Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди вирусов, передающихся членистоногими арбовирусов) и вызывающих у людей тяжелые инфекционные заболевания ллоть до энцефалитов, немаловажное место занимают альфавирусы. В сотав этого рода входят высокопатогенные для человека вирусы венесу-льекого, западного, восточного энцефаломиелитов лошадей, Чикунгунья, 'осс-Ривер и другие. Большинство патогенных для человека альфавирусов, том числе вирус Синдбис и близкородственный ему вирус карельской ли-орадки, способны вызывать эпидемические вспышки. Имеются данные о иркуляции на территории бывшего СССР вирусов Синдбис, Гета, леса Семики, карельской лихорадки, Кыаылагач (Гайдашвич С. Я. ,1986-, Львов Д. К. : др., 1986). Кроме того, нельзя не считаться с возможностью случаев абораторного заражения вирусами, которые в естественных условиях в ашей стране не встречаются. Поэтому проблема лекарственной терапии льфавирусных инфекций заслуживает серьезного внимания и обусловливает еобходимость поиска антивирусных агентов, на базе которых можно было ы в перспективе создать лекарственные препараты. К сожалению, и в на-тоящее время достижения химиотерапии вирусных инфекций продолжают тставать от потребностей практической медицины: до настоящего времени и один из ингибиторов репродукций альфавирусов, проявивших достаточно ысокую активность в экспериментах in vitro и in vivo, не прошел кли-ических испытаний.
Производные адамантана (амантадин и ремантадин), известные прежде сего как эффективные противогриппозные средства, являются ингибитора-и широкого спектра действия. В частности, ремантадин обладает слабой ротивовирусной активностью в отношении альфавирусов (Cassell S. et 1. , 1984; Helenius A. , Marsh ML , White J. s 1982). В Киевском политех-ическом институте на основе адамантана в ходе направленного синтеза случены новые соединения, исследование которых, выполненное в НЖ ви-усологии, показало несомненную перспективность этой группы химических оединений в качестве избирательных ингибиторов репродукции альфавиру-пв (Исаев С. Д., 1982, 1989; Леонтьева Е А., Сычева И. В., 1982).
использование химиотерапевтичееких средств в клинической практике эставшго врачей перед новой проблемой - развитием лекарственной ре-истентности у вирусов. В лабораторных условиях получены штаммы виру-эв с частичной или полной резистентностью практически ко всем соеди-
- 4 -нениям, обладающим избирательной противовирусной активностью. О: больных вщелены штаммы, устойчивые к действию имеющих практическое значение противовирусных лекарственных средств. Имеется обширная литература о существовании амантадик- и ремантадин-резистентных клинических изолятов вируса гриппа, ацикловир-резистентных штаммов вирусоз герпеса простого и варицелла зостер, AZT -резистентных штаммов вирус; иммунодефицита человека, ганщжловир-резистентньк отаммов цитомегало-вируса человека (Козелеикая К.Е и др. , 1987, 1991; Chow Y.-К. et al., 1993; Field Н. J. , 1989; Stanat S. С., 1991) . Такие штаммы с измененной геномом присутствуют в вирусных популяциях, и это может влиять на успешность проводимых химиотерапевтичесюк мероприятий, особенно в условиях массового применения лекарственных препаратов. Поэтому, прежде чем предложить то или иное соединение для клинического изучения, целесообразно сначала б экспериментальных условиях получить ингибитор-резистентные штаммы, изучить их свойства и условия ингибирования. Сравнительное изучение чувствительных и резистентных штаммов вирусої позволит изучить механизм действия антивирусных агентов. Кроме того, такой подход дает возможность еше на уровне лабораторных исследовали? предложить принципиальную схему рационального применения данного соединения, обеспечивающую не только его максимальную эффективность, не и сводящую к минимуму риск формирования лекарственной резистентности, установить возможности ингибирования таких штаммов в условиях организма.
Возможность формирования штаммов альфавирусов с лекарственной резистентностью практически не исследована, так как в настоящее врем* опубликовано лишь одно сообщение о получении мутанта вируса Синдбис, резистентного к миксфеноловой кислоте (Scheidel L. № et al., 1987). Р началу наших исследований информация о наличии резистентных к адаыан-тановым соедшениям штаммов вируса Синдбис или каких-либо другш представителей адьфавирусов в литературе отсутствовала
Цель и задачи исследования. Исходя из изложенного выше, мы предприняли исследования, цель которых заключалась в селекции и всестороннее анализе соединений ряда адамантана, обладавших наибольшей противовирусной активностью в отношении альфавирусов на моделях вирусов Синдбис (ВС) и венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ).
- 5 -Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Сравнительное изучение цитотокеичности и антивирусной активности ряда производных адамантана.
-
Получение резистентных к наиболее активным соединениям штаммов ВС, изучение возможных путей предупреждения их формирования.
-
Сравнительное исследование свойств штаммов ВС, чувствительных и резистентных к действию производных адамантана.
-
Изучение некоторых аспектов механизма действия производных адамантана на модели ВС.
Положения, выносимые на зашиту.
1.' Эффективность производных адамантана как ингибиторов репродукции ільфавирусов на моделях ВС, а также ВЭЛ in vitro и jv vivo.
Z. Возможность получения и условия формирования штаммов ВС, устой-швых к действию производных адамантана и исследование их свойств.
Научная новизна. Продемонстрировано избирательное ингибирукщэе действие 4 производных адамантана на репликацию альфавирусов; установ-іено, что наибольшей избирательной противовирусной активностью обладает амиды 1-адамантанкарбоновой (ААКК) и 1-адамантануксусной кислот ААУК). Показано, что они не обладают вирулицидным эффектом, но в вна-штельной степени ингибируют образование вирусспецифических полипепти-?ов и РЖ Впервые получены in vitro устойчивые к производным адамантана штаммы ВС, определены их характеристики по сравнению с исходным гувствительным вирусом: установлено увеличение продолжительности латентного периода и, вследствие этого, репродуктивного цикла в целом >езистентного варианта вируса
Практическая ценность работы. Полученные результаты показали перс-іективность исследований ААКК, обладающего максимальной эффективностью ;реди изученных соединений, в качестве антиальфавирусного средства. Іоказана целесообразность еочетанного применения ингибиторов с различил механизмом действия, что, во-первых, обусловливает синергидный эф-ект, во-вторых, затрудняет, а, возможно, и предотвращет формирование ітаммов, устойчивых к действию хнмиогерапевтических препаратов, и, в-ретьих, обеспечивает ингибирование резистентных штаммов, что особенно ашо в клинической практике.
Апробация работы. Основные результаты представлены на всесоюзної шкоде-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990 г.) конференции "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций" (Рига, 1991), конкурсе молодых ученых в НИИ вирусологии им. Д. К Ивановского РАМН в 1993 г.. Диссертация апробирована 23.12 .96 на Ученом Совете НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМЕ
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 222 с. машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 21 таблицей. Работа состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, 6-й глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 268 источников, в том числе 48 отечественных и 220 иностранных. СОБСТВЕННЫЕ ИССВДОВШШ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Культуры клеток. Использовали культуру перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышки Vero, полученную из лаборатории культуры тканей Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Культуру 8К получали путем трипсинизации куриных эмбрионов по общепринятой методике.