Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Определение локального риска заражения в природном очаге клещевого энцефалита 14
1.1. Понятие природного очага инфекции 14
1.2. Понятие риска заражения в природном очаге инфекции 16
ГЛАВА 2. Особенности биологии и экологии иксодовых клещей 18
2.1. Систематическое положение и общая характеристика иксодовых клещей 18
2.2. Циклы развития клещей I. ricinus и I. persulcatus 20
2.3. Поведение иксодовых клещей 28
2.4. Иксодовые клещи как переносчики ВКЭ 35
ГЛАВА 3. Вирус клещевого энцефалита 42
3.1. Общая характеристика флавивирусов 42
3.2. Экология вируса клещевого энцефалита 50
3.3. Адаптации вируса клещевого энцефалита к репликации в переносчике и хозяине 53
Материалы и методы 67
ГЛАВА 1. Вирусы, клетки и животные, использованные в работе 67
1.1. Клетки 67
1.2. Вирусы 68
1.3. Животные 68
1.4. Титрование вируса методом бляшек в культуре клеток СПЭВ 68
1.5. Титрование ВКЭ на мышах 68
1.6. Динамика размножения ВКЭ в культуре клеток СПЭВ и линиях клеток клещей 69
ГЛАВА 2. Сбор, содержание и заражение иксодовых клещей 71
2.1. Сбор клещей в природе 71
2.2. Культивирование клещей в лабораторных условиях 73
2.3. Определение физиологического возраста самок иксодовых клещей 75
2.4. Определение репеллентной активности ДЭТА в отношении иксодовых клещей 77
2.5. Определение реакции иксодовых клещей на запахи растений 78
2.6. Методы заражения клещей вирусом клещевого энцефалита 81
2.7. Размножение ВКЭ в заражённых клещах I. ricinus при питании и разной температуре
окружающей среды 83
2.8. Проведение пассажей ВКЭ в клещах разных видов 84
2.9. Персистентная инфекция ВКЭ клещей разных видов 84
ГЛАВА 3. Молекулярные и серологические методы 86
3.1. Получение клещевых суспензий 86
3.2. Анализ клещевых суспензий на наличие антигена ВКЭ методом ИФА 86
3.3. Анализ клещевых суспензий на наличие РНК ВКЭ методом ПЦР в реальном времени 86
3.4. Проведение слепого эксперимента 87
3.5. Олигонуклеотиды 87
3.6. Выделение РНК 88
3.7. Обратная транскрипция 88
3.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 88
3.9. Аналитический электрофорез в агарозном геле. 3.10. Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы... 89
3.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 89
3.12. Статистическая обработка з
Результаты и обсуждение 91
Глава 1. Методы заражения иксодовых клещей ВКЭ 91
1.1. Травматичность методов 92
1.2. Динамика размножения ВКЭ в половозрелых клещах, зараженных разными методами 92
1.3. Эффективность заражения 95
1.4. Обсуждение 98
Глава 2. Исследование эффективности детекции вкэ в иксодовых клещах различными методами 101
2.1. Приготовление материала для исследования 101
2.2. Результаты анализа клещей 104
2.3. Обсуждение 109
ГЛАВА 3. Неоднородность обилия и зараженности вкэ иксодовых клещей на примере иксодофауны республики карелия 111
3.1. Видовой состав иксодовых клещей в различных районах Республики Карелия 111
3.2. Обилие и зараженность иксодовых клещей ВКЭ в разных районах Республики Карелия
114
3.3. Реакция клещей на запахи растительного происхождения 117
3.4. Обсуждение 126
ГЛАВА 4. Исследование физиологического состояния и поведения половозрелых иксодовых клещей из природных популяций 129
4.1. Физико-географическая характеристика мест сбора клещей 129
4.2. Физиологический возраст иксодовых клещей в природных популяциях 132
4.3. Чувствительность иксодовых клещей к репелленту ДЭТА 140
4.4. Обсуждение 143
ГЛАВА 5. Размножение вкэ в иксодовых клещах разных видов 145
5.1. Накопление ВКЭ в половозрелых клещах I. ricinus при различных условиях их содержания 147
5.2. Адаптация ВКЭ к острой инфекции при пассировании в иксодовых клещах разных видов 149
5.3. Адаптация ВКЭ к персистентной инфекции в клещах I. ricinus, I. persulcatus и D. reticulatus 155
5.4. Персистентная инфекция ВКЭ в культурах клеток клещей I. ricinus (IRE/CTVM19) и Hyalomma anatolicum anatolicum (HAE/CTVM8) 161
5.5. Обсуждение 168
Заключение 171
Выводы 174
Список литературы 175
- Понятие риска заражения в природном очаге инфекции
- Поведение иксодовых клещей
- Титрование вируса методом бляшек в культуре клеток СПЭВ
- Определение реакции иксодовых клещей на запахи растений
Введение к работе
Актуальность исследования
Клещевой энцефалит (КЭ) представляет серьезную проблему для всемирного здравоохранения как наиболее значимая по последствиям из переносимых иксодовыми клещами инфекций. Для понимания механизмов функционирования паразитарной системы требуются фундаментальные знания о физиологии клещей, свойствах вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и взаимном влиянии клеща и вируса. Актуальность данной работы заключается в необходимости получения новой и осмыслении известной информации о вирусологических и паразитологических аспектах оценки локального риска заражения в природных очагах КЭ.
Степень разработанности темы
На момент выполнения данной работы уже проведено большое количество исследований, направленных как на изучение свойств самого природного очага КЭ, так и на анализ характеристик членов паразитарной системы «возбудитель-переносчик-прокормитель» и взаимоотношений между ними. Подробно изучена биология, экология и эпидемиологическое значение иксодовых клещей и ВКЭ. Исследованы некоторые аспекты взаимного влияния организма клеща и ВКЭ, в частности были получены данные, указывающие на влияние зараженности клещей ВКЭ на их поведение и физиологические процессы (Алексеев и др., 1988, 1992; Коротков и Буренкова, 2006), а для ВКЭ было показано разное селективное давление на вирусную популяцию при репродукции в клещах и млекопитающих (Дживанян и др., 1986, 1988, 1991; Labuda et al., 1994; Romanova et al., 2007; Ruzek et al., 2008; Khasnatinov et al., 2009). Несмотря на большой объем накопленных данных, для понимания механизмов, определяющих связь различных характеристик биоценоза со свойствами циркулирующего ВКЭ, которые в свою очередь определяют активность локального очага, необходимы дополнительные комплексные вирусологические и паразитологические исследования функционирования паразитарной системы «ВКЭ-иксодовые клещи-прокормитель».
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было изучение паразитологических и
вирусологических аспектов оценки локального риска заражения в природных
очагах КЭ. Были сформулированы следующие задачи: 1) оценить
эффективность детекции ВКЭ в иксодовых клещах разных видов
современными методами, применяемыми в эпидемиологических
исследованиях; 2) изучить влияние физиологического состояния и зараженности ВКЭ клещей на их поисковую активность и оценить эти характеристики природных популяций клещей из сходных и удаленных друг от друга мест обитания; 3) исследовать возможность влияния растений разных видов на распределение иксодовых клещей в биотопе; 4) сравнить динамику размножения ВКЭ при острой и персистентной инфекции в клещах разных видов и в перевиваемых культурах клеток клещей; 5) изучить свойства вариантов ВКЭ, адаптированных к острой и персистентной инфекции в клещах разных видов, а также в перевиваемых культурах клеток клещей.
Научная новизна
Впервые: - изучена динамика репродукции ВКЭ в клещах – основных и второстепенных переносчиках вируса – при различных методах заражение и при разных условиях (комнатная и повышенная температура, в голодных и питающихся клещах); - исследовано влияние зараженности ВКЭ и физиологического возраста клещей на их поисковую активность и чувствительность к репелленту ДЭТА; - показано, что при достаточной влажности иксодовые клещи разных видов (Ixodes ricinus и I. persulcatus) реагируют на некоторые запахи растительного происхождения сходным образом, тогда как реакция клещей одного вида из удаленных друг от друга регионов на некоторые растительные экстракты может значительно различаться; - исследованы характеристики острой и хронической инфекции ВКЭ в клещах и перевиваемых культурах клеток клещей (основных и второстепенных переносчиков вируса) и проведено изучение свойств вариантов вируса, имеющих селективное преимущество в данных системах; - проведен «слепой» эксперимент по изучению эффективности детекции ВКЭ в клещах методами ИФА и ПЦР в реальном времени с использованием существующих
коммерческих тест-систем и лабораторно зараженных и незараженных вирусом иксодовых клещей разных видов и фаз развития.
Теоретическая и практическая значимость работы
В работе на большом фактическом материале с использованием иксодовых клещей разных видов на модели ВКЭ получены новые экспериментальные данные, которые вносят вклад в решение фундаментальной проблемы о взаимодействии паразитарной системы клещ – ВКЭ. В ходе работы было сделано следующее: выбран наиболее эффективный метод лабораторного заражения клещей ВКЭ; показана зависимость от местообитания реакции иксодовых клещей одного вида на растительные экстракты; показано решающее влияние влажности окружающей среды на поведение иксодовых клещей; проведена оценка локального риска заражения в разных районах Республики Карелия в период массовой активности клещей; исследовано соотношение иксодид разного физиологического возраста в период их массовой активности в отдаленных друг от друга регионах; исследовано влияние физиологического возраста клещей на их поисковую активность; доказано влияние зараженности клещей ВКЭ на их активность и чувствительность к репелленту ДЭТА; продемонстрирована подробная динамика размножения ВКЭ в клещах при разных температурных режимах, а также при питании клещей на животном; описана персистентная инфекция ВКЭ клещей рода Ixodes и Dermacentor, а также культуры клеток клещей и изучены свойства вариантов вируса, адаптированного к данным системам. Таким образом, в ходе работы были исследованы различные аспекты взаимодействия между иксодовыми клещами и ВКЭ, что имеет большую теоретическую значимость. Практическая значимость работы заключается в исследовании эффективности современных методов детекции ВКЭ в иксодовых клещах и в изучении различных факторов, влияющих на локальный риск заражения ВКЭ в природном очаге. Это важно при оценке потенциальной опасности природных очагов КЭ и выборе необходимого объема, времени и места проведения профилактических мероприятий. Полученные данные позволили научно обосновать известный факт, что зараженность ВКЭ клещей, снятых с людей и животных, значительно выше, чем при сборе в природе с растительности.
Внедрение результатов исследования
Полученные в ходе работы результаты вошли в курс лекций по арбовирусам на биологическом факультете в МГУ им. М.В. Ломоносова, а также в курс лекций по вирусологии в ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России.
Методология и методы исследования
Для исследования взаимовлияния между клещами и ВКЭ необходимо было проведение модельных экспериментов с заведомо зараженными особями, для чего был осуществлен анализ лабораторных методов заражения клещей вирусом. Поисковую активность клещей оценивали согласно стандартной методике определения эффективности репеллентов (Методы определения эффективности…, 2004). Для изучения реакции иксодовых клещей на различные растительные экстракты использовали методику, разработанную А.В. Мишиным (1958) и модифицированную нами. Работу с ВКЭ проводили с использованием стандартных вирусологических, молекулярно-биологических и серологических методов.
Личный вклад автора
Автор данной работы входила в состав экспедиций сотрудников ФГБНУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова по сбору полевого материала. Исследования популяций клещей в Республике Карелия проводили совместно с сотрудниками института биологии Карельского научного центра РАН. Все акарологические и вирусологические исследования и работа с перевиваемыми культурами клеток клещей проведены автором самостоятельно. Работа по определению нуклеотидной последовательности участков генома ВКЭ была проведена автором совместно с м.н.с. ФГБНУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова А.Г. Литовым.
Положения, выносимые на защиту
-
ВКЭ способен размножаться, достигать высоких титров и формировать персистентную инфекцию как в клещах - основных переносчиках вируса, так и в клещах, таковыми не считающимися. Уровень репродукции ВКЭ в иксодовых клещах зависит от температуры окружающей среды и значительно повышается при их питании.
-
Адаптация ВКЭ к острой инфекции в основных и второстепенных клещах-переносчиках вируса, а также к персистентной инфекции в перевиваемых
культурах клеток клещей приводит к повышению гетерогенности вирусной популяции и появлению в ней вариантов ВКЭ со сниженной нейроинвазивностью. При персистентной инфекции ВКЭ в клещах разных видов отмечено повышение гетерогенности популяции без быстрого отбора подобных мутантов.
-
В период массовой активности клещей соотношение особей разного физиологического возраста в природных популяциях различается не только в удаленных друг от друга регионах, но и в районах с похожими ландшафтно-климатическими условиями.
-
Клещи, зараженные ВКЭ, более активны и толерантны к воздействию репеллента ДЭТА, чем незараженные клещи. Наиболее высокой поисковой активностью среди самок I. ricinus обладают особи IV физиологического возраста.
-
На распределение клещей в биотопах существенное влияние оказывают относительная влажность воздуха, видовой состав растений и регион местообитания клещей.
-
ПЦР в реальном времени является более чувствительным и оптимальным чем ИФА методом оценки зараженности иксодовых клещей ВКЭ.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных данных подтверждается использованием большого числа клещей и стандартных, строго контролируемых условий при проведении экспериментов, а также большим объемом статистически обработанного фактического материала. Материалы диссертации были представлены на 7 международных, 4 отечественных и 5 всероссийских конференциях с международным участием, а также на 3 межлабораторных конференциях молодых ученых.
Автором получены следующие премии: награда за лучшую работу в области клещевых инфекций среди молодых ученых на XI International Jena Simposium on Tick-borne Diseases (Weimar, 2011); награда за лучший постерный доклад на Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 9 научных статей: 3 – в российских
журналах, входящих в Перечень изданий, рекомендованных ВАК, 3 – в
зарубежных журналах, индексируемых в международных системах
цитирования (Web of Science, Scopus, PubMed), 3 – в прочих изданиях.
Структура и объем диссертации
Диссертация построена по стандартному плану, изложена на 200 страницах текста и включает в себя 32 таблицы и 32 рисунка. Библиографический указатель содержит 334 источника литературы: 168 отечественных и 166 зарубежных.
Понятие риска заражения в природном очаге инфекции
В природном очаге осуществляется «процесс непрерывного взаимодействия популяции возбудителя с популяциями его естественных хозяев и внешней средой, обеспечивающий существование возбудителя» (Коренберг и др., 2013, стр. 29), который именуется эпизоотическим процессом. Последний состоит из эпизоотических циклов, включающих в себя фазы резервации и циркуляции. Так, в природном очаге КЭ фаза резервации представлена периодами долгосрочного пребывания вируса в клещах при их зимовке или длительном голодании.
При контакте человека с популяцией возбудителя в природном очаге возможно его заражение, т.е. проявление эпидемического процесса. Согласно мнению Э.И. Коренберга, риск заражения людей в природном очаге представляет собой «результат взаимодействия двух показателей: интенсивности циркуляции возбудителя в данном природном очаге (т.е. его лоймопотенциала) и интенсивности контакта населения с природным очагом» (Коренберг и др., 2013, стр. 32). В некоторых работах (Suss et al., 2004) вводится понятие локального риска заражения, которое тождественно понятию «лоймопотенциал» и характеризует потенциальную опасность природных очагов в определенном месте. Мы также используем это понятие. Локальный риск заражения определяется многими факторами. В учении о природной очаговости трансмиссивных болезней Е.Н. Павловский (1964) отметил, что вероятность заражения в природном очаге зависит от: 1) свойств возбудителя, определяющихся его видовыми особенностями, физиологическим состоянием, предшествующими путями циркуляции и совокупностью воздействующих факторов во время пребывания возбудителя в переносчике; 2) поведения переносчика и дозы введенного возбудителя; 3) индивидуального состояния переносчика, человека и животного-восприемника (Павловский, 1964). Иными словами локальный риск заражения в очаге трансмиссивной инфекции зависит от видовых и физиологических особенностей популяции переносчика (жизненный цикл, поведение, физиологическое состояние), от численности и зараженности популяции переносчика, а также от свойств популяции возбудителя.
Так, успешность и активность циркуляции ВКЭ в природном очаге определяется видовым составом, экологией и биологией клещей-переносчиков и животных-хозяев, свойствами вирусной популяции, а также климатическими условиями. Абиотические факторы оказывают огромное влияние на всех членов паразитарной системы, которые также тесно взаимосвязаны между собой. Так, обилие клещей в какой-либо конкретной среде обитания определяется такими факторами, как растительный покров, климат и погода, которые влияют на выживаемость и развитие свободноживущих фаз, а также успехом в нападении и питании на прокормителе паразитарных фаз (Таежный клещ…, 1985; Gray, 2002). Для клещей I. persulcatus было показано наличие среднесрочных и долгосрочных колебаний в динамике их численности, которые тесно связаны с долгосрочным изменением климата (Коротков, 1998). Физиологическое состояние клещей влияет на такие важные харатеристики как активность клещей, чувствительность к ДДТ (Успенский и Репкина, 1974), их восприимчивость к ВКЭ и сроки сохранения вируса в организме клеща (Мишаева и др., 1978; Алексеев и др., 1988; Разумова и Алексеев, 1991). В свою очередь, вирусу необходимо адаптироваться к жизненным циклам клещей и к постоянной смене хозяев (клещ-позвоночное животное), что оказывает определенное влияние на свойства вирусной популяции (Чунихин и Дживанян, 1977; Дживанян и др., 1986, 1988, 1991; Romanova et al., 2007). Указанные факторы и особенности взаимодействия членов паразитарной системы определяют риск заражения в локальном очаге КЭ. Для оценки локального риска заражения в очаге КЭ были предложены такие показатели как общая численность клещей, доля и численность особей, зараженных ВКЭ (Коренберг, 1981; Kahl, 1996), численность клещей, содержащих высокие титры вируса (Korenberg and Kovalevskii, 1995) и активность клещей (Kahl, 1996). В некоторых исследованиях для упрощения оценки и сравнения риска заражения в локальных очагах было введено понятие индекса риска, которое определялось как количество инфицированных нимф и половозрелых клещей на участке площадью 100 м2 (Cinco et al., 2008). Для оценки и прогнозирования заболеваемости населения эндемичной территории КЭ некоторыми учеными был предложен такой параметр природного очага как доля серопозитивных мелких млекопитающих и среднее количество личинок и нимф клещей, питающихся на них (Moshkin et al., 2009), что также является фактором локального риска заражения в очаге.
Таким образом, важнейшими показателями для оценки локального риска заражения в очагах КЭ являются количество вирусофорных клещей, титр ВКЭ в заражённых клещах, а также вирулентность вируса. В свою очередь, для данного природного очага КЭ эти показатели определяются свойственными ему видовым составом клещей-переносчиков и их прокормителей, а также особенностями их жизненных циклов. Важным фактором, влияющим на локальный риск заражения, является также активность и агрессивность иксодовых клещей, которые в свою очередь определяются видом клещей и их физиологическим состоянием. ГЛАВА 2. ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ И ЭКОЛОГИИ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ Биология, экология и медицинское значение иксодовых клещей подробно описаны во многих статьях, монографиях и книгах ("Таежный клещ Ixodes persulcatus Schulze (Acarina, Ixodidae)", 1985; Балашов, 1998; Nuttall and Warburton, 1911; Guglielmone, 2003; Ticks: Biology, Disease and Control, 2009). В данной главе приведены некоторые сведения об особенностях экологии, биологии и физиологии клещей, необходимые для решения поставленных в работе задач, особенно подробно они изложены для клещей Ixodes ricinus и I. persulcatus – основных переносчиков ВКЭ.
Систематическое положение и общая характеристика иксодовых клещей Семейство иксодовых клещей (Ixodidae) относится к типу членистоногих (Arthropoda), классу хелицеровых (Chelicerata), отряду паразитиформных клещей (Parasitiformes), надсемейству иксодоидных клещей (Ixodoidea). Вопрос о систематике внутри семейства иксодид пересматривался много раз в связи с получением все новых данных о генетических сходствах и различиях между разными родами. Опираясь на морфологические особенности клещей, Н.А. Филиппова предложила выделить в семействе два подсемейства: Ixodinae с единственным родом Ixodes (Lutreille, 1795), и Amblyomminae, включающим в себя трибу Amblyommini (Amblyomma Koch, 1844; Aponomma Neumann, 1899; Anomalohimalaya Hoogstraal, Kaiser et Mitchell, 1970; Haemaphysalis Koch, 1844; Dermacentor Koch, 1844; Rhipicentor Nuttall et Warburton, 1908), а также трибу Rhipicephalini (Margaropus Karsch, 1897; Boophilus Curtice, 1891; Cosmiomma Schulze, 1919; Hyalomma Koch, 1844; Nosomma Schulze, 1919; Rhipicephalus Koch, 1844). В дальнейшем для классификации иксодовых клещей систематики начали использовать молекулярные маркеры, такие как первый и второй внутренние транскрибируемые спейсеры предшественника рРНК, а также митохондриальные гены 16S, 12S, цитохромоксидазы I и III. Наиболее подробно эволюция взглядов ученых на систематику группы иксодовых клещей представлена в обзоре S. Nava с соавторами (2009). В настоящее время семейство Ixodidae предлагается подразделять на 5 подсемейств: Ixodinae с единственным родом Ixodes, Bothriocrotoninae с единственным родом Bothriocroton Keirans, King & Sharrad, 1994, Amblyomminae с родом Amblyomma, Haemaphysalinae с родом Haemaphysalis и подсемейство Rhipicephalinae с 8-ю родами (Anomalohimalaya, Cosmiomma, Dermacentor, Hyalomma, Margaropus, Nosomma, Rhipicentor и Rhipicephalus) (Barker and Murrell, 2004).
Поведение иксодовых клещей
Одним из важных показателей физиологического состояния иксодовых клещей является их физиологический возраст (ФВ), который был предложен для оценки возрастного состава природных популяций клещей. В понимании В.Н. Беклемишева (1962), физиологический возраст членистоногих измеряется накоплением в организме необратимых изменений, обусловленных его нормальной жизнедеятельностью. По отношению к иксодовым клещам термин «физиологический возраст» был впервые применён Ю.С. Балашовым (1961): «физиологический возраст голодных иксодид отражает состояние запасных питательных веществ в организме». Позднее И.В. Разумова (1962, 1977) показала, что возрастные изменения голодных клещей связаны не только с расходованием запасных питательных веществ, но и с накоплением экскретов, сформулировав понятие ФВ как «степень общего необратимого морфофизиологического изменения организма в течение прожитой жизни, измеряемого состоянием запасных питательных и экскреторных веществ» (цит. Разумова, 1977; 1983). В том же ключе расширил свое представление Ю.С.Балашов (1998) - «физиологический возраст… клещей отражает необратимые изменения в их организме, связанные с расходованием энергетических резервов и накоплением конечных продуктов метаболизма в организме». В 2009 году И.В. Разумова, показав, что физиологический возраст животного - это степень биологического старения организма, то есть поэтапное биологическое изменение в течение жизни, уточнила термин «физиологический возраст» в применении к иксодовым клещам: «степень реального необратимого биологического изменения организма в течение прожитой жизни, измеряемая необратимыми изменениями в результате нормальной жизнедеятельности» (цит. Разумова, 2009).
Первым методом для определения ФВ иксодовых клещей был гистологический. Он был предложен Ю.С. Балашовым и основан на вскрытии клеща с последующей гистологической обработкой. В качестве критериев использовали следующие показатели: 1) степень заполненности отростков кишечника, 2) степень заполненности мальпигиевых сосудов гуанином, 3) количество включений гемоглобина и гематина в пищеварительных клетках. Содержание гликогена и жиров в пищеварительных клетках служили дополнительными признаками. Всего им выделено четыре ФВ иксодовых клещей. Особи I возраста проходят период послелиночного доразвития и неактивны, поэтому в сборах клещей на флаг встречаются крайне редко (Балашов, 1998). В дальнейшем, гистологический метод был усовершенствован И.В. Разумовой (1982, 1986). Л. В. Репкиной (1971, 1980) также на основании гистологических изменений в средней кишке была предложена 8-бальная система для определения ФВ иксодид. Однако гистологический метод трудоёмок, и его применение возможно только в лабораторных условиях. В связи с этим И.В. Разумовой был разработан сначала анатомический экспресс-метод, а в 2001 г. - метод прижизненного определения ФВ иксодовых клещей (Разумова, 1975, 1977, 1987, 2001). В основе экспресс-метода лежит оценка только внешних признаков клещей – степени выпуклости или уплощенности задней половины тела, углубленность борозд и др. Этот метод рассчитан в основном на определение ФВ самок, т.к. они крупнее самцов и обладают менее склеротизированной кутикулой. Однако иногда экспресс-метод используют и для определения ФВ самцов и даже нимф (Разумова, Бабенко, 1981; Jensen, Kaufmann, 2003). В современных исследованиях этот метод применяется чаще всего, т.к. он наименее трудоёмкий, и клещи после определения ФВ остаются живыми. В зарубежной литературе также описаны отдельные попытки определения ФВ иксодид по разным морфологическим признакам. Установлено, что с течением времени изменяется состояние (степень вогнутости) вентральной поверхности абдомена у Dermacentor nuttalli (Pang et al., 1987), глубина и длина цервикальных борозд самок Amblyomma americanum (Jaworski et al., 1983), происходят изменения в слюнных железах у голодных Rhipicephalus appendiculatus (Walker, Fletcher, 1985) и т.д.
Физиологические и биохимические изменения, обусловленные старением, влияют на устойчивость клещей к неблагоприятным факторам. Так, у старых половозрелых особей I. persulcatus заметно увеличивается чувствительность к акарицидам (Успенский и Репкина, 1974). Физиологическое состояние переносчиков играет важную роль в сохранении возбудителей инфекции (Кондрашова, 1973). Так Н.П. Мишаевой с соавторами (1978) показано, что в клещах I. ricinus и D. andersoni Stiles, заражённых на 2-26 день после линьки, титры ВКЭ были достоверно выше, чем в клещах, заражённых на 65 и 75 дни. Более того, вирус не передается трансовариально старыми особями (8-18 месяцев после линьки), тогда как в яйцекладках молодых самок он сохраняется. Установлено, что при парентеральном заражении ВКЭ самок D. marginatus (Sulz.) из природной популяции клещи разного ФВ отличаются по восприимчивости к вирусу (Алексеев и др., 1988; Разумова, Алексеев, 1991). Наибольшее число случаев заражения слюны было отмечено у клещей зрелого III возраста (50%). В слюне самок II возраста вирус ни разу не был отмечен, а в слюне особей IV возраста – лишь 1 раз. Показано, что молодые клещи (II возраст) менее восприимчивы к вирусу клещевого энцефалита при парентеральном введении (67%) по сравнению с клещами III и IV возрастов (более 90%). У старых клещей IV возраста отмечено снижение интенсивности заражения (Разумова, Алексеев, 1991). Одной из наиболее вероятных причин различного уровня заражения самок разного ФВ являются существенные изменения в состоянии жирового тела при переходе от II возраста к IV. Полагают, что именно жировое тело с базофилами и нефроцитами, способными адсорбировать гемоциты с вирусом, создает преграду на пути вируса из гемолимфы в слюнные железы (Алексеев и др., 1991).
Соотношение взрослых клещей разного физиологического возраста в природных популяциях различается в зависимости от вида клещей, времени года и климатических условий местообитания. Активировавшиеся клещи могут быть II, III или IV ФВ в зависимости от времени активации. Таежные клещи, поднимающиеся на растительность весной, обладают большим запасом питательных веществ, чем особи, которые активизируются только к началу лета (Лыков, 1966). Данный факт можно объяснить тем, что при повышении температуры окружающей среды и, следовательно, подстилки клещи начинают тратить больше энергии на поддержание необходимого водного баланса, что приводит к увеличению расходования клещом пищевых резервов (Успенский и Репкина, 1979). В связи с тем, что у клещей I. persulcatus только один весенне-летний период активности и переживание второго сезона взрослыми клещами невозможно, в природных популяциях этих клещей наблюдается постепенное ее старение. Согласно данным группы ученых по различным регионам, в начале сезона активности клещей преобладают клещи II и III ФВ, а в конце - особи III и IV возрастов (Балашов, 1961; Князева, 1964; Хижинский, 1968; Успенский, Репкина, 1974). Процентные соотношения особей разного ФВ могут различаться в разные годы, в разных районах и биотопах, однако данные колебания, как правило, незначительны и обусловлены гидрометеорологическими условиями.
У клещей I. ricinus в связи с наличием повторного осеннего пика активности возрастной состав природных популяций сложнее, чем у таежных клещей. Осенний пик активности может быть обусловлен как повторной активизацией клещей прошлого года, так и проявлением активности недавно перелинявших особей. Последнее возможно только при наиболее благоприятных условиях, однако, именно за счет активных свежеперелинявших клещей возможно повторное осеннее увеличение доли особей II ФВ в природной популяции. Данное явление наблюдал Ю.С. Балашов в Ленинградской области, где в сентябре наряду с самками IV ФВ (22%) были многочисленны особи II ФВ (Балашов, 1962). В Московской области, однако, подобного увеличения доли молодых особей в осенний пик активности наблюдать не удалось, и в сентябре преобладали клещи III (39%) и IV (51%) ФВ (Разумова, 1986). Вероятно, активизация свежеперелинявших особей во второй пик активности во многом зависит от благоприятных климатических условий.
Более подробное обсуждение особенностей изменения соотношения особей разного ФВ в природных популяциях клещей I. persulcatus и I. ricinus приведено в разделе «Результаты и обсуждения» (глава 4.1.4).
Титрование вируса методом бляшек в культуре клеток СПЭВ
Сбор половозрелых иксодовых клещей, использованных в экспериментах, проводили по стандартной методике при помощи флага из вафельной ткани размером 80х100 см, передний край которого прикрепляли к легкому древку (Петрищева и Олсуфьев, 1964; Сбор, учет и подготовка…, 2002). Клещей снимали с флага через каждые 10-20 м маршрута и помещали в слегка увлажненные марлевые бинты. Бинты с клещами хранили при +4С до дальнейшего использования, но не более 2 недель.
В работе были использованы 1800 особей клещей I. persulcatus, собранных в мае-июне 2008 и 2009 гг сотрудниками Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова совместно с сотрудниками Карельского научного центра РАН в Республике Карелия (Рисунок 2.1), а также 300 особей клещей, собранных сотрудниками лаборатории биологии арбовирусов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова в первой половине мая 2008-2009 гг. в Республике Тыва (Рисунок 2.2). Сбор таежных клещей проводился в период их массовой активности. У собранных клещей определяли вид, пол, физиологический возраст и их обилие в природе.
Кроме того, мы использовали клещей из Калужской и Смоленской областей, собранных сотрудниками ИПВЭ им. М.П. Чумакова, а также клещей из Ставропольского края и Карачаево-Черкессии присланных сотрудниками ФБУЗ Центра гигиены и эпидемиологии. Всего в опытах было использовано около 2500 клещей 5 видов – I. ricinus (Калужская, Смоленская области, Ставропольский край), I. persulcatus (Республики Карелия и Тыва), D. marginatus (Карачаево-Черкессия), D. reticulatus (Калужская и Смоленская области, Ставропольский край), D. nuttalli (Тыва). Автор данной работы активно принимала участие в сборе иксодовых клещей.
Лабораторные культуры клещей в первом поколении были получены от самок I. ricinus (Калужская, Смоленская области, Ставропольский край), I. persulcatus (Республики Карелия и Тыва), Dermacentor marginatus (Карачаево-Черкессия), D. reticulatus (Калужская и Смоленская области, Ставропольский край) и D. nuttalli (Республика Тыва). Исходные самки клещей, давшие начало лабораторным культурам, были проверены на отсутствие зараженности 4 инфекциями с помощью набора на основе ПЦР в реальном времени (ИнтерЛабСервис, АмплиСенс TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL).
В лабораторных условиях клещей содержали в пробирках дифференцированной влажности (Нельзина, 1950), модифицированных нами (Рисунок 2.3). Стеклянные пробирки наполняли на 1/3 дистиллированной водой и вставляли плотный ватный тампон длиной 2-3 см так, чтобы он почти весь оказался в воде. Сверху помещали фильтровальную бумагу, соответствующую диаметру пробирки. В каждую пробирку вставляли полоску из фильтровальной бумаги и плотно закрывали ватно-марлевой пробкой. В одной пробирке содержали не более 1 кладки яиц (или аналогичного числа личинок), 100 голодных или 25 напитавшихся нимф и не более 15-20 половозрелых клещей. Клещей содержали в холодильнике при +4С для предотвращения их старения и имитации поведенческой диапаузы голодных особей и морфогенетической диапаузы напитавшихся предимагинальных фаз. При проведении экспериментов перед кормлением, во время линьки или откладки яиц пробирки с клещами держали при комнатной температуре (+20-25С).
Кормление клещей проводили по стандартной методике (Методы лабораторного культивирования…, 2004). Для питания самок I. ricinus, I. persulcatus и их потомства, а также неполовозрелых фаз клещей Dermacentor для поддержания лабораторной культуры использовали белых беспородных мышей, на которых надевали картонные воротнички для предотвращения счесывания клещей. На одну мышь сажали не более 1 оплодотворенной самки, 20 нимф или 200 личинок клещей. Перед посадкой неполовозрелых фаз клещей мышь сажали в стеклянную банку и ставили в кювет с водой для предотвращения расползания клещей. Клещей на мышь подсаживали кисточкой, после чего банку с мышью сверху закрывали мельничным газом. Через несколько часов мышь пересаживали в индивидуальную клетку с решетчатым дном и поддоном с водой снизу. Напитавшихся и отпавших через решетчатое дно клетки в поддон с водой клещей, изымали, просушивали на фильтровальной бумаге и помещали в пробирки дифференцированной влажности. Напитавшихся клещей содержали при комнатной температуре до завершения линьки, после чего убирали в холодильник (+4С). Перед посадкой половозрелых клещей рода Ixodes на спине у мыши в области лопаток выстригали шерсть по периметру квадрата 1,5х1,5 см, куда затем приклеивали квадрат из марли такого же размера. После того как клей высыхал (1-2 часа) под марлевую наклейку помещали 1 оплодотворенную самку. После завершения питания самку вынимали из-под наклейки и помещали в пробирку дифференцированной влажности при комнатной температуре для откладки яиц.
Для питания половозрелых клещей рода Dermacentor использовали кроликов. На одного кролика сажали не более 30 особей (20 самок и 10 самцов). Перед посадкой клещей кролику надевали пластмассовый ошейник для предотвращения их счесывания, а на спине в области лопаток выстригали шерсть по периметру квадрата 5х5 см, куда затем приклеивали заранее сшитый колпачок из ткани такого же размера. После того как клей высыхал (1-2 часа) в колпачок помещали клещей. Каждый день колпачок развязывали, наблюдали за процессом их питания и, при необходимости, снимали с кролика
Физиологический возраст (ФВ) определяли у голодных самок иксодовых клещей по методике, разработанной И.В. Разумовой (2001). Самку помещали между двух предметных стёкол, исследовали под бинокуляром и по сочетанию признаков, приведённых в Таблице 2.1, определяли ФВ (Рисунок 2.4).
Определение реакции иксодовых клещей на запахи растений
Сроки жизни голодных клещей в природе определяют возрастной состав их популяций. По многочисленным прямым наблюдениям сложные популяции клещей могут быть образованы особями разных возрастных когорт, а также принадлежащим к двум и более последовательным поколениям (Балашов, 1961; Князева, 1964; Хижинский, 1968; Успенский, Репкина, 1974; Разумова, 1992).
Для взрослых клещей I. persulcatus характерен один весенне-летний пик активности. Активация клещей начинается с момента появления проталин и продолжается 40-60 дней (Хижинский, 1963). На растительность поднимаются особи, ушедшие на зимовку после осенней линьки. Клещи, активизировавшиеся в начале сезона, обладают большей жизнеспособностью, чем особи, активизировавшиеся в июне и позднее. Причем клещи активизируются в различном физиологическом состоянии (Хижинский, 1968). На протяжении активного периода происходит постепенное старение популяции и увеличение доли клещей III и IV физиологического возраста. Так, в Ленинградской области в 1960 гг. в мае популяция клещей состояла из особей II (69%) и III (31%) ФВ, тогда как в июне доля клещей II ФВ снизилась до 27%, и доминировали более истощенные особи III ФВ (Балашов, 1961). По данным Н.И. Князевой (1964), проводившей исследование физиологического возраста клещей I. persulcatus в 1960-1961 гг. в стационарах Кемчуг (Красноярский край) и Кивач (Карелия), степень истощенности клещей в обоих регионах была сходной и в мае соотношение особей II, III и IV ФВ составило 36-47%, 43-49% и 10-15%, соответственно. В первой половине июня наблюдалось истощение клещей и соотношение II, III и IV ФВ составило уже 5-7%, 37-50% и 45-56%, соответственно, а во второй половине июля на фоне общего снижения обилия клещей встречались только истощенные особи. В Красноярском крае (стационар Кемчуг) в мае 1962 г. в темнохвойном лесу среди активизировавшихся в мае клещей присутствовали особи II, III и IV ФВ в примерно одинаковом соотношении (32,5%, 35% и 32,5%, соответственно) (Хижинский, 1968). Со временем у клещей израсходовались пищевые резервы, поэтому в июле популяция состояла лишь из особей III (20%) и IV (80%) ФВ. Согласно результатам исследования, проводившегося в 1968-1969 гг. в северных отрогах Западного Саяна (Успенский и Репкина, 1974) во второй-третье декаде мая популяция клещей I. persulcatus состояла из особей II и III степени истощенности (ФВ переведен из 8 степеней в 4 степени согласно описанному способу – Успенский и Репкина, 1979) с преобладанием последних в пихтарнике, тогда как к середине июня популяция состояла из особей III и IV степеней истощенности с доминированием первых в березняке и вторых – в пихтарнике.
Согласно нашим данным в мае-начале июня в Республиках Карелия и Тыва и в мае в Московской области в 2008 г. в природных популяциях I. persulcatus доминировали особи III ФВ (III позднего) и встречались особи IV ФВ. Клещи II степени истощенности или совсем отсутствовали (Республика Карелия, Московская область) или встречались очень редко (Республика Тыва). В популяциях в 2009 г. из Республик Карелия и Тыва было отмечено увеличение доли клещей III раннего ФВ и II ФВ (в Карелии), что может быть связано с более ранним началом сборов иксодид.
Разное соотношение клещей различного физиологического возраста в одном и том же регионе, но в разные годы наблюдали ученые, изучавшие популяции I. persulcatus на Кемчугском стационаре Красноярского края (Князева, 1964; Хижинский, 1968). Так в мае 1960 1961 гг. основную долю клещевой популяции составляли особи II и III ФВ, а на истощенных клещей IV ФВ приходилось всего 10-15% особей (Князева, 1964). В мае 1962 г. в темнохвойном лесу среди активизировавшихся клещей в примерно равных долях присутствовали особи II, III и IV физиологических возрастов (32,5%, 35% и 32,5%, соответственно) (Хижинский, 1968). Далее в июне и в июле 1960, 1961 и 1962 гг. возрастной состав природных популяций клещей был сходным по данным авторов. Вероятно, такие различия обусловлены гидрометеорологическими условиями разных годов (температура воздуха и почвы, количество осадков, толщина снежного покрова, оттепели и заморозки осенью и весной).
У клещей I. ricinus в отличие от I. persulcatus помимо весенне-летнего пика активности возможен повторный осенний пик. Он может быть обусловлен как повторной активизацией клещей прошлого года, переживших лето, так и активизацией части недавно перелинявших особей (Балашов, 1998). Согласно литературным данным, соотношение между старыми и молодыми клещами в осенний пик активности различается в разных частях ареала. Так, если в майской популяции клещей в Ленинградской (Балашов, 1961) и Московской областях (Разумова, 1992; Наумов, 2005) преобладали особи II (45-60%) и III (34-51%) ФВ, то состав популяции в осенний пик активности был различен в указанных областях. В Ленинградской области после увеличения доли клещей III ФВ, уменьшения доли II ФВ и появления особей IV степени истощенности в июле, в сентябре вновь наблюдался высокий процент особей II (45%) ФВ (Балашов, 1961). В Московской области происходило постепенное расходование клещами пищевых резервов и к концу осеннего пика их активности отмечали доминирование особей III и IV ФВ, а доля клещей II степени истощенности составляла 10-20% (Разумова, 1992; Наумов, 2005). Согласно нашим данным, в исследованных популяциях клещей I. ricinus из Клинского и Дмитровского районов Московской области в мае 2008 г. доминировали особи III (63-79,3%) и IV (37-20,7%) степени истощенности, а особи II ФВ полностью отсутствовали в сборах. Такой сложный состав природных популяций I. ricinus определяется не только разными сроками развития особей одной генерации, но и возможностью переживания взрослых клещей, активизировавшихся весной, второй зимы и повторной активации следующей весной (Балашов, 1998; Наумов, 2005).
По мнению В.А. Лыкова (1967) различия в продолжительности активного периода и в возрастном составе природных популяций клещей I. persulcatus, обитающих в разных биотопах, обусловлены: «…разными сроками активации и неодинаковой интенсивностью расходования запасных питательных веществ у клещей, составляющих эти популяции» (цит. Лыков, 1967, стр 138). В данном исследовании автор изучал с мая по июль 1963 г. возрастной состав и активность популяций клещей Пермской области, обитающих в темнохвойно-липовом лесу и на вырубках 11- и 12-летней давности с вторичным липовым подростом и густым разнотравьем. В связи с различными микроклиматическими условиями в популяции клещей из темнохвойно-липового леса доля особей II ФВ была выше на протяжении всего периода наблюдения по сравнению с популяциями клещей из вырубок. На вырубках иксодиды быстрее расходовали свои запасные питательные вещества, истощались и погибали раньше. Сходную картину описывал П.Г. Хижинский (1968), наблюдая за возрастным составом популяций I. persulcatus в разных биотопах Красноярского края: в мае наибольшая доля самок II ФВ (32,5%) наблюдалась в темнохвойном лесу, тогда как в это же время в осиннике на холме в популяции клещей превалировали особи IV ФВ (70,1%). Таким образом, микроклиматические особенности биотопа популяции клещей является одним из основных факторов, определяющих динамику активности и возрастной состав популяций.