Содержание к диссертации
Введение
Список использованных сокращений 6
1. Введение 7
2. Обзор литературы 13
2.2.Проблема внутрибольничной и внутрикомнатной контаминации 20
2.3. Вирусные модели для изучения контаминации помещений
2.3.2. Вирус гепатита С (ВГС) 31
2.3.3. Вирус гепатита Е 34
2.3.4. Ротавирус 35
2.3.5. Аденовирус 39
2.3.6. Грипп 42
2.4. Молекулярные методы 46
2.4.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 46
2.4.2. Иммуноферментный анализ (ИФА) 56
3.Материалы и методы 59
3.1. Материалы 59
3.1.1. Химические реагенты 59
3.1.2. Реагенты и наборы для молекулярной биологии 59
3.1.3. Ферменты 60
3.1.4. Вирусы 60
3.1.5. Праймеры 60
3.1.6. Оборудование 62
3.2. Методы 63
3.2.1. Отбор проб 63
3.2.1.1. Сбор образцов с поверхностей в поликлинике 63
3.2.1.2. Сбор образцов с поверхностей в аудиториях учебного
3.2.1.3. Сбор образцов с поверхностей в научно-исследовательских и научных лаборатиях 65
3.2.2. Выделение РНК и ДНК 65
3.2.3. Проведение ПНР 66
3.2.4. Анализ результатов ПНР 69
3.2.5. Исследование природы нуклеиновой кислоты в пробах 69
3.2.6. Пробоотбор аэрозолей 69
3.2.7. Отбор сывороток крови у сотрудников научных
3.2.7.1. Оценка наличия у здоровых контактных и неконтактных лиц антител на вирус гепатита Е (ВГЕ) 70
3.2.8. Оценка наличия у здоровых контактных и неконтактных лиц антител к вирусу гепатита С (ВГС) 71
3.2.9. Исследование образцов поверхностного микрослоя и аэрозоля прибрежного биогеоценоза 72
4. Результаты 74
4.1 Эксперименты in vitro для проверки потенциальной возможности нуклеиновых кислот вирусов служить в качестве биомаркеров для выявления вирусов на поверхности.
4.1.1. Выбор наиболее чувствительного набора ПЦР для обнаружения гепатита А и С 74
4.1.2 Эксперименты in vitro для проверки стабильности нуклеиновых кислот вирусов гепатита А, С и Е на поверхностях 76
4.2 Анализ аэрозолей и поверхностей учебного заведения на присутствие нуклеиновых кислот ротавирусов, аденовирусов и вируса гриппа А для оценки возможности выявления вирусов на поверхности, как маркера внутрикомнатной контаминации 77
4.2.1 .Анализ образцов аэрозолей в аудиториях учебного заведения на содержание ротавирусов, аденовирусов и вируса гриппа А 77
4.2.2. Анализ образцов с различных поверхностей в аудиториях учебного заведения на присутствие ротавирусов, деновирусов и вируса гриппа А.
4.3. Выявление нуклеиновых кислот вирусов гепатита А и С, ротавируса, аденовируса и вируса гриппа А на поверхности различных помещений в поликлинике, как маркеров вирусной контаминации внутрибольничных помещений 86
4.4. Анализ образцов различных поверхностей в научных и диагностических лабораториях на присутствие нуклеиновых кислот вирусов гриппа А и гепатита А, С и Е, ротавирусов и аденовирусов и оценка степени вирусной контаминации внутрилабораторных помещений 90
4.4.1. Анализ образцов различных поверхностей в научных и диагностических лабораториях на присутствие нуклеиновых кислот вирусов гриппа А и гепатита А, С
и Е, ротавирусов и аденовирусов 90
4.4.1.4. Лаборатория № 4
4.4.1.5. Лаборатория № 5.
помещении.
4.4.2. Анализ нуклеиновых кислот,
4.4.3. Количественный анализ нуклеиновых кислот обнаруженных в лабораториях №1 и №2 и оценка степени вирусной контаминации внутрилабораторных
4. 5 Анализ вероятности реализации вирусной инфекции контактным путем, по уровню антител к гепатиту С и Е, в сыворотке крови у сотрудников научных лабораторий и медицинских
4.5.1. Оценка наличия у здоровых контактных и неконтактных лиц антител к вирусу гепатита Е
(ВГЕ)
4.5.1. Оценка наличия у здоровых контактных и неконтактных лиц антител на вирус гепатита С
(ВГС)
4.6. Исследование образцов поверхностного микрослоя и аэрозоля прибрежного биогеоценоза на наличие РНК вируса гриппа А для изучения механизма
7. Библиография
- Вирусные модели для изучения контаминации помещений
- Реагенты и наборы для молекулярной биологии
- Сбор образцов с поверхностей в научно-исследовательских и научных лаборатиях
- Эксперименты in vitro для проверки стабильности нуклеиновых кислот вирусов гепатита А, С и Е на поверхностях
Введение к работе
Актуальность темы
Актуальность изучения вирусов на поверхностях и в аэрозолях, определяется возможностью вирусов распространяться в человеческой популяции, реализуя алиментарный, аэрогенный и контактный механизмы передачи (Lopman B.A, 2005; Gallimore C.I., 2008). Изучение вирусов на поверхностях и в аэрозолях необходимо для более ясного понимания путей их распространения как внутри, так и вне помещений. При этом, в контексте проблем здравоохранения представляются особо важными два аспекта: изучение степени контаминации вирусами поверхностей и аэрозолей внутри помещений различной функциональности, а также изучение особенностей их циркуляции вне помещений, в биогеоценозе.
Изучение вирусной контаминации внутри помещений, в среде обитания человека, составляет основу исследований внутрикомнатных, в том числе внутрибольничных инфекций. По оценкам Центра контроля и профилактики заболеваний в США регистрируется около 1,7 миллиона случаев внутрибольничных инфекций, вызванных разными типами микроорганизмов, что приводят к 99000 смертям ежегодно (Pollack A, 2010). В Европе, смертность от внутрибольничных инфекций достигает 25000 случаев в год (Zarb P, 2012). В России, в отсутствии систематических статистических исследований, регистрируется около 30 000 случаев в год (Астахова А., 2011).
Известно, что вирусы могут распространяться через аэрозоли (Сыроешкин А. В., 2008; Гигани О. Б., 2008). Однако частицы аэрозоля могут оседать на поверхность, с ними могут оседать и вирусные частицы, внося существенный вклад в контаминацию помещений. Существуют государственные стандарты для чистоты воздуха (ГОСТ-Р-ИСО 14644-1-2002) и молекулярных загрязнений в воздухе (ГОСТ-Р-ИСО 14644-8-2008), однако определить контаминацию помещения измерением состава аэрозоля не всегда возможно. В силу этого важно было выяснить, можно ли использовать для определения контаминации другие маркеры, в частности, загрязненение поверхностей данных помещений. Для сравнения важно было определить, как выявляются вирусы в аэрозолях и на поверхностях в природном биогеоценозе.
Настоящая работа проводилась на моделях вируса гриппа А, адено и ротавирусов, а также
вирусов гепатита А, С и Е. Против заболеваний, вызываемых данными вирусами, не
предусмотрена обязательная вакцинация, существующее лечение преимущественно
симптоматическое. В силу этого указанные вирусы вносят существенный вклад в общий уровень
заболеваемости населения, В настоящей работе была исследована сохранность нуклеиновых
кислот этих вирусов на поверхности и в аэрозолях. Было показано, что обнаружение вирусов на
поверхностях может быть маркером вирусной контаминации помещений различной
функциональности. Также была оценена реакция иммунной системы здорового человека на загрязнение окружающей среды вирусами гепатита С и Е. В исследовании предложен также механизм распространения вируса гриппа А в прибрежном биогеоценозе Западной Арктики.
Степень разработанности темы исследования
Ранее проводили исследования внутрибольничных инфекций, вызываемых бактериями и грибами (Gunasekara T. D., 2009, Сергевнин В.И., 2012, Четина О.А., 2013). Больничное белье, медицинские халаты, стетоскопы, мобильные телефоны и наручные часы, могут быть источниками контаминаций микроорганизмами (Pinon A., 2013, Kokate S.B., 2012, Gunasekara T. D., 2009). Для оценки аэрозольных контаминаций бактериями существует способ осаждения бактерий на чашки с последующим подсчетом колоний (Breed R.S.,1916). Для вирусов подобных исследований не проводили. В ряде работ отмечен вклад вирусов во внутрибольничные инфекции (Morter S., 2011, Ganime A.C., 2012). В медицинских учреждениях на различных поверхностях, предметах, в воздухе обнаруживали норо-, рота-, аденовирусы и torque teno virus (TTV), что, по мнению авторов, может способствовать их распространению среди медицинского персонала, больных и посетителей (Carducci A., 2011, Morter S., 2011, Ganime A.C., 2012). В учебных аудиториях, в научных и диагностических лабораториях исследование вирусов на поверхностях и в аэрозолях не проводили. Однако имеются единичные исследования заражения людей гепатитом Е через контакт с инфицированными животными. Исследование наличия антител к гепатиту Е у ветеринаров, работающих с животными, показало, что ветеринары имеют повышенный уровень антител по сравнению с контрольной группой (Meng X. J., 2002). В совокупности это указывает на необходимость комплексного исследования противовирусного иммунитета в таких группах риска, как работники медицинских, и научно исследовательских лабораторий, работающих с потенциально инфицированными биологическими препаратами.
Цель и задачи исследования
Цель: Исследование возможности выявления на поверхности и (или) в аэрозолях нуклеиновых кислот (НК) вирусов гепатита А, С и Е, аденовирусов, ротавирусов и вирусов гриппа А для определения вирусной контаминации помещений различной функциональности и выявления новых механизмов трансмиссии вирусов в биогеоценозе.
Задачи исследования:
1. Провести эксперименты in vitro для проверки потенциальной возможности вирусных
нуклеиновых кислот служить биомаркерами для выявления вирусов на поверхности.
-
Провести анализ аэрозолей и поверхностей учебного заведения на присутствие нуклеиновых кислот ротавирусов, аденовирусов и вируса гриппа А для оценки внутрикомнатной контаминации.
-
Показать возможность выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатита А и С, ротавирусов, аденовирусов и вируса гриппа А на поверхностях различных помещений в поликлинике для оценки контаминации внутрибольничных помещений.
-
Провести подробный анализ образцов, собранных с различных поверхностей в научных и диагностических лабораториях, на присутствие нуклеиновых кислот вирусов гриппа А и гепатита А, С и Е, ротавирусов и аденовирусов и оценить степень вирусной контаминации внутрилабораторных помещений.
-
Проанализировать вероятность реализации вирусной инфекции контактным путем, оценив наличие антител к гепатиту С и Е в сыворотке крови у сотрудников медицинских учреждений и научных лабораторий.
-
Провести исследование образцов поверхностного микрослоя и аэрозоля прибрежного биогеоценоза на наличие РНК вируса гриппа А для изучения механизма трансмиссии вируса гриппа А с учетом абиотических факторов.
Научная новизна
Впервые были произведены комплексные исследования in vitro относительно стабильности РНК вирусов гепатита А, С и Е на поверхностях. Выявлено, что генетический материал данных вирусов сохраняется до 2-х суток и может быть использован в качестве биомаркера для выявления вирусов на поверхности.
Впервые был проведен комплексный анализ аэрозолей и поверхностей учебного заведения на присутствие нуклеиновых кислот вирусов гепатита А и С, ротавируса, аденовируса и вируса гриппа А и показана возможность выявления вирусов на поверхности как маркера внутрикомнатной контаминации.
Впервые было проведено комплексное исследование выявления нуклеиновых кислот вирусов, для которых реализуются контактный и аэрогенный механизм передачи, на поверхностях в помещениях лечебного, учебного и научного профиля. Для лабораторных помещений проведен дифференциальный анализ типа загрязнения и количественная оценка уровня контаминации рабочих поверхностей нуклеиновыми кислотами вируса гепатита С.
Впервые был исследован феномен контактного гуморального иммунного ответа к вирусам гепатита С и Е у сотрудников научных лабораторий и медицинских учреждений. У сотрудников
медицинских учреждений показано наличие специфических антител к вирусным антигенам на уровне, превышающем таковой у здоровых неэкспонированных участников исследования.
Впервые на основе изучения образцов поверхностного микрослоя и морского аэрозоля водных биогеоценозов предложен механизм трансмиссии вируса гриппа в морских биогеоценозах, представлена кинетическая схема взаимодействия вирус-хозяин-биоценоз, позволяющая математически моделировать численность вирусной популяции в зависимости от температуры.
Практическая значимость
Полученные в работе результаты можно будет использовать на практике для эффективной оценки вирусной контаминации больничных помещений, учебных аудиторий и научных лабораторий, выяснения причин внутрибольничных инфекций и для оценки эффективности санитарных мер профилактики вирусных заболеваний.
Полученные знания могут быть использованы как материалы для методических
рекомендаций по санитарному и экологическому контролю, позволят разработать и дополнить
схемы дезинфекции и клинической чистки помещений от внутрибольничных и внутрикомнатных
вирусных контаминаций. Это поможет улучшить контроль за соблюдением мер безопасности в
учреждениях различного профиля, включая медицинские учереждения и научно-
исследовательские институты (лаборатории).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Эксперименты in vitro могут показать потенциальную возможность нуклеиновых кислот вирусов служить в качестве биомаркеров для выявления вирусов на поверхности.
-
Комплексный анализ аэрозолей и поверхностей учебного заведения на присутствие нуклеиновых кислот, ротавирусов, аденовирусов и вируса гриппа А позволит дать оценку возможности выявления вирусов на поверхности как маркера внутрикомнатной контаминации.
-
Выявление нуклеиновых кислот вирусов гепатита А и С, ротавируса, аденовируса и вируса гриппа А на поверхности различных помещений в поликлинике является маркером вирусной контаминации внутрибольничных помещений.
-
Выявление вирусных нуклеиновых кислот НК на различных поверхностях и приборах в научных и диагностических лабораториях позволит оценить степень вирусной контаминации лабораторных помещений.
-
Анализ наличия и уровня антител к антигенам вирусов гепатита С и Е в сыворотках крови у сотрудников научных и медицинских учреждений позволит определить возможность
выработки гуморального иммунного ответа к данным вирусам за счёт контактов с
контаминированными носителями и, таким образом, оценить возможность
распространения этих вирусов контактным путем
6. Исследование образцов поверхностного микрослоя и аэрозоля прибрежного биогеоценоза
на наличие РНК вируса гриппа А позволит выявить новый механизм трансмиссии вируса гриппа А с учетом абиотических факторов.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2014); на международной научно-практической конференции «Современная парадигма научного знания: актуальность и перспективы» (Москва, 2014); на 11-ой ежегодной конференции Балтийских стран «Вирусные инфекции представляющих угрозу жизни человека» (Вильнюс, 2014); на 12-ой ежегодной конференции Балтийских стран совместно с Российской Академией последипломного образования «Вирусные инфекции регионального значения» (Москва, 2015); на XVI международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке: Достижения и перспективы современной российской и мировой науки» (Москва, 2015); на минисимпозиуме «Эпидемиология СПИДа и гепатита С и В в Балтийском регионе» (Cтокгольм, 2015); на международной научной конференции «XI Российская конференция с международным участием «Вирусные гепатиты достижения и новые перспективы» (Москва, 2015г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК.
Объём и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 147 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 145 источников, в том числе 108 иностранных. Работа содержит 24 рисунка и 20 таблиц.
Личное участие автора в получении результатов
При непосредственном участии автора проведено планирование экспериментов,
аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы. Автор коллекционировал образцы с поверхностей помещений различной функциональности (поликлиники, учебные аудитории и научно-исследовательские и клинические лаборатории), проводил все этапы молекулярного
исследования образцов. Автором было проведено комплексное исследование распространения вирусов через поверхность и аэрозоли, дисперсный и молекулярный анализ. Лично автором исследована стабильность нуклеиновых кислот вирусов гепатита А, С и Е на поверхностях, проведен дифференциальный анализ типа загрязнения и количественная оценка уровня контаминации поверхности лабораторных помещений. Также автором был исследован уровень антител к антигенам вируса гепатита С и гепатита Е медицинского персонала и сотрудников лабораторий научных учреждений.
Вирусные модели для изучения контаминации помещений
Вирусы инфицируют человека, животных, насекомых, грибы и бактерии. Вирусы в организме человека локализуются в дыхательных путях, крови, желудочно-кишечном тракте и наружных покровах.
Вирусы проникают в организм и могут вызвать инфекцию. Одни вирусы реплицируются в месте проникновения в организм, как вирусы гриппа и ротавирусы. Другие вирусы, после проникновения в организм умножаются, что приводит к виремии (вирусемии) и генерализации инфекции. В организме вирусы распрстраняются по нейронам ( вирусы герпеса и бешенства), лимфатической системе (полиовирус и реовирус) и через кровь ( вирусы гепатита В, С и энтеровирусы).
Вирусы могут иметь широкий круг хозяев или могут заражать только определенные клетки одного вида хозяина. Например, вирус энцефалита инфицирует несколько хозяев, человека, животных и клещей. Вирусы могут преодолевать межвидовые барьеры. Многие виды служат как резервуары для сохранения вирусов, например животные и птицы являются резервуарами сохранения вируса в межэпидемический период. Такая адаптация вируса к различным хозяевам обусловлена способностью вируса изменять свой геном или мутировать (Jaggar, R. Т.,1997; Воробьев А.А., 2012).
Для размножения вирус ищет восприимчивую клетку, у некоторых вирусов есть способность инфицировать клетки определенного типа, например, вирусы гепатитов поражают гепатоциты, кишечные вирусы поражают энтероциты. У большого количества вирусов есть способность поражать не один а несколько типов клеток, к примеру вирусы гепатита С поражают лимфотропен и гепатотропен, также к полиовирусу восприимчивы клетки желудочно-кишечного тракта, респираторного тракта и центральной нервной системы. Эта восприимчивость клеток к вирусам определяется присутствием вируса специфических рецепторов на поверхностях клетки, и содержанием клетки ферментов способных расщеплять белки на поверхности вирусов для проявления инфекционной фиктивности вируса (Воробьев А.А.,2012).
Проникновения вируса в клетку происходит путем адсорбции вируса на поверхности клетки. Эта адсорбция обусловлена взаимодействием между рецепторами на поверхности клетки и вирусными антирецепторами. Взаимодействие между рецептором и антирецептором происходит по принципу комплементарности. Вирусные антирецепторы это гликопротеины и белки, они могут образовывать шипы и пепломеры, например, гемагглютинин вируса гриппа, VP4 ротавируса и фибриллы аденовируса. Такие рецепторы могут выступать над поверхностью вариона или находиться в углублениях капсида, как у энтеровирусов. Вирусы проникают в клетку при помощи клеточных рецепторов, посредством которых в клетку проникают питательные вещества гормоны и т.д. Некоторые вирусы проникают в клетку с помощью интегринов, это молекулы экспрессируемые на клеточной поверхности и связязанные с цитоскелетом, состоят из а и р цепей, за счет различных комбинаций этих цепей существует около 20 членов этого суперсемейства, например, для ротавирусов — агРі интегрин. Существуют также рецепторы иммуноглобулинового суперсемейства, например, у гепатита С рецептором являются молекула CD81 и липопротеины низкой плотности (ЛНП). Аденовирус использует белки двух суперсемейств иммуноглобулинового и интегринового. Вирус герпеса проникает в клетку при помощи десяти рецепторов. Разные вирусы могут проникать в клетку при помощи одного и того же рецептора. Количество молекул рецептора на участке адсорбции вируса может достигать нескольких тысяч. Существует различные механизмы проникновения вирусов в клетку — трансмембранное проникновение (у полиовирусов) и проникновение путем рецепторного эндоцитоза (у аденовирусов и ротавирусов), а у вирусов растений - с помощью повреждения клетки ферментативным лизисом клеточной стенки. (SebestyenM.G.,2006; Jaggar, R. T.,1997;Lakadamyali; 2003) После проникновения вируса в клетку происходит депротеинизация, то есть освобождения вирусного генома от капсида и суперкапсида в цитоплазму клетки с использованием лизосомальных ферментов (Olson J. К., 1997). Наступает латентный период, так как вирус будто исчезает из клетки после депротеинизации вируса. Происходит транскрипция вирусных нуклеиновых кислот. Транскрипция, в зависимости от типа нуклеиновых кислот, происходит по-разному. У аденовируса двунитевая ДНК транскрибируется так же, как и клеточная с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы. РНК-со держащие вирусы могут содержать положительно-цепочечную РНК, в этом случае она самостоятельно выполняет функцию информационной РНК, как например у пикорнавируса. Также РНК может быть отрицательно-цепочечной, как у вируса гриппа, в этом случае синтезируется информационная РНК на матрице отрицательно-цепочечной РНК с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая проникает в клетку вместе с вирусной РНК. Затем происходит синтез вирусных белков (трансляция) с участием вирус-специфической информационной РНК, клеточных транспортных РНК, рибосом, митохондрий, аминокислот. Сначала синтезируются белки-ферменты, необходимые для процесса транскрипции, и для подавления метаболизма зараженной клетки, затем начинается синтез вирусных структурных белков - компонентов капсиды и суперкапсиды.
Репликация вирусного генома или синтез молекул вирусных нуклеиновых кислот, репликация вирусной двунитевой ДНК происходит с помощью клеточной ДНК-полимеразы. РНК-репликацию осуществляют вирусспецифические ферменты, информация о синтезе которых закодирована в вирусном геноме. Таким образом, происходит накопление вирусных нуклеиновых кислот, необходимых для формирования вирионов. (Owen Pornillos,2002; Sheila A. Stewart,2000) .
Так как синтез компонентов вириона происходит в разных клеточных структурах, необходима сборка вириона, вирусные частицы транспортируются с мест их синтеза в место их сборки. Вначале образуется нуклеокапсид за счет соединения белковых молекул в капсомеры и капсомеров с нуклеиновой кислотой. Сборка суперкапсидов у сложных вирусов, заканчивается обычно в процессе выхода вирионов из клетки. При этом элементы клеточной оболочки включаются в суперкапсид вируса.
Вирус выходит из клетки двумя способами, либо при выходе лизирует клетку, например аденовирусы, либо вирусы выходят методом отпочковывания при этом клетка остается жизнеспособна, например вирусы гриппа.
Репродукция вирусов в клетке происходит быстро за 4-5 часов после проникновения вирусной нуклеиновой кислоты, следовательно, манифестация вирусной инфекции в клетках происходит очень быстро. Жизненный цикл вирусов представлен рисунок 2. (Jaggar, R. Т.,1997; Воробьев А.А., 2012 ).
Реагенты и наборы для молекулярной биологии
Вирус гриппа вызывает острое инфекционное заболевание дыхательных путей. Грипп является одним из массовых заболеваний населения. Распространяется в виде эпидемий и пандемий. На данный момент выявлено более 2000 вариантов вируса гриппа, различающихся между собой антигенным спектром. В мире ежегодно умирают от 250 до 500 тысяч человек, большинство из них старше 65 лет (Голубев Д.Б., 2009). Вирус был выделен в 30-е года XX века английскими вирусологами У. Смитом, К. Эндрюсом и П. Лейдлоу. Вирусы гриппа относятся к семейству Ortomyxoviridae, это РНК-содержащие сложноорганизованные вирусы, которое включает роды Influenzavirus A, Influenzavirus В, Influenzavirus С. Затем деление проводится согласно подтипам (серотипам) поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В соответствие с антигенной специфичностью поверхностных гликопротеидов гемагглютинина и нейраминидазы, в данный момент известно 16 подтипов НА и 9 подтипов нейраминидазы (NA) (Webster R.G.,1992). В основном эпидемиологическое значение имеют вирусы гриппа типа А, так как вирусы, содержащие три подтипа НА (HI, Н2, НЗ) и два подтипа NA (N1, N2) имеют эпидемическую значимость для людей. Грипп типа А и В содержат NA и НА, обладающих гемагглютинирующей и нейраминидазной активностями. У гриппа С нет нейраминидазы, он обладает гемагглютинин-эстеразным проникающим белком (HEF), вирусы типа С встречаются редко и вызывают только спорадические заболевания. В классификации вирусов гриппа принято описывать серотип, происхождение, штамм, год выделения и поверхностные антигены подтипы нейраминидазы (N) и гемагглютинина (Н). Структура вируса гриппа представлена на (рисунке 8). (de Jong J.С.,1997; Воробьев А.А., 2012).
Вирус гриппа имеет сферическую форму диаметром 80—120 нм, в центре находятся восемь РНК-фрагментов, заключённых в липопротеидную оболочку, на поверхности которой имеются «шипы» состоящие из гемагглютинина (Н) и из Рисунок 8. Структура вируса гриппа нейраминидазы (N). Количество гемагглютинина в 5 раз больше количества нейраминидазы. У вирусов типа С нейраминидазы нет. Антитела, вырабатываемые в ответ на гемагглютинин (Н) и нейраминидазу (N), составляют основу иммунитета против определённого подтипа возбудителя гриппа (Mosley V. М.,1946; Fauquet С. М.,2005). Необычными для вирусов свойствами вируса гриппа является фрагментированность генома и изменчивость белков — гемагглютинина и нейраминидазы. У этих белков может происходить резкое изменение свойств — антигенный сдвиг, приводящий к появлению нового подтипа вируса, который, в свою очередь, может вызвать эпидемию (Wright К. Е.,1995).
У вирусов гриппа А и В часто происходят изменения в антигенной структуре. Поэтому есть множество названий подтипов, которые включают место появления, номер и год выделения, характеристика HN, например A/Moscow/10/99 (H3N2) (Воробьев А.А., 2012).
Вирусы гриппа чувствительны к растворителям жиров, детергентам, формальдегиду, к УФ облучении, к РН среды ниже 5 и инактивируются при температуре 56 С (Воробьев А.А., 2012).
Основной механизм передачи вирус гриппа аэрогенный, путь воздушно-капельный. Вирус проникает через клетки эпителия верхних дыхательных путей, носа, трахеи, бронхов. Симптомы заболевания: раздражение верхних дыхательных путей кашель, чихание, заложенность носа. Через поврежденные эпителиальные барьеры вирус гриппа проникает в кровоток и вызывает виремию. Вирус оказывает токсическое действие, выражающееся в виде повышения температуры, озноба, головной боли. Симптомы гриппа не являются специфическими, его можно отличить от других ОРВИ только лабораторными анализами: выделением вируса из мазков горла или мазков слизистой оболочки носа в культуре клеток или на куриных эмбрионах, серологический тест на наличие антигриппозных антител в крови (Веаге A.S.,1991), а также выявление генома вируса методом ПЦР.
Инкубационный период 1—2 дня. Клинические проявления сохраняются 3—7 дней. Инфекция начинается обычно с резкого подъёма температуры тела до 38 С -40 С, которая сопровождается симптомами интоксикации: ознобом, болями в мышцах, головной болью и чувством усталости. Выделений из носа, как правило, есть выраженное чувство сухости в носу и глотке. При гриппе типа А начало болезни острое, грипп А нейротропен, поэтому возможно развитие нейротоксикоза, в результате чего может наступить смерть, чаще всего у детей. Грипп А также может осложняться нарушениями функций нервной, сердечно-сосудистой систем, нарушениями функции печени и почек. Грипп представляет большую опасность из-за возможности развития серьёзных осложнений, особенно у детей, пожилых и ослабленных больных. Осложнения могут быть лёгочные, такие как бактериальная пневмония, формирование абсцесса лёгкого, образование эмпиемы, также может быть внелёгочные, бактериальные риниты, синуситы, отиты, трахеиты, вирусный энцефалит, менингит, неврит, радикулоневрит, поражение печени, миокардит, токсико-аллергический шок (Hien Т.Т.,2004; de Jong M.D., 2005; Peiris J.S.,2004).
Лечение в основном симптоматическое, с использованием жаропонижающих, отхаркивающих, и противокашлевых средств, а также витамины, особенно витамин С в больших дозах. Так же могут быть использованы противовирусные препараты адамантанового ряда (Амантадин и Ремантадин) и ингибиторы нейраминидазы (Занамивир и Озельтамивир). (Stephenson Г, 1999; ЛеневаИ.А., 2006)
Плановая профилактика состоит в применении вакцин. Их применяют перед началом эпидемического сезона. Предотвращает распространение вирусов гриппа изоляция больных, карантин в детских коллективах и лечебных учреждениях, ношение марлевой повязки, мытье рук, влажная уборка с применением любого дезинфицирующего средства, дезинфекция белья и посуды (Гуревич К. Г., 2001; Гендон Ю.3.,2007; Петров Р.В.,2007; Романцов М.Г., 2007).
Сбор образцов с поверхностей в научно-исследовательских и научных лаборатиях
Антитела IgG к вирусу гепатита Е в сыворотках крови лабораторных и медицинских работников определяли тестированием на наличие антител анти-ВГЕ IgG. Анализ проводили методом иммуно ферментного анализа (ИФА) с использованием набора реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G» (НПО «Диагностические системы»). Анализ проводили, как описано ранее (Дьяррассуба А, 2016).
Группы обследования: здоровые контроли, не имеющие рисков инфекции вирусом гепатита Е (N=9), медицинские работники (N=15), работающие с пациентами, сотрудники лабораторий г. Москвы (N=18), сотрудники исследовательской лаборатории г. Таллин, Эстония (N=13), которые работают с инфицированными материалами биологическими образцами пациентов и животных
Использовали иммуноферментный метод определения специфических антител к спектру индивидуальных антигенов HCV в сыворотке крови. Белковые антигены, растворенные в карбонат-бикарбонатном буфере в концентрации 0.5 мкг/мл, наносили на планшеты в объеме 100 мкл в лунку и инкубировали 16-18 часов при комнатной температуре. После 6 раз отмывали 0.5М раствором NaCl, содержащим 0.05% Твин-20, вносили сыворотки (по 100 мкл), разведенные 1:200, 800 и 3200 0.05 М фосфатным буфером (рН 7.3-7.6), содержащем 0.15 М NaCl, 2% нормальной козьей сыворотки 0.01 % Твин-20 и 0.5% фетального альбумина теленка. В качестве положительного контроля использовали сыворотки больных хроническим вирусным гепатитом С (п=12). Три лунки использовали, как негативные контроли фоновой реакции. Планшет инкубировали ночь (16 ч) при 6-8 С, затем 6-кратно отмывали. В каждую лунку, включая контрольные, наносили по 100 мкл раствора вторичных антител против IgG человека, меченых пероксидазой хрена (DAKO, Дания), и инкубировали 1.5 ч при 37 С, после чего отмывали, как описано выше. Для проявления реакции в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора субстрата и инкубировали 10-15 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл раствора 2.5М серной кислоты. Цветовую реакцию регистрировали при длине волн 450 нм с вычитанием фонового поглощения при 620 нм. Из значения оптической плотности вычитали среднюю величину оптического поглощения в 3 контрольных лунках. Для каждого разведения сывороток здоровых контролей определяли среднюю величину оптического поглощения (AVERAGE норм) и среднюю величину отклонения от средней величины оптического поглощения (STDEVP норм). Положительными на антитела к ВГС каждой специфичности считали сыворотки больных ВГС, оптическое поглощение которых при данном разведении превышало сумму (AVERAGE норм + 3 STDEVP норм). Эту величину считали отсекающим значением (cut-off). Все сыворотки, дающие оптическую плотность меньше 0.1, считали серонегативными (даже если cut-off при данном разведении был 0.1).
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью статистической программы «STATISTICA 7.0» и «Microsoft Excel». Для оценки статистической значимости результатов исследования применяли непараметрические статические методы, Крускалл-Виллис, Манн-Витней тест (Kruskall-Wallis and Mann-Whitney U tests). Достоверными считали значения p 0.05. Определяли процентное содержание ряда полученных данных (%), среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (m).
Отбор проб прибрежного биогеоценоза произведен во время экспедиции в юго-восточную часть Баренцева моря, (2013 г. ) Маршрут движения судна пролегал вдоль Кольского полуострова Мурманск - м.Чебрай - о. Малый Олений - м. Териберский - о-ва Гавриловские - о. Большой Олений - о-ва Семь Островов. Все пробы упаковывали в герметичную тару и замораживались в жидком азоте.
Пробоотбор внутрикомнатных и морских аэрозолей проводился с помощью специального устройства (Goncharuk V.V., 2012) на аналитические фильтры АФА-РМП-3, изготовленные на основе материала ФПП-15-1,5. Использовались одновременно три фильтра при каждой установке. Побудителем расхода воздуха являлся пылесос «Karcher» NT 351 ECO с максимальным расходом воздуха 78 л/сек. Отбор проб атмосферного морского аэрозоля осуществлялся на ходу судна, при необходимых направлениях относительного ветра (острые углы относительно оси судна) посредством принудительной прокачки воздуха через фильтры, установленные на форштевне судна. Средняя скорость пробоотбора составляла 16,0-0,1 м3/час, объем воздуха пропущенного через фильтр на каждую пробу составлял 48-80 м . Фильтры измельчали и помещали в раствор 6M гуанидинтиоцианата , для последующего выделения ДНК и РНК.
Дисперсный состав аэрозолей внутри аудитории измеряли счетчиком частиц (Fluke), измерения проводились каждые 7 минут в течение 3 суток.
Пробоотбор поверхностного микрослоя (ПМС) проводили при помощи сетки Гаррета (толщина слоя 1 мм) пробоотборником [Procedure for sampling the sea-surface microlayer// Intergovermental Oceanographic Comissions. Manuals and Guides. V. 15. - UNESCO, 1985] и капиллярным пробоотборником (толщина слоя - 0,2 мм). Извлечение отобранной жидкости проводили с помощью сжатого воздуха.
Эксперименты in vitro для проверки стабильности нуклеиновых кислот вирусов гепатита А, С и Е на поверхностях
В исследовании была разработана методика обнаружения генома вирусов на поверхностях и в аэрозолях для оценки внутрибольничной и внутрикомнатной контаминации. Были выбраны наиболее чувствительные методики детекции вирусов гепатита А и С. Так, было выявлено, что для детекции РНК гепатита А могут быть использованы "АмплиСенс HAV-FL" (Интерлабсервис) и метод «гнездовой» ПНР, а для детекции РНК гепатита С рекомендуется использовать «гнездовую» ПЦР. Результат показывает, что метод гнездовой ПЦР достаточно чувствителен для детекции даже малых количеств вирусных геномов на поверхностях и в аэрозолях.
Первым этапом наших исследований был анализ образцов аэрозолей в аудитории учебного заведения, как модели помещения, где происходит скопление одновременно большого количество людей. В помещении, в котором воздух не очищается, в одном литре воздуха содержится до 300 тысяч пылинок размером 0,5 микрона. Объем вдоха составляет 1,5-2 л., всякий раз, при вдохе в дыхательной системе остается около 400 тысяч мельчайших частиц пыли и аэрозоля. Таким образом, человек ежедневно пропускает через свои легкие более 30 миллионов частиц пыли и аэрозоля. Размеры аэрозольных частиц обычно колеблются от 0.002 до 100 мкм. Несмотря на то, что масса аэрозольных частиц на м3 в среднем составляет несколько микрограммов, мы обычно не видим частицы и полагаем, что воздух чист. Именно поэтому, сначала мы исследовали концентрацию аэрозольных частиц. В аудитории, самая высокая концентрация частиц была обнаружена во время проведения лекций и семинаров, что указывает на высокую степень накопления аэрозольных частиц. При этом наибольшая концентрация частиц была обнаружена около двери, наименьшая - в центре аудитории. Обнаруженная нами в учебных аудиториях концентрация аэрозольных частиц 180 000 частиц/м3 соответствовала 9 классу ИСО межгосударственному стандарту «Чистые помещения и связанные с ними контролируемые среды» Часть 1. Классификация чистоты воздуха. Данная концентрация отвечает требованиям предъявляемой классификации учебным помещениям в эксплуатируемом состоянии.
Исследование состава аэрозолей на наличие вирусов показало, что в аэрозолях аудитории выявляется РНК вируса гриппа А. Возможно, что частицы вирусов находятся на аэрозольных частицах. Необходимо отметить, что РНК вируса гриппа типа А была выявлена в аэрозолях, собранных в учебных аудиториях, в период повышенной заболеваемости, в феврале 2013 г. В зимне-весенний период с февраль по март наблюдалось повышение заболеваемости гриппом, хотя эпидемии зарегистрировано не было. С конца января до начала февраля, в связи с окончанием зимних каникул и праздников, в эпидемический процесс стали активно вовлекаться дети школьного возраста, а с первой декады февраля - взрослое население (сообщение на сайте Роспотребнадзора). В осенний период (октябрь-ноябрь 2013 г.), РНК вируса гриппа А в аэрозолях учебных аудиторий обнаружено не было.
Чувствительность гнездовой ПНР 102 молекул/мкл или 1 х 10-6 мкг/мкл. Детекция РНК вируса гриппа типа А означает его наличие в количестве не менее, чем 1 х 10-3 мкг/м3. Такой уровень загрязнения соответствует 9 классу ИСО (стандарт ГОСТ-Р-ИСО 14644-8-2008 межгосударственного стандарта, «Чистые помещения и связанные с ними контролируемые среды». Часть 8. Классификация молекулярных загрязнений в воздухе.)
Вирусы, которые находятся на мельчайших частицах аэрозоля, могут оседать на поверхность, при этом процесс является обратимым и частицы аэрозоля могут также попадать с поверхности обратным током в аэрозоль (Рисунок 19), внося существенный вклад во внутрикомнатные контаминации. Поэтому в аудиториях, которых собирали образцы аэрозолей, провели исследование поверхностей, для того, чтобы выяснить, может ли измерение вирусов на поверхности внутри помещений быть маркером вирусной контаминации данных помещений. При обследовании поверхностей в аудиториях учебного заведения, была обнаружена РНК вируса гриппа А. РНК вируса гриппа А была обнаружена в пробе, собранной с поверхности стола преподавателя в тот же период, когда была выявлена РНК вируса гриппа в образцах аэрозоля.
Таким образом, анализ вирусов в учебном заведении показал, что выявление нуклеиновых кислот вирусов не только в аэрозолях, но и на поверхностях внутри помещений может быть маркером внутрикомнатной контаминации. Также мы выявили соответствие чистоты воздуха ГОСТу для служебных (учебных) помещений в рабочем состоянии. Однако необходимо отметить, что аэрозоли, даже в относительно невысокой, считающейся безопасной концентрации, могут служить носителями/переносчиками вирусных частиц и способствовать началу инфекционного процесса, особенно в период повышенной заболеваемости или во время эпидемий. Поэтому, безусловно, необходимо чаще проводить вентилирование или проветривание учебных помещений.
Следующие наши исследования касались выявления вирусов на поверхности в лечебных помещениях, научных и диагностических лабораториях. Выявление контаминации различной природы является важным моментом, т.к. доказанным является тот факт, что все больше проблем в настоящее время составляют внутрибольничные инфекции. В США инфекции, связанные с уровнем медицинской помощи вызывают экономический ущерб до 50 млрд. долларов. В России -официальный экономический ущерб составляет 700-800 млрд. рублей. И если бактериальные патогены изучены довольно подробно, то вирусные контаминации подробно ранее не были изучены. В результате исследования нам удалось выявить в поликлинике, в пробе, отобранной в процедурном кабинете обнаружить РНК вируса гепатита А, РНК вируса гриппа А - в двух пробах, собранных в инфекционном отделении. В нашем исследовании мы получили единичные положительные результаты, на большей части поверхностей внутрибольничных помещений вирусные нуклеиновые кислоты обнаружены не были. Другими словами, можно отметить, что уровень вирусной контаминации в исследованной поликлинике не был высоким. Такие результаты исследования хорошо согласуются с результатами, полученными другими исследователями (Carducci, А 2011). Однако, исследование внутрибольничной вирусной контаминации, с использованием выявления вирусных нуклеиновых кислот на поверхностях внутри помещений, необходимо проводить регулярно, для своевременного выявления вирусной контаминации и предотвращения внутрибольничной инфекции.
Подробный анализ поверхностей научно-исследовательских и научных лабораторий показал наличие нуклеиновых кислот вируса гриппа А, гепатита С и аденовирусов. Дальнейшее исследование природы нуклеиновой кислоты выявленной контаминации, показало, что большинство контаминации было вызвано ДНК-ампликонами (78,9%). Также необходимо отметить, что выявление нуклеиновых кислот на поверхности научно-исследовательских лабораторий коррелировало со спецификой работ в данных лабораториях. Количественное определение показало довольно высокие концентрации копий РНК вируса гепатита С (от 103 до 105 копий РНК/мл). Согласно литературным данным, 102 копий РНК вируса гепатита С, при попадании в организм может привести к виремии и последующей сероконверсии (Mohamed T.S., 2003). Поэтому выявленный уровень РНК гепатита С в научно-исследовательских лабораториях может быть потенциально опасен для персонала, работающего в данных лабораториях. С другой стороны, наличие контаминации ПЦР-ампликонами не позволяет адекватно интерпретировать результаты молекулярного анализа, проводимого в данных лабораториях.