности культуры в лунках, проводили нормировку. В каждом 96-луночном планшете значение оптической плотности в каждой лунке с цитотоксическим агентом делили на среднее значение оптической плотности в контрольных лунках (без препарата) и умножали на 100. Полученную величину обозначали как процент выживших клеток.
Построение кривых выживаемости было проведено с помощью пакета drc в программной среде вычислений R (Ritz et al., 2005). Суть метода заключается в аппроксимации данных по токсичности препаратов четырехпараметрической логарифмической функцией вида: где f(x) – процент выживаемости клеток, x –концентрация препарата. Экспериментальные данные по процентам выживаемости клеток и соответствующим им концентрациям препарата обрабатывали пакетом drc в среде R. Исходя из концентрации и экспериментальных значений выживаемости (включая все повторы, совершенных для каждой концентрации), программа методом наименьших квадратов подбирала параметры b, c, d, e для функции, указанной выше. То есть программа подбирала такую функцию, которая наилучшим образом описывает полученную в конкретном опыте экспериментальную зависимость. Параметр «e» в данной модели обозначает IC50 – концентрацию препарата, при которой выживает 50% клеток. Параметр «d» – наибольшее значение процента выживаемости, «c» – наименьшее значение, «b» – наклон касательной к заданной функции в точке IC50.
Влияние Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин
В настоящей работе показано, что регулятором взаимодействия митохондрий с виментиновыми ПФ является малая ГТФаза Rac1. Активация Rac1 под действием внешних факторов приводит к активации протеинкиназы РАК1. РАК1 фосфорилирует виментин по остатку серина-55, который расположен в N-концевой части. Это нарушает взаимодействие митохондрий с виментином, в результате чего возрастает подвижность митохондрий и снижается их трансмембранный потенциал. Практически все функции митохондрий зависят от их потенциала. Поэтому описанная в настоящей работе регуляция связывания митохондрий с виментином малой ГТФазой Rac1 может быть одним из механизмов регуляции их функционального состояния, а следовательно, и метаболизма клетки в целом.
Регуляция выработки АФК малой ГТФазой Rac1 и участие митохондрий в этом процессе были описаны ранее (Werner et al., 2002). Авторами этой работы было показано, что обязательным условием для активации NF-B-сигнального пути с последующей экспрессией коллагеназы-1 при активации Rac1 интегриновыми рецепторами в нейтрофилах является выработка АФК, но не мембранной NADPH-оксидазой. Об этом говорит то, что точечные мутанты Rac1, не связывающиеся с NADPH-оксидазой, тем не менее вызывают увеличение продукции АФК. Препятствует же увеличению продукции АФК в описанной системе добавление антиапоптотического белка Bcl-2. Таким образом, авторы работы (Werner et al., 2002) сделали вывод, что рост АФК в данном процессе обеспечивается неизвестным путем, зависящим от митохондрий. В качестве механизма описанного явления они предложили несколько гипотез, в частности, прямое фосфорилирование антиапоптотического белка Bcl-2 с его последующей инактивацией, однако не рассматривали возможность опосредованного влияния Rac1 на свойства митохондрий, например, через регуляцию их взаимодействия с цитоскелетом. Полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что белок Rac1 действует на митохондрии через регуляцию их связи с цитоскелетными структурами – ПФ. Ранее было показано, что ПФ играют важную роль в регуляции распределения и функционирования различных органелл. Например, виментин участвует в эндосомном/лизосомном транспорте. Было показано прямое взаимодействие виментина с периферийными белками аппарата Гольджи: формимино-трансфераза-циклодезаминазой (Gao et al., 2001) и MICAL (Suzuki et al., 2002). Кроме того, известно, что виментин, периферин и -интернексин связываются с адаптерным белком AP-3 (Styers et al., 2005), который представляет собой гетеротетрамерный комплекс, переносящий везикулы между эндосомным лизосомным компартментами и регулирующий сортинг лизосом, меланосом, синаптических везикул (Robinson, 2004). Также AP-3 играет важную роль в поддержании уровня клеточного Zn2+. В клетках, нокаутных по гену виментина, наблюдается несвязанный транспорт гликолипидов между компартментом эндосом/лизосом и компартментом Гольджи (Styers et al., 2005). Концентрация везикулярного Zn2+ в них в 40 раз меньше, чем в норме (Styers et al., 2004). В этих клетках также наблюдается сниженное образование аутофагосом. Цитоплазматические ПФ участвуют в поддержании формы и расположения ядра. В клетках, нокаутных по гену виментина, отсутствуют ядерные инвагинации (Sarria et al., 1994), а мутации в некоторых кератинах приводят к изменению формы, размера и положения ядра.
Известно также, что виментиновые ПФ регулируют дыхание митохондрий и играют важную роль в поддержании морфологии и организации митохондрий (Tang et al., 2008). Еще в ранних работах при помощи световой и электронной микроскопии были получены данные о колокализации митохондрий и ПФ в клетках (Eckert, 1986). Имеются данные о повышенной энергизованности внутренней мембраны митохондрий, связанных с цитоскелетом на периферии клетки, по сравнению с митохондриями в околоядерной области, не связанными с цитоскелетом (Collins et al., 2002). В нашей лаборатории было показано, что наличие виментина увеличивает трансмембранный потенциал митохондрий (Chernoivanenko et al., 2015). Также было показано, что виментиновые ПФ защищают митохондрии от фрагментации в условиях окислительного стресса (Матвеева и др., 2010), и что в фибробластах, лишенных гена виментина, подвижность митохондрий выше, чем в клетках с виментиновыми ПФ (Некрасова et al., 2007). При восстановлении сети ПФ за счет экспрессии экзогенного виментина в этих клетках подвижность митохондрий снижается до контрольного уровня (Nekrasova et al., 2011). Было показано, что за связывание митохондрий отвечает небольшой участок молекулы виментина – аминокислотные остатки 41 по 94 (Nekrasova et al., 2011). Таким образом, участие виментиновых филаментов в поддержании нормального функционирования и распределения митохондрий не вызывает сомнения. Можно предположить, что связывание с ПФ является способом регуляции работы митохондрий, и, следовательно, находится под строгим регуляторным контролем.
Согласно полученным в настоящей работе данным, центральным звеном этой регуляции является малая ГТФаза Rac1. Конститутивно-активный мутант белка Rac1 увеличивает относительную подвижность митохондрий только в клетках, содержащих виментин, и не влияет на нее в безвиментиновых клетках. В то же время при экспрессии доминантно-негативного мутанта белка Rac1 относительная подвижность митохондрий практически не отличается от контрольного уровня как в случае безвиментиновых, так и в случае виментин-содержащих клеток. Это говорит о том, что Rac1 регулирует относительную подвижность митохондрий только в клетках, содержащих виментин. Исследование с помощью фотоактивируемого белка Rac1 показало, что именно активация Rac1 приводит к увеличению подвижности митохондрий. Более того, после начала активации она возрастает постепенно и выходит на плато через 40 минут после начала освещения. Rac1 оказывает влияние не только на подвижность митохондрий, но и на их функциональное состояние, определяемое трансмембранным потенциалом. Оказалось, что под действием Rac1 уменьшается трансмембранный потенциал митохондрий, причем только в клетках, содержащих виментин.
Известно, что Rac1 имеет множество белков-мишеней. Поиск белка, ответственного за наблюдаемый эффект Rac1 на подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий, проводили с помощью двойных точечных мутантов, содержащих активирующую замену G12V и соответствующую мутацию в эффекторной петле. Точечные замены в эффекторных петлях избирательно нарушают взаимодействие Rac1 c некоторыми эффекторами (Joneson et al., 1996). Анализ двойных точечных мутантов Rac1 показал, что на подвижность митохондрий влияет только белок с заменой F37L, который связывается с РАК1-киназой. При его экспрессии увеличивается подвижность митохондрий по сравнению с контрольными клетками, как и при экспрессии конститутивно-активного белка Rac1G12V. При этом замена Y40H, нарушающая взаимодействие с РАК1-киназой, не позволяет Rac1 увеличивать подвижность митохондрий.
Из этих результатов можно заключить, что в регуляции подвижности митохондрий не участвует ингибирование белка RhoA. Экспрессия двойного точечного мутанта Rac1G12VY40H приводит ингибированию белка RhoA и, как следствие, к практически полной разборке стресс-фибрилл. Но подвижность митохондрий при этом не увеличивается. Rac1G12VF37L, наоборот, не приводит к ингибированию RhoA (стресс-фибриллы сохраняются), но подвижность митохондрий возрастает. Кроме того, эти результаты говорят о том, что наблюдаемый эффект белка Rac1 на подвижность митохондрий не связан с коллапсом сети ПФ к ядру. Действительно, можно было бы предположить, что наблюдаемое при активации многих протеинкиназ, включая РАК1, перемещение ПФ к ядру приводит к уменьшению вязкости цитоплазмы на периферии клетки и, как следствие, к ускорению перемещения находящихся там органелл, в том числе митохондрий. Однако этого не происходит – при экспрессии Rac1G12VY40H наблюдается коллапс ПФ к ядру, но подвижность митохондрий не возрастает по сравнению с контрольным уровнем. В клетках, экспрессирующих Rac1G12VF37L, коллапса ПФ не происходит, сеть ПФ сохраняется интактной, подвижность митохондрий же, наоборот, возрастает.