Влияние экспрессии рекомбинантного гена ксилоглюканазы sp-xeg на рост, ризогенез и свойства древесины трансгенных растений осины populus tremula Видягина Елена Олеговна

Ксилоглюкан по химической структуре представляет собой гетерополимер. Следует отметить структурное сходство между ксилоглюканом и целлюлозой – ксилоглюкан имеет основную цепь, как и у целлюлозы, состоящую из -1,4-связанной D-глюкопиранозы. К каждым трем из четырех остатков глюкозы (Glc)

Для упрощённого представления структуры ксилоглюканов в растениях предложена специальная номенклатурная система (Fry и др., 1993): X – остаток глюкозы содержащий ксилозильный заместитель; F – содержащий в качестве заместителя фукозу; L – содержащий ксилозил-галактозу; G – незамещённый остаток глюкозы. Таким образом, структура гептасахарида ксилоглюкана Pisum sativum L. может быть записана следующим образом: XXFGXXXG. В первичных клеточных стенках ксилоглюкан в своём составе содержит фуказильные заместители, в отличие от ксилоглюканов семян. Эти заместители чаще присоединены к галактозильному

остатку ближайшему к восстанавливающему концу гептасахарида (Koiman, 1957). Также наличие фукозильных остатков в составе ксилоглюканов характерно только для двудольных растений (Hayashi, 1989). Наиболее распространённым является фукогалактоксилоглюкан, структура которого состоит из повторяющихся блоков XXXG и XXFG (Горшкова, 2007). Основным структурным мотивом для растений рода Populus является блок XXXG-типа (Saura-Valls и др., 2008).

Рентгеноструктурный анализ волокон различных растений показал, что в основе ксилоглюкана лежит расширенная двойная спираль как у целлюлозы. Спирали из -(1,4)-поперечно-связанных глюкоз образуют прямую ленточную структуру, с шагом спирали примерно 1,03 нм (Hayashi, 1989). Несмотря на то, что основная цепь глюкана достаточно стабильна, остатки ксилозильные заместители имеют высокую степень подвижности. Фукозильные, ксилозильные и галактозильные остатки не влияют на конформацию основной цепи ксилоглюкана (Tvaroska и др., 1978). Глюкановый остов формирует водородные связи с микрофибриллами целлюлозы, а наличие боковых цепей приводит к его изгибу, исключая возможность слишком тесного контакта ксилоглюкана и микрофибрилл.

Молекула кислоглюкана, формируя водородные связи с микрофибриллами целлюлозы, образует сеть. При растяжении клетки эту сеть необходимо реструктурировать, что обеспечивают специальные ферменты – кислоглюканазы. Основную цепь ксилоглюкана могут расщеплять по эндодеполимеразному механизму многие эндо--1,4-глюканазы. Кроме эндоглюканаз, основными субстратами которых являются прежде всего целлюлоза и различные -глюканы, существуют ферменты, высокоспецифичные именно по отношению к ксилоглюкану и практически инертные по отношению к незамещенным -глюканам и карбоксиметилцеллюлозе (Синицына, 2010). Наиболее часто встречаемым ферментом у различных видов растений является ксилоглюкан-эндотрансгликозилаза (XET). Этот фермент отщепляет части одно цепи ксилоглюкана и переносит их на другие более низкомолекулярные цепи (Агеева и др., 2009).

Растущий интерес ученых к грибным ксилоглюканазам обусловлен, возможностью их практического применения в таких важных биотехнологических процессах, как конверсия растительных отходов, модификация ксилоглюканов для придания им требуемых свойств в пищевом, кормовом производстве и целлюлозно-бумажной отрасли. Важно отметить, возможность использования грибных ксилоглюканаз, как рекомбинантных ферментов в различных растениях. Данные ксилоглюканазы катализирующие деполимеризацию гемицеллюлозных и целлюлозных компонентов клеточных стенок, дают возможность изучить физиологические эффекты модификации метаболизма этих полисахаридов. Однако, при использовании генов растительного происхождения возможны эффекты косупрессии из-за высокой гомологии, при использовании генов грибного происхождения подобных реакций не наблюдались.

Ксиланы представляют собой разнородную группу полисахаридов основная цепь которых состоит из -(1,4)-связаных остатков ксилозы, боковые цепей образованы -(1,2)-связанной глюкуроновой кислоты и 4-O-метил остатков глюкуроновой кислоты. Состав и распределение боковых цепей в ксилане зависит от вида растения. Ксиланы обычно содержат большое количество остатков арабинозы, присоединенных к основной цепи. Особенно высокие количества арабиноксиланов присутствуют в эндосперме зерновых. В травянистых растениях ксиланы могут быть связаны с микрофибриллами целлюлозы как и ксилоглюканы, однако боковые цепи не присоединены к микрофибриллам. кроме того, содержание боковых заместителей постепенно уменьшаться во время роста растительных клеток (Bochicchio, Reicher, 2003).

Адаптация растений к условиям ex vitro

Транскрипцию химерного гена sp-Xeg анализировали методом ОТ-ПЦР. Тотальную растительную РНК экстрагировали с помощью TRIzol реагента (Invitrogen, США) по прилагаемой коммерческой методике (http://www.invitrogen.com) из растительного материала in vitro. Удаление геномной ДНК из проб проводили с помощью ДНказыI (Fermentas, США) по рекомендуемому производителем протоколу. Синтез кДНК проводился с помощью M-MuLV обратной транскриптазы (СибЭнзим, Россия) с использованием олиго-d(Т)15 праймера (Синтол, Россия) при температуре 37С в течение 75 минут. Для инактивации ревертазы смесь нагревали до 70C. Реакционную смесь разводили в пять раз Milli-Q водой, а затем брали по 2 мкл в качестве матрицы для постановки ПЦР с использованием праймеров NptII-1, NptII-2, Xeg-up и Xeg-low (таблица 2.). Амплификацию проводили в следующих условиях: реакционная смесь содержала 16 мМ (NH4)2SO4, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 200mМ каждого дНТФ, 0,8 mМ каждого олигонуклеотида, 0,15 U/мкл Taq полимеразы, 1-5 нг/мкл геномной ДНК. Режим амплификации для гена npt: денатурация при 96С (горячий старт) – 3 мин; денатурация при 95С – 45 сек; отжиг при 60С – 45 сек; элонгация 1 мин при 72С, достройка в течении 5 мин. при 72С; 30 циклов. Режим амплификации для гена Xeg: денатурация при 96С (горячий старт) – 3 мин; денатурация при 95С – 45 сек; отжиг при 62С – 45 сек; элонгация 1 мин при 72С, достройка в течении 5 мин. при 72С; 30 циклов. Реакции проводили в тонкостенных пробирках, объемом 200 мкл (QSP) на амплификаторе MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (BIO-RAD). Для контроля контаминации РНК остатками геномной ДНК проводился ПЦР с препаратами РНК каждого из клонов без обработки ревертазой.

Электрофорез ДНК, РНК и кДНК проводили в агарозных гелях концентрацией 1% в электрофорезной камере фирмы "Bio-Rad" (США) в 0,5 ТВЕ буфере (20 х TBE буфер: 0,89 М Трис-ОН, 0,89 М борная кислота, 50 мМ ЭДТА) с добавлением бромистого этидия в течение 40 - 60 мин при напряжённости электрического поля 10-20 В/см. В лунки вносили 5 мкл пробы, предварительно смешивая их с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина). Визуализацию ДНК проводили с помощью трансиллюминатора и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете.

Для определения количества копий рекомбинантного гена sp-Xeg использовался TaqMan анализ, представляющий собой проведение ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), при котором накопление продукта ПЦР контролируется непосредственно во время хода реакции. Указанный подход используется для определения количества копий рекомбинантного гена в трансгенных растениях (Ingham и др., 2001). Для постановки ПЦР-РВ использовали амплификатор Realime DNA Detection System Rotor gene 3000 (Corbett Research, Австралия) и праймеры (Евроген, Россия) на ген sp-Xeg и локусы PTR5, PTR8, PTR12 (таблица 2.). Для гена sp-Xeg размер ожидаемого фрагмента 170 п.о., для локусов PTR5 – 250 п.о., PTR8 – 132 п.о., PTR12 – 248 п.о. Предварительно определяли значение показателя эффективности протекания ПЦР на экспоненциальной фазе для рекомбинантного гена sp-Xeg и нативных монокопийных локусов осины (PTR5, PTR8 и PTR12). Для этого после первичного анализа выбирали несколько образцов ДНК со значением Сt, равным 20–22 циклам и приготавливали следующие варианты разведения: 1:0, 1:5, 1:25, 1:125, 1:625. Эффективность протекания реакции рассчитывалась по формуле: E=(R2/R1)1/(Ct2–Ct1) где R — степень разведения образца (оценивается попарно для каждого разведения); Сt (Сt1 и Сt2 – циклы при разных разведениях)— цикл уровня пороговой флюоресценции (наиболее часто значение уровня пороговой флюоресценции находились в пределах 0,05–0,1 единиц флюоресценции).

Для сопоставления получаемых данных количественной оценки уровня копийности рекомбинантного гена в различных образцах проводили нормализацию (уравнивание) результатов по содержанию монокопийных нативных локусов осины (PTR5, PTR8 и PTR12) (Rahman и др., 2000). Обработку данных выполняли с помощью специального программного обеспечения MxPro. Среди анализируемых образцов выбирался контроль, концентрация ДНК определенного локуса которого условно была принята за 1. Наиболее оптимальным вариантом в качестве контроля являлся образец, характеризующийся наиболее низким средним значением Сt монокопийных нативных локусов осины (PTR5, PTR8 и PTR12). Для всех образцов рассчитывалось среднее арифметическое значение Сt — Ct(h) монокопийных нативных локусов осины (PTR5, PTR8 и PTR12). Для i-образца оно обозначалось как Сt(h)i, контрольного образца — Сt(h)n.

Показатель отношения концентрации нативных локусов осины i-образца к контрольному образцу рассчитывалсяся по формуле: N=Eh(Ct(h)i –Сt(h)n) где Eh — среднее арифметическое значение показателя эффективности амплификации. Если N 1, это означало, что изначальная концентрация ДНК (нативных локусов осины (PTR5, PTR8 и PTR12)) в i-образце в N-1 раз меньше, чем в контрольном образце, и наоборот, если N 1, то изначальная концентрация кДНК в i-образце в N раз больше, чем в контроле. Показатель содержания рекомбинантного гена sp-Xeg i-образца относительно контрольного образца рассчитывался по формуле: S=(Eс(Ct(с)n –Сt(с)i))N где Ес — показатель эффективности амплификации рекомбинантного гена sp-Xeg; Сt(c)i — значение цикла уровня пороговой флюоресценции i-образца для рекомбинантного гена sp-Xeg; Сt(c)n — показатель цикла уровня пороговой флюоресценции контрольного образца для рекомбинантного гена sp-Xeg; N — отношение концентрации ДНК (нативных локусов осины (PTR5, PTR8 и PTR12) i-образца к контролю.

Если S 1, это говорило о том, что уровень концентрация изучаемого локуса рекомбинантного гена в i-образце в S раз больше по отношению к образцу-нормализатору, и наоборот, если S 1, то уровень концентрации локуса рекомбинантной ДНК i-образца в S-1 раз меньше, чем в образце-нормализаторе.

Для получения растительных экстрактов из тепличных растений использовали по 4 листочка с 4 независимых растений осины каждого генотипа, растущих в течение 1 месяца в условиях защищенного грунта. Листья каждого генотипа весом от 1 до 1,5 г растирали в фарфоровых ступках в присутствии кварцевого песка в трис-HCl буфере (7,2 pH) при +4оС до образования гомогенной суспензии. Полученные экстракты центрифугировали. Супернатант использовали для определения концентрации белка по методу Бредфорда (Bradford, 1976) и ксилогюканазной активности. Для определения активности эндо-1,4--глюканазы растительных экстрактов трансформированной осины применили спектрофотометрический метод с использованием растворимого субстрата ксилоглюкана тамариска окрашенного Remazolbrilliant Blue (Megazyme, Австралия). Процедуру анализа активности фермента осуществляли согласно рекомендациям производителя субстрата (http://secure.megazyme.com). Показания снимали при длине волны 590 нм. В контрольный образец вместо растительного экстракта вносили 0,25 мл экстракционного буфера. Активность фермента рассчитывалась в относительных единицах. За одну относительную единицу активности принято значение ОД590 1 мл растительного экстракта нетрансформированного растения (Pt) в пересчете на 1 мг белка.

Молекулярно-биологический анализ трансгенных растений, несущих рекомбинантный ген sp-Xeg

Оценивалось количество копий рекомбинантного гена во всех полученых линиях трансгенных растений осины. Количество копий рекомбинантного гена у большинства трансгенных линий варьировало от 2 до 4 (приложение А. таблица А1). Согласно литературным данным, известно, при агробактериальной трансформации количество копий рекомбинантного гена варьирует от 1 до 10, чаще число копий трансгена 3-4 (Gelvin, 2006). Считается, что одной копии гетерологичного гена может быть недостаточно для продуктивного синтеза чужеродного белка. При этом получение множественных копий гетерологичного гена может привести к замолканию трансгена в результате явления сайлесинга, вероятность которого существенно возрастает при увеличении количества копий. Поэтому число копий от 2 до 4 считается наиболее оптимальным (Омельянчук и др, 2005; Катохин и др, 2006).

После подтверждения трансгенного статуса линий проводили анализ экспрессии гетерологичного гена. Экспрессия исследовалась на уровне транскрипции мРНК. Наличие мРНК определяли методом ПЦР с обратной транскрипцией. После окончания ПЦР проводили электрофорез в агарозном геле. Положительный или отрицательный результат представляет, соответственно, присутствие или отсутствие транскрипта РНК в пробе. Это, в свою очередь, показывает наличие или отсутствие экспрессии анализируемого гена в трансгенных растениях.

Все линии, имеющие в составе ДНК рекомбинантные гены, показывают наличие экспрессии маркерного гена npt II. Размер фрагмента, как и ожидалось, составил 450 нуклеотидных оснований (рисунок 13).

ОТ-ПЦР анализ трансгенных линий осины для оценки экспрессии селективного гена nptII. Размер ампликона npt II 450 bp. М – маркер длин ДНК 1 kb (Евроген), Н2О – отрицательный контроль реакции, pBI-Xeg – плазмидная ДНК (положительный контроль), Pt – нетрансгенная линия.

Линии растений, в составе ДНК которых содержатся целевые ген sp-Xeg, показывают наличие экспрессии рекомбинантного гена. Ожидаемый размер ампликона составляет 750 нуклеотидных оснований (рисунок 14).

ОТ-ПЦР анализ линий осины для оценки экспрессии целевого рекомбинантного гена sp-Xeg. Размер ампликона xeg 750 bp. М – маркер длин ДНК 1 kb (Евроген), Н2О – отрицательный контроль реакции, pBI-Xeg – плазмидная ДНК (положительный контроль), PtIGus5a – трансгенный отрицательный контроль, Pt– нетрансгенная линия. Для установления функциональности интродуцированной экспрессирующей кассеты рекомбинантного гена ксилоглюканазы из гриба P. canescens вегетативные ткани трансгенных линий растений осины анализировались методом Western-блоттинга. Иммунодетекция в вегетативных тканях показала, что экспрессирующая кассета функционирует и белок синтезируется во всех полученных трансгенных линиях. В нетрансгенной линии положительной реакции не зафиксировано. На иммуноблотте видно, что рекоминатный белок экспрессируется, молекулярная масса ожидаемого рекомбинантного белка примерно 25кDa (рисунок15).

Вестерн-блотт анализ белковых экстрактов трансгенных растений осины, несущих рекомбинантный ген sp-Xeg. М - стандартный белковый молекулярный маркер: 26 кДа, Xeg – грибной экстракт, Pt– нетрансгенный контроль, PtIGus5a – трансгенный отрицательный контроль, PtXIVXeg1a, PtXIVXeg1b, PtXIVXeg1c, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b, PtXVXeg1c, PtXVXeg3a, PtXVXeg3b, PtXVXeg5a, PtXVIXeg8a – трансгенные линии растений.

Для подтверждения функциональной активности фермента была определена ксилоглюканазная активность. Для анализа ксилоглюканазной активности были получены растительные экстракты из 25 трансформированных и 2 контрольных линий, выращенных в условиях защищенного грунта. На рисунке 16 представлены результаты анализа ксилоглюканазной активности экстрактов растений 11 клонов, выращенных в условиях защищенного грунта. У четырех генотипов мы наблюдали увеличение ксилоглюканазной активности по отношению к контролю Pt: PtXVXeg1c на 92 %, PtXVXeg4c на 51 %, PtXIVXeg1a на 35%, PtXIVXeg1b – на 21%. Активность фермента у других исследуемых генотипов была приближена к контрольным значениям.

Влияние экспрессии рекомбинантного гена sp-Xeg на фенотипические показатели трансгенных растений осины Суперэкспрессия карбогидраз в древесных растениях в ряде работ рассматривается как один из перспективных способов создания высокопродуктивных быстрорастущих растений. В ранее опубликованных работах сообщалось о модификации P. tremula геном эндоглюканазы cel1 из A. thaliana (Park и др., 2004), а также P. alba геном ксилоглюканазы AaXeg2 из A. aculeatus (Shani и др., 2004). В обоих случаях докладывалось об увеличении скорости роста растений, длины междоузлий и диаметра ствола. Поэтому первоначально для анализа влияния рекомбинантной ксилоглюканазы sp-Xeg на фенотип трансгенных растений была проведена оценка биометрических показателей.

Изменение ризогенеза трансгенных растений осины с рекомбинантным геном sp-Xeg

В связи с тем, что экспрессия гена sp-Xeg находится под контролем промотора 35S, можно предположить, что действие рекомбинантного гена будет заметно уже в условиях in vitro. Изменение скорости роста, морфологии микропобегов не обнаружено, однако отмечено изменение ризогенеза. Нами был проведен анализ эффективности укоренения и подсчитан процент укоренённых растений. Оценку корней растений каждой линии проводили каждые три дня с момента переноса на среду для укоренения и оценивали корнеобразование каждые три дня. В результате было выяснено, что образование корней начиналось примерно с 6-ого дня (рисунок 15; приложение А, таблица А2). Максимальные отличия между контрольными и трансгенными линиями были отмечены на 9-ый день. На 11 день растения переносились в условия защищённого грунта.

Анализ ризогенеза in vitro показал, что эффективность укоренения практически у всех трансгенных линий была выше, чем у контрольных (рисунок 17; приложение А, таблица А3). Статистически значимое увеличение (по t-критерию Стьюдента) было у 52% из всех трансгенных линий. Максимальное отличие было отмечено у клонов линии PtXVXeg3с, оно превышало контрольное значение в 2,6 раза (рисунок 18,19). Только у одной линии эффективность укоренения была ниже, чем у контрольных линий – PtXVI Xeg1b.

Растения в тепличных условиях

Кислоглюканаза способствует расщеплению ксилоглюкана, тем самым влияя на изменение углеводного состава. Нами было оценено изменение углеводного состава в двух контролях Pt, PtIGus5a; быстрорастущих клонах: PtXIVXeg1a, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b и PtXVIXeg8a; клона с большим содержанием целлюлозы: PtXIVXeg1c; клоны приближённые контрольным растениям: PtXIVXeg1b, PtXVXeg3a, PtXVXeg3b,PtXVXeg5a; клон карлик: PtXVXeg1c.

Анализ показал изменение углеводного состава (приложение А, таблица А9). В целом отмечено увеличение содержания глюкозы, маннозы и арабинозы, уменьшение ксилозы, и отсутствие различий в содержании галактозы, рамнозы и фукозы. Основным структурным мотивом для растений рода Populus является повторяющийся блок XXXG-типа, то есть структурный мотив, состоящий из трёх остатков глюкозы содержащий ксилозильный заместитель (Х) и один незамещённый остаток глюкозы (G) (Saura-Valls и др., 2008). Поэтому, как и предполагалось, наибольшие отличия практически для всех исследуемых растений обнаружены в содержании ксилозы и глюкозы.

Содержание ксилозы в трансгенных клонах было ниже, чем у контрольных во всех частях растений. Наиболее низкие показатели содержания ксилозы был обнаружены для клона PtXVXeg1a (снижение на 68,6%, 57% и 18,7% для верхушки, середины и нижней частей соответственно) и для клона PtXVXeg5a (снижение на 76,4%, 39,38% и 26,9% для верхушки, середины и нижней частей соответственно). В среднем для всех клонов зафиксировано снижение на 20,8% по сравнению с контролями. Это согласуется с данными по измерению содержания пентозанов в трансгенных клонах. Где в среднем снижение содержания пентозанов для всех трансгеных клонов по сравнению с контролями было на 7,93%. Наибольшее снижение содержания ксилозы, как и пентозанов отмечено в верхней части растения. Степень корреляции Пирсона между содержанием пентозанов в разных частях соответствующих трансгенных клонов и содержанием ксилозы высокая 0,71. Полученные данные доказывают действие рекомбинантной ксилоглюканазы sp-Xeg в трансгенных растениях и подтверждают данные о снижении содержания связующих гликанов.

Содержание глюкозы в трансгенных клонах превышает контрольные значения во всех частях растения. Для клонов наибольшие отличия отмечены для PtXVXeg1a, PtXVXeg1b. В верхней части, превышение у этих клонов на 28,9% средние контрольные значения. Для средней части растения наибольшие различия были для клонов PtXIVXeg1a и PtXIVXeg1b – увеличение по сравнению с контролем на 53%, для нижней части в среднем на 28% было превышение в клонах PtXIVXeg1b, PtXVXeg1a и PtXVXeg1b. В среднем данные по содержанию глюкозы коррелируют с данными содержания целлюлозы, коэффициент корреляции Пирсона был средним и составил 0,63. Это говорит о том, что повышение содержания целлюлозы и глюкозы взаимосвязаны между собой. Такая связь не случайна, свободная глюкоза непосредственно участвует в формировании микрофибрилл целлюлозы (Gunning, Steer, 1996). Поэтому для всех клонов, которые когда-либо показывали увеличение содержания целлюлозы и повышение скорости роста, особенно заметны изменения углеводного состава.

Анализ метаболома

Метаболиты являются конечными продуктами экспрессии генов, поэтому любые изменения на генетическом уровне, несомненно, влияют на состав метаболома. В этой связи существует необходимость тщательного анализа метаболитов генномодифицированных организмов. Поскольку рекомбинантный ген может оказывать плейотропный эффект, изучение метаболома полученных нами трансгенных растений поможет объяснить причину отмеченных биохимических и фенотипических изменений. Стоит отметить, что данный аспект для растений осины с рекомбинантными генами, влияющими на кислоглюкан, ранее не рассматривался (Abreu и др, 2011; Kontunen-Soppela и др, 2007; Ossipov и др., 2008).

Для анализа использовались неодревесневшие и одревесневшие растения. Неодревесневшие растения, взятие из тепличных условий возрастом 6 месяцев: Pt, PtXVXeg1a и PtXVXeg1c. Одревесневшие растения Pt, PtXIVXeg1a, PtXVXeg1c и PtXVXeg5a взятые из полунатуральных условий возрастом 1,5 года. Клоны PtXIVXeg1a и PtXVXeg1a выбраны были как наиболее быстрорастущие в соответствии с возрастом, PtXVXeg1c выбран как клон карлик, клон PtXVXeg5a выбран как наиболее близкий к контролю Pt по биометрическим и биохимическим показателям.

Для неодревесневших генотипов Pt, PtXVXeg1a и PtXVXeg1c взятых из теплицы с помощью газовой хроматографии было отмечено различие более чем в 2 раза примерно для 30 соединений в листьях генномодифицированных растений (рисунок 33).

ГХ-МС профиль хроматограммы метаболитов из экстрактов листьев растений осины. Содержание ксилозы в листьях трансгенных растений значительно превышало значения в контрольной группе. Для растений клона PtXVXeg1c оно превышало контрольные значения в 5,88 раз, для растений клона PtXVXeg1a в 3,06 раза. Вероятно, это связано с активностью ксилоглюканазы, которая расщепляет полисахариды до более простых сахаров. Для стеблей трансгенных растений было отмечено изменение содержания более чем в 2 раза для 12 соединений (рисунок 34).

Содержание цис-линолевой кислоты (9,12-octadecadienoic acid) и линоленовой кислоты (9,12,15-octadecatrienoic acid) было ниже в генномодифицированных растениях по сравнению с контрольными. Для растений клона PtXVXeg1c содержание цис-линолевой ниже в 3,82, линоленовой кислоты в 4,55; для растений клона PtXVXeg1a содержание цис-линолевой ниже в 3,02, линоленовой кислоты в 3,23. С помощью ульта-эффективной жидкостной хроматографии выяснено, что в стеблях трансгенных растений повышено содержание тремулацина (tremulacin): у растений клона PtXVXeg1a в 1,03 раза (на 2,8%) и у растений клона PtXVXeg1c 1,1 раза (на 10%). Тримулацин рассматривается как фенольное соединение, защищающее от насекомых (Donaldson и др.,2006; Young и др.,2010; Lindroth и др., 2013). Для одревесневших растений Pt, PtXVXeg1a, PtXVXeg1c, PtXVXeg5a взятых с открытой площадки с помощью газовой хроматографии был проведён анализ содержания 340 веществ в стеблях растений осины. 33 метаболита выбраны как наиболее сильно влияющие на разделение групп контрольных и генномодифицированных растений (таблица 6).