Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1 Разработка плазмидных векторов 13
1.1.1 Плазмидные векторы in vitro 13
1.1.2 Плазмидные векторы in vivo 16
1.2. Элементы, влияющие на эффективность плазмидных векторов 20
1.2.1 CG-островки и CpG-динуклеотиды 20
1.2.1.1 Основные механизмы метилирования CpG 20
1.2.1.2 Основные механизмы деметилирования CpG 22
1.2.1.3 Общие сведения о CG-островках 23
1.2.1.4 Механизмы гипометилирования CG-островков 25
1.2.1.5 Дифференциальное метилирование CG островков 26
1.2.1.6 Метилирование CG-островков и транскрипция 30
1.2.2 S/MAR элементы 33
1.3. Заключение 36
2. Материалы и методы 37
2.1. Получение, наработка и выделение плазмид 37
2.2. Культивирование клеток 37
2.3. Электропорация мезенхимальных стволовых клеток 38
2.4. Определение концентрации плазмиды в клетках после электропорации с помощью ПЦР в реальном времени 39
2.5. Измерение люциферазной активности светлячковой (Firefly) люциферазы и секретируемой (Lucia) люциферазы 40
2.6. Анализ экспрессии -галактозидазы и eGFP 41
2.7. Лабораторные животные 41
2.8. Введение плазмид в задние конечности и в печень мышей 42
2.9. Забор крови и измерение mSEAP 42
2.10. Статистический анализ 42
3. Результаты 43
3.1. Создание генетических конструкций 43
3.2 Тестирование конструкций in vitro 50
3.2.1 Выбор между вектором pMBR1 и pMBR2 50
3.2.2 Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе и трансгене на начальный уровень экспрессии трансгена 51
3.2.3 Измерение количества плазмиды в клетках после электропорации 52
3.2.4 Кинетика экспресии конструкций, кодирующих люциферазу, в МСК 54
3.2.5 Влияние единичных CpG-динуклеотидов на кинетику экспрессии 59
3.2.6 Влияние RG108 на кинетику экспрессии трансгенов 60
3.2.7 Влияние ДМСО на кинетику экспрессии трансгенов 62
3.2.8 Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе на экспрессию -галактозидазы и EGFP 63
3.3. Тестирование конструкций in vivo 72
3.3.1 Введение конструкций в скелетные мышцы 72
3.3.2 Введение конструкций в печень 75
4. Обсуждение результатов 77
4.1 Обсуждение результатов, полученных в системе in vitro 77
4.2 Обсуждение результатов, полученных в системе in vivo 82
5. Заключение 86
6. Выводы 90
Библиография 92
- Плазмидные векторы in vivo
- Создание генетических конструкций
- Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе на экспрессию -галактозидазы и EGFP
- Обсуждение результатов, полученных в системе in vivo
Плазмидные векторы in vivo
Разработка плазмидного вектора, поддерживающего эффективную долговременную экспрессию терапевтических генов в печени и скелетных мышцах важна для дальнейшего развития генной терапии. В печени синтезируются многие белки, мутации в генах которых ассоциированы с тяжелыми наследственными заболеваниями: фенилаланингидроксилаза, альфа-1-антитрипсин, факторы свертываемости крови и т.д. Кроме того, поскольку клетки поджелудочной железы плохо поддаются генетической модификации, представляется перспективным использование гепатоцитов для получения секретирующих инсулин клеток при терапии сахарного диабета [43]. Введение генотерапевтических конструкций непосредственно в печень уже позволило достичь определенных успехов в лечении фенилкетонурии на мышиных моделях [44], гемофилии [45] и дефицита альфа-1-антитрипсина у людей [46]. Генетическая модификация миоцитов может применяться для лечения миопатий у детей и новорожденных [47]. У пациентов старшего возраста такая генная терапия может использоваться для восстановления кровоснабжения нижних конечностей, нарушенного из-за сахарного диабета [48]. Кроме того, мышцы легко доступны для инъекций, а в случае с плазмидными векторами - для электропорации [49] и гидродинамического введения [50, 51]. Электропорация и гидродинамическое введение - методы, которые могут значительно увеличивать уровень трансфекции клеток и экспрессии трансгена, что делает мышечную ткань удобной для экспрессии в ней белков, терапевтический эффект которых должен быть системным, например, экспрессии эритропоэтина при анемии, вызванной хронической почечной недостаточностью [52].
Дополнительное преимущество мышц и печени как мишеней для генной терапии с использованием плазмидных векторов заключается в том, что гепатоциты и миоциты долго живут, редко делятся и медленно обновляются [44,53]. В быстро обновляющихся клетках экспрессия трансгена, не интегрированного в геном, быстро падала бы из-за эффекта разведения.
В разных тканях и органах кинетика экспрессии трансгена одним и тем же плазмидным вектором может различаться. Например, задача обеспечения долговременной экспрессии трансгенов в мышцах представляется частично решенной. Даже используя обычные плазмиды, ряду авторов удалось добиться долговременной экспрессии трансгена и коррекции фенотипа в экспериментах, продолжавшихся от четырех месяцев до года [52, 54, 55]. Гораздо сложнее оказалось добиться долговременной экспрессии трансгена в печени. Обычные плазмиды были не в состоянии справиться с этой задачей [54, 56-58]. Даже при использовании специально адаптированных конструкций (линейных кассет, миниколец, плазмид со сниженным содержанием CpG-динуклеотидов, плазмид с инсуляторами) уровень экспрессии трансгена падал на порядок или больше в первые же недели после введения [16, 44, 59-64]. Причины сайленсинга экспрессии трансгена при экспрессии плазмидными конструкциями до сих пор остаются предметом дискуссии. Выдвигалось предположение, что причиной сайленсинга может быть иммунный ответ против плазмидной ДНК из-за ее сходства с бактериальной ДНК. У млекопитающих ДНК, содержащая неметилированные CpG-динуклеотиды (характерные для бактериальной ДНК), вызывает иммунный ответ, опосредованный TLR9 рецептором, присутствующим на поверхности дендритных клеток, макрофагов, естественных киллеров и т.д. [17, 65]. Хайду и др. удалось показать, что даже один CpG-динуклеотид, содержащийся в векторной последовательности, может вызывать воспаление при введении в легкие in vivo [17]. Было показано, что сильный иммунный ответ в некоторых случаях коррелирует с быстрым падением уровня экспрессии трансгенов [66]. И, хотя у нокаутных мышей TLR9V- после введения содержащей неметилировнанные CpG-динуклеотиды ДНК действительно не наблюдается признаков иммунного ответа [65], в качестве основной причины падения уровня экспрессии трансгена он выступать не может. Отсутствие TLR9 рецепторов не оказывает заметного влияния на кинетику экспрессии трансгена [67]. Кроме того, было показано, что элиминации плазмиды или селективной элиминации клеток, содержащих плазмиду, со временем не происходит [62, 68]. Из этого следует, что должны быть и другие механизмы, ответственные за падение уровня экспрессии трансгена.
Один из таких возможных механизмов снижения уровня экспрессии -транскрипционный сайленсинг: de novo метилирование CpG-динуклеотидов с образованием неактивного хроматина. Например, Ю и коллеги показали, что лишенная CpG-динуклеотидов плазмида может поддерживать длительную экспрессию трансгена в легких на постоянном уровне. Та же плазмида в печени показала более скромные результаты: за первый месяц уровень экспрессии трансгена упал на порядок, зато потом оставался на прежнем уровне. [64, 67]. Данные о причинно-следственной связи между de novo метилированием и падением уровня экспрессии трансгена остаются противоречивыми. Хотя в некоторых работах корреляция между ними была обнаружена [63, 68], есть и работа, в которой такая корреляция обнаружена не была [16].
Кей и др. выдвинули предположение, что к сайленсингу экспрессии трансгена приводят не CpG-динуклеотиды в составе вектора или ОРС, а любые бактериальные последовательности, ковалентно связанные с ОРС. В своих первых работах они использовали вырезаемые из плазмид линейные экспрессионные кассеты и миникольца, получаемые из плазмид с помощью рекомбиназ [63, 69, 70]. Развивая свою гипотезу, они пришли к выводу, что даже обычная плазмида может успешно экспрессировать трансген долгое время, если отделить в нем экспрессионную кассету от бактериальных последовательностей с обеих сторон инсуляторами. На основании этих наблюдений была выдвинута гипотеза, что при попадании бактериальных последовательностей в эукариотические клетки вокруг них формируется супрессивный гетерохроматин, который распространяется вдоль молекулы ДНК. Инсуляторы препятствуют распространению супрессивного хроматина, и сайленсинг экспрессии трансгена не происходит. Однако уровень экспрессии трансгена в печени даже самыми лучшими векторами в этих работах падал в 5-10 раз в первые же дни после введения [71].
В своей работе [72] Аргирос и коллеги сообщают, что им удалось добиться успеха в этом направлении, скомбинировав подход вектора pEPI и миниколец и получив миникольца, содержащие S/MAR элемент. Эти результаты, однако, вызвают сомнения, поскольку в работе в качестве репортерного гена использована светлячковая люцифераза, которая должна вызывать имунный ответ у животных.
Создание генетических конструкций
Все последовательности ДНК, необходимые для создания вектора, были синтезированы компанией GenScript (США). На первом этапе были объединены вместе три фрагмента. Первый – бактериальный остов с рестриктными сайтами Nhe I и Nco I на концах, состоящий из бактериальной области начала репликации R6K, содержащей 5 CpG-динуклеотидов, бактериальный Е7 промотор с 2 CpG-динуклеотидами, управляющий экспрессией гена, обеспечивающего устойчивость к антибиотику, ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотику зеоцину с 4 CpG-динуклеотидами, а также SV40 сайт полиаденилирования. Второй – димер мутированного S/MAR элемента из человеческого гена IFN длиной 155 пар нуклеотидов, в котором были заменены 8 G/C нуклеотидов на A/T. Замены были произведены для снижения энергии, необходимой для расплетания цепей ДНК в этом месте и одновременной элиминации CpG-динуклеотидов, с рестриктными сайтами Nhe I и Xba I на концах. И, наконец, третий фрагмент – последовательность, кодирующая ген hTRAIL, с сайтами Nhe I и Nco I на концах. Встраивание S/MAR элемента было необходимо уже на первом этапе клонирования, т.к. без него плазмида реплицировалась крайне медленно, и дальнейшие манипуляции были невозможны. На втором этапе клонирования последовательность, кодирующая hTRAIL, была заменена на последовательность, не содержащую CpG-динуклеотидов, кодирующую репортерный ген люциферазу, идентичную последовательности, кодирующей люциферазу в плазмиде pMOD-LucSh (Invivogen).
Следующие этапы представляли собой последовательную вставку еще двух S/MAR димеров в Nhe I сайт конструкции до образования гексамера, а также вставку EF-1 промотора человека и CMV-энхансера мыши, содержащего 2 CpG-динуклеотида. В результате полученная плазмида содержала 13 CpG-динуклеотидов в векторе и ни одного CpG-динуклеотида во вставке, кодирующей люциферазу. Конструкция получила название pMBR1-Luc0, а соответствующий вектор – pMBR1 (рис. 1А и рис. 2А). Отличительная черта данной конструкции – локализация гексамера S/MAR элемента внутри транскрипционной единицы, между сайтом полиаденилирования и стоп-кодоном. Согласно некоторым работам, такая организация плазмиды должна способствовать ее эписомальному поддержанию в делящихся клетках [37, 42].
Наряду с данной конструкцией была создана другая, в которой S/MAR элемент находился вне транскрипционной единицы, сразу после нее. Для получения такой конструкции SV40poly(A) последовательность была вырезана из pMBR1 вектора путем разрезания по сайтам BspT I(Afl II) и Pme I и заменена двухцепочечным адаптером. Адаптер был получен путем аннилинга смыслового (TTAAGTAGATGATCATGTTT) и антисмыслового (AAACATGATCATCTAC) олигонуклеотидов. SV40poly(A) последовательность была амплифицирована с использованием прямого (TCTATGCTAGCGACATGATAAGATACATTG) и обратного (TCTATTCTAGAGGTACCTGGCCAGATCTGAATTCCATACCACATTTGTAGAG) праймеров, подобранных так, чтобы на ее концах появились рестриктные сайты Xba I и Nhe I, и вставлена в разрезанный по Nhe I вектор, приготовленный из конструкции с адаптером. Данная конструкция получила название pMBR2-Luc0, а соответствующий вектор – pMBR2 (рис. 1Б и рис. 2Б).
Кроме плазмид pMBR1-Luc0 и pMBR2-Luc0, кодирующих светлячковую люциферазу лишенную CpG-динуклеотидов, были созданы аналогичные плазмиды, кодирующие секретируемую люциферазу Lucia (Invivogen).
Как уже говорилось, оба вектора pMBR1 и pMBR2 содержат по 13 CpG-динуклеотидов. В дальнейшем в конструкции pMBR2 была заменена последовательность, кодирующая люциферазу: вместо последовательности, не содержащей CpG, была вставлена последовательность дикого типа, содержащая 97 CpG. Таким образом, итоговая конструкция pMBR2-wtLuc содержала 110 CpG динуклеотидов.
Кроме того, обе последовательности, кодирующие люциферазу – дикого типа и лишенная CpG – были встроены в вектор pсDNA3.1 (Invitrogen). В получившихся конструкциях оказалось 329 и 426 CpG-динуклеотидов соответственно.
Последовательность Luc0 была вырезана из конструкции pMBR2-Luc0 с помощью рестриктаз BsrG I и Nhe I и вставлена в вектор pсDNA3.1, полученный с использованием рестриктаз Acc65 I и Xba I. Последовательность wtLuc была вырезана из конструкции pGL3-Promoter (Promega, USA) с использованием рестриктаз Hind III и Xba I и вставлена в тот же вектор.
Для уточнения влияния небольшого числа CpG-динуклеотидов на кинетику экспрессии генов мы создали две плазмиды на базе вектора pCpG (Invivogen), полностью лишенного CpG-динуклеотидов. Одна из них – pCpG-Luc0 содержит лишенную CpG динуклеотидов люциферазу из последовательности Luc::Sh (InvivoGen). Вторая плазмида – pCpG-Luc3 – отличается от предыдущей введением трех CpG-динуклеотидов в последовательность, кодирующую люциферазу. Модификацию проводили при помощи ПЦР с использованием праймера TATTAGCTAGCTTACACGGCGATTTTGCCGCCCTTCTTGGCCTTG.
Для оценки уровня экспрессии -галактозидазы обоими векторами мы перенесли последовательность, кодирующую слитый белок LacZ:Sh, из плазмиды pMOD-LacZ:Sh (Invivogen) в вектор pMBR2 с помощью рестриктаз Nco I и Nhe I и получили конструкцию pMBR2-LacZ:Sh, содержащую 13 CpG-динуклеотидов. Затем последовательность LacZ:Sh была вырезана из этой конструкции при помощи рестриктаз BsrG I и Nhe I и вставлена в pcDNA3.1 вектор, разрезанный с помощью рестриктаз Acc65 I и Xba I. Полученная конструкция pcDNA3.1-LacZ:Sh содержала 329 CpG-динуклеотидов.
Для оценки уровня экспрессии гена eGFP последовательность, кодирующая белок EGFP (60 CpG), была вырезана из плазмиды pEGFP-N3 (Clontech) с помощью рестриктаз Nco I и Xba I и вставлена в вектор pMBR2, разрезанный с помощью рестриктаз Nco I и Nhe I. Полученная конструкция pMBR2-EGFP содержала 73 CpG. Кроме того, последовательность, кодирующая EGFP, была перенесена из плазмиды pEGFP-N2 (Clontech) в плазмиду pсDNA3.1/V5-HisB (Invitrogen) с помощью рестриктаз BamH I и Not I. Полученная конструкция pсDNA3.1-EGFP содержала 399 CpG-динуклеотидов и использовалась как контрольная. Использование лишенного CpG-динуклеотидов гена eGFP оказалось затруднено из-за его более слабой флуоресценции.
В качестве репортерного гена для экспериментов in vivo мы выбрали секретируемую щелочную фосфатазу мыши [186]. Это секретируемый белок, попадающий из клеток в кровоток. Он представляет собой фрагмент плаценарной фосфатазы и обладает термостабильностью. Благодаря этому его концентрацию в сыворотке крови легко определить путем инактивации нагреванием эндогенного, не обладающего термостабильностью белка взрослых животных. Кроме того, будучи мышиным белком, mSEAP не вызывает иммунного ответа. Для работы был использован лишенный CpG ген mSEAP (Invivogen) и ген дикого типа – mSEAPwt (MGC 60698), содержащий 69 CpG-динуклеотидов.
Ген mSEAP0 был вырезан из плазмиды pCpG-mSEAP по сайтам BsrG I и Nhe I и по этим же сайтам вставлен в вектор pMBR2. Вектор для переноса в pсDNA3.1 был получен разрезанием исходной плазмиды по сайтам Acc65 I (липкий конец совместим с BsrG I) и Xba I (липкий конец совместим с Nhe I).
Ген mSEAPwt был амплифицирован с использованием MGC клона в качестве матрицы и праймеров mSEAPwt-S1 TCTACTTACATGTGGGGAGCCTGCTTGC и mSEAPwt-A1 ATATTTGCTAGCTCTAGCCCGGGCTCACTGCAC. Праймер mSEAPwt-S1 содержит рестриктный сайт Psc I, а праймер mSEAPwt-A1 – Nhe I. Липкий конец при разрезании рестриктазой Psc I совместим с липким концом при разрезании по Nco I. Амплифицированная последовательность гена была разрезана полностью по сайту Psc I и частично по Nhe I (так как есть сайт внутри ОРС) и вставлена в вектор pMBR2 по сайтам Nco I и Nhe I. Отсутствие ошибок в амплифицированной последовательности было проверено секвенированием. Из вектора pMBR2 ОРС была вырезана по сайтам BsrG I и Nhe I и вставлена в pcDNA3.1 вектор, разрезанный по сайтам Acc65 I и Xba I.
Таким образом, для проведения экспериментов in vivo было сделано четыре конструкции: pMBR2-mSEAP0 (13 CpGs), pcDNA3.1-mSEAP0 (329 CpGs), pMBR2-mSEAPwt (82 CpGs), pcDNA3.1-mSEAPwt (398 CpGs).
Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе на экспрессию -галактозидазы и EGFP
Хотя в экспериментах с репортерным геном – люциферазой мы получили согласующиеся с литературными данными и нашей гипотезой результаты, однозначно указывающие на важность элиминации CpG-динуклеотидов для длительного поддержания экспрессии плазмидами трансгенов в МСК, оставалась возможность, что другие трансгены будут вести себя иначе. Чтобы сравнить экспрессию других репортерных генов разными векторами, мы создали конструкции с генами LacZ и eGFP в pMBR2 и pcDNA3.1.
МСК проэлектропорировали, введя в них плазмиды, кодирующие лишенную CpG-динуклеотидов -галактозидазу: pMBR2-Gal и pcDNA3.1- Gal. На второй, седьмой и четырнадцатый день после электропорации часть клеток была окрашена X-Gal (рис. 10).
Конструкция, состоящая из вектора pMBR2 и лишенного CpG-динуклеотидов трансгена, показала значительно более высокий уровень экспрессии -галактозидазы (измеренный, как отношение площади клеток, окрашенных в синий, к площади всех клеток) по сравнению с плазмидой, состоящей из вектора pcDNA3.1 и того же трансгена (рис. ПА).
К концу второй недели после электропорации экспрессия -галактозидазы вектором pcDNA3.1 упала почти до нуля, в то время как экспрессия вектором pMBR2 оставалась на достаточно высоком уровне. Скорость падения экспрессии трансгена также была ниже в случае pMBR2 вектора (рис. 11Б). В частности, к концу первой недели после электропорации падение уровня экспрессии по сравнению со вторым днем после электропорации было в 2,5 раза сильнее для плазмиды на основе вектора pcDNA3.1, чем для плазмиды на основе вектора pMBR2. Более того, к концу второй недели после электропорации уровень экспрессии -галактозидазы плазмидой на основе pMBR2 вектора составлял 18 % от уровня экспрессии на второй день, в то время как для плазмиды на основе pcDNA3.1 он упал почти до нуля.
Для изучения экспрессии гена eGFP использовался только вариант гена, содержащий CpG-динуклеотиды. Ранее было показано, что их удаление сильно снижает яркость флуоресценции белка [192], делая лишенный CpG вариант плохо подходящим для целей визуализации (рис. 12) и численной оценки экспрессии (рис.13). Оценка эффективности экспрессии GFP производилась путем проточной цитометрии.
Уровень экспрессии EGFP конструкцией на основе вектора pMBR2 оказался значительно выше, чем конструкцией на основе вектора pcDNA3.1. Это проявилось одновременно и в более высокой доле eGFP-позитивных клеток на второй день после электропорации (рис. 14А), и в более высокой интенсивности флюоресценции в позитивных клетках, что привело к гораздо более высокой интегральной флуоресценции при использовании конструкции с вектором PMBR2 (рис. 14Б).
Обе конструкции продемонстрировали существенное снижение флуоресценции со временем. Однако падение экспрессии было более выраженным для конструкции на основе pcDNA3.1 вектора. Так, процент EGFP-позитивных клеток при использовании pMBR2 конструкции упал в 7 раз к четырнадцатому дню после электропорации, а при использовании pcDNA3.1 конструкции он упал до нуля. Интегральный уровень флуоресценции к 14 дню после электропорации хотя и упал в 55 раз при использовании конструкции pMBR2-EGFP, но оставался значительно выше фонового значения, в то время как при использовании pcDNA3.1-EGFP конструкции он упал практически до нуля (Рис.14В, врезка). Отличие этих экспериментов от экспериментов с использованием люциферазы в качестве репортерного гена состоит в том, что при использовании люциферазы измерение происходило на уровне популяции клеток, а при использовании GFP – на уровне единичных клеток, что выразилось в значительно более быстром падении сигнала вследствие пролиферации клеток и связанного с этим разбавления плазмиды.
Обсуждение результатов, полученных в системе in vivo
Представленные результаты полностью согласуются с более ранними результатами других авторов, свидетельствующими, что добиться долговременной экспрессии трансгена плазмидными векторами в мышцах относительно несложно [52,54,55], и для этого не требуется дополнительная адаптация плазмиды. Однако вектор pMBR2 с геном mSEAP, лишенным CpG-динуклеотидов, даже в мышечной ткани показал гораздо лучшие результаты, чем стандартный вектор с тем же геном (рис. 15Г). С литературными данными также хорошо согласуются результаты эксперимента по экспрессии трансгенов в печени (рис. 16Г) [54, 56-58]. «Обычная» (содержащая CpG и не содержащая S/MAR элементов) плазмида оказалась не способна поддерживать продолжительную стабильную экспрессию даже трансгена, лишенного CpG-динуклеотидов (рис. 16В). Плазмида pMBR2 с геном mSEAP дикого типа оказалась способна поддерживать экспрессию на протяжении нескольких недель (рис. 16Б), и только вектор pMBR2 в сочетании с лишенным CpG-динуклеотидов геном mSEAP оказался способен поддерживать экспрессию репортерного гена на всем протяжении эксперимента (рис. 16А).
Нами был проведен анализ того, как полученные результаты согласуются с существующими на сегодняшний день гипотезами, объясняющими сайленсинг трансгенов, экспрессируемых плазмидными векторами. Иммунная система человека и других млекопитающих обладает механизмом, способным отличать бактериальную ДНК от собственной. Один из ключевых звеньев этого механизма – Толл-подобный рецептор 9 (TLR, Toll-like receptor 9), запускающий сигнальный каскад в случае взаимодейстия с неметилированными CpG-динуклеотидами. В каскаде принимают участие белки MyD88, IRAK и TRAF6, увеличивающие экспрессию NFB и AP1, которые, в свою очередь, приводят к увеличению выработки медиаторов воспаления [209, 210]. Долгое время считали, что именно этот имунный ответ приводит к сайленсингу трансгена, экспрессируемого плазмидными векторами in vivo. Было даже показано, что единственный CpG-динуклеотид может вызывать выраженный иммунный ответ при введении плазмиды в легкие [17].
Эта гипотеза, однако, была впоследствии подвергнута сомнению. Во-первых, у нокаутных мышей TLR9-/- действительно после введения содержащей неметилировнанные CpG-динуклеотиды ДНК не наблюдалось признаков иммунного ответа [65], однако сайленсинг экспрессии трансгена при этом не замедлялся [67]. Во-вторых, было показано, что элиминации плазмиды или селективной элиминации клеток, содержащих плазмиду, со временем не происходило [62,68]. Представленные в данной работе результаты, согласно которым плазмида, содержащая 13 CpG-динуклеотидов, успешно экспрессирует трансген на протяжении года в мышцах и печени, также не подтверждают этой гипотезы. Полученные результаты демонстрируют, что небольшое количество СpG динуклеотидов не оказывает резкого негативного влияния на уровень экспрессии трансгена.
Другой возможный механизм снижения уровня экспрессии – транскрипционный сайленсинг - de novo метилирование CpG-динуклеотидов с образованием неактивного хроматина. Этот механизм аналогичен механизму сайленсинга in vitro. Хотя в некоторых работах была показана корреляция между de novo метилированием [63,68] и уровнем экспрессии трансгена, в одном из исследований такой корреляции обнаружено не было [16].
Kей и др. выдвинули предположение, что к сайленсингу экспрессии трансгена приводят не CpG-динуклеотиды, входящие в состав вектора или ОРС, а любые бактериальные последовательности, ковалентно связанные с ОРС. В своих первых работах авторы использовали вырезаемые из плазмид линейные экспрессионные кассеты и миникольца, получаемые с помощью рекомбиназ. [63,69,70] Развивая свою гипотезу, авторы пришли к выводу, что даже обычная плазмида может успешно экспрессировать трансген долгое время, если отделить в ней экспрессионную кассету от бактериальных последовательностей с обеих сторон инсуляторами. На основании этих наблюдений было выдвинуто предположение, что при попадании бактериальных последовательностей в эукариотические клетки вокруг них формируется супрессивный гетерохроматин, распространяющийся вдоль молекулы ДНК. Инсуляторы препятствуют распространению супрессивного хроматина, и сайленсинг экспрессии трансгена не происходит. Однако уровень экспрессии трансгена в печени при использовании даже самых эффективных векторов в этих работах снижался в 5-10 раз в первые же дни после введения. [71]
Представленные в нашей работе результаты не согласуются с этой гипотезой. Вектор pMBR2 содержит бактериальные последовательности как в области начала репликации, так и в области, ответственной за устойчивость к антибиотику зеоцину, но тем не менее успешно экспрессирует адаптированный вариант трансгена. Против этой гипотезы также говорит негативное влияние на кинетику экспрессии использование дикого типа варианта mSEAP. Ген, кодирующий mSEAP дикого типа - это CpG-богатая (69 CpG-динуклеотидов), но эукариотическая последовательность. При этом уровень экспрессии трансгена плазмидой pMBR2-mSEAP и в мышцах, и в печени практически на всем протяжении эксперимента значительно выше, чем при использовании плазмиды pMBR2-mSEAPwt.
Следует отметить, что использованная в данной работе конструкция обладает некоторыми чертами конструкции Kея и др. [71]. В конструкции, представленной в данной работе, после рамки считывания присутствует S/MAR-элемент. S/MAR элементы могут обладать свойствами инсуляторов. В частности, они способны ограждать локус от супрессивного гетерохроматина [211]. Однако с точки зрения экспрессии трансгена эписомальными векторами, S/MAR имеют важное преимущество: они способствуют ассоциации плазмидного вектора с ядерным геномом и способствуют длительному эписомальному поддержанию плазмиды в делящихся клетках [37]. Выдвинутое в работе Кея и др. условие, что транскрипционная кассета должна быть с обеих сторон окружена инсуляторами, в нашей конструкции не выполняется, что не является препятствием для поддержания эффективной долговременной экспрессии трансгена с ее помощью.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют, что ключевую роль в сайленсинге трансгена in vivo играет CpG-метилирование вне зависимости от природы последовательности, содержащей CpG-динуклеотиды.