Введение к работе
I.I.Актуальность проблемы.Ящур относится к числу особо опасных вирусных заболеваний.продолжавший наносить серьёзный ущерб ,'кивогноЕОДству многих стран.Вакцинопрофилактика болезни ведется с применением препаратов,приготовленных.на основе инактивированного вируса.Перспектива получения высококачественных вакцин нового поколения неразрывном образом связана с- решением проблемы сохранения устойчивости вируса а также изыскания оптимальных я щадящих методов очистки, концентрирования и хранения вируссодержащего сырья.Условия переживания вируса ящура во внешней среде определяются различными по природе количественными' и качественными фактора-пи. У ровням количественных факторов соответствует числовая шкала и порядок уровней имеет определенная смысл.Количественные факторы имеют физико-химическуп природу и представляют собой различные энергетические воздействия на агент: тепловое,электромагнитное,оптическое,ионизирующее и др.К качественным факторам следует отнести различные вещество и технологические процессы (Адлер D.H. и др.,1976).
Рассматривая совокупность условий существования виру-зов ин виво и ян витро,можно заключить,что пзрвостепеннув роло среди зїих факгаров играют температура и рН среды Макаров Б.В.,Бакулов И.В.,197і*).Данные Бахраха (1957) по гер.чоинактивации вируса ящура,представленные в виде двух ірямнх. различного наклона,в различной интерпретации объясняется двумя механизмами реакции без раскрытия их сущности, і также рассматриваются как следствие гетерогенности вир/с-г юй популяции.Литературные сведения по различному'поведении іируса ящура в кислой и щелочной зонах рН чаце всего огра-іичени константацией фактического материала без теорегичес-:ого объяснения феномена разрушения вирусных структур.
В настоянеє время научных, данных о расшифровке механнз-іав инактивации вируса яцура при различных физкко-химиче-
ских воздействиях недостаточно.Отсуствие убедительного объяснения механизмов инактивации не позволяет определить пути сохранения устойчивости вирусных антигенов в составе противоящурных вакцин,а также на этапе культивирования вируса,технологических процессах очистки,концентрирования инактивации,высушивания и др.Одной из причин,объясняющих отсуствие убедительных данных о механизме сохранения структуры и свойств вируса при различных воздействиях является то,что известные модели строения вируса'ящуралУзгамов BJi. ,I970;A?fj;&- ,I972;_-'- Перечисленные выше нерешенные вопросы указывают' на актуальность намеченных исследований,направленных на изучение механизмов.инактивации и стабилизации вируса ящура что является важной задачей при разработке и получении высококачественных вакцин и диагностических препаратов. 1.2.Цель работы.Основной целью настоящей работы является получение данных по морфологии вируса ящура с последующей разработкой.структурно-функциональной модели вируса ящура и на её основе рассмотрение механизмов инактивации вирусных структур при различных внешних воздействиях. 1.3.Основные задачи исследования.В соответствии с поставленной цельо решались следующие задачи: -отработка оптимальных условии получения препаративных количеств препаратов,содержащих преимущественно 1<*б;-частицы вируса яцура.и изучение молекулярно-биологинес-ких особенностей строения вирусных частиц различных типов вируса; -изучение симметрии вирусных частиц и ^определение признаков асимметрии в их строении; -построение структурно-функциональной модели вирио-нов,позволявшей обосновать механизм инактивации вируса ' под влиянием внешних факторов; -изучение некоторых механизмов инактивации вируса І.Ц.Научная новизна.Впервые разработан метод очистки и концентрирования вируса ящура с использованием ультрафильтрации с целы» получения концентратов вируса в обезвоженном состоянии с кратностью концентрирования от I 000 до IOCOQ крат (авторское свидетельство СССР !Ш02?72),что позволило стандартизировать исходные условия опытов при проведении молвкулярно-биологических,вирусологических и иммунобиологических исследований (авторские свидетельства СССР Я4Ш177,!Я565021 .и №1615917;. Показана возможность получения различными способами поляризованных пленок-подложек для изучения строения вирусных частиц и их электрических свойств методом электронной микроскопии (авторские свидетельстіза.СССР.'.Ч^5б9І, М699ЇЗ. и JM8I639). Впервые показано наличие в структуре частиц вируса ящура признака асимметрии в виде дипольной структуры, отражавшей, единство симметрии и 'асиммегрии.Сущвствованиз дипольной электрической структуры обнаружено также у вируса .везикулярной болезни свиней и вируса Везикулярной -экзантемы свиней,что может служить подтв'ерадением-.обрей ~ закономерности строения РНК-содержйцих' вирусов- животных.^ Ддя каждого типа вируса ящура определены условия оптимального замораживания и хранения концентрированных суспензий с целью накопления полуфабрикатов вируса для изготовления противоящурных вакцин.Установлено,что оптимальные условия сохранения вируса ящура определяются выбором буферного раствора и рН суспензии,замораживаемой при температуре минус 10-йОС.Показано,что метод ультрафильтрации в сочетании с криогенным измельчением мембраны с концентратом вируса может широко применяться при получении обезвоженных образцов с остаточной влажностью менее 1% при ^сохранении биологических свойств вируса. . 1.5.Теоретическое значение"работы.На основании проведенных исследований установлено,что устойчивость вируса ящура зависит от сохранения природного базового свойства вирусных частиц - их электрического заряда.Определяющим фактором механизма инактивации вируса ящура является сообщение системе вириона дополнительной энергии,вызывающей изменение энергетического (электрического) состояния вируса,а следовательно и его функции. Разработана и дана обоснование новой структурно-функциональной' модели- строения вируса ящура в виде электрофизической блок-схемы.отражающей локализованное расположение структурных полипептидов белковой оболочки. 1.6.Практическая ценность работы.На основании проведенных исследований/разработан комплексный метод получения из суспензий кативного и инактивированного вируса ящура концентрированных препаратов в обезвоженном порошкообразном состоянии,в составе которых вирус сохраняет свои биологические свойства в течение нескольких лет. Б процессе работы по получению очищенных и концентрированных препа'ратов вируса разработаны и утверждены еле- , дующие методики,которые прошли комиссионные испытания и используются при молекулярно-биологических исследов'аниях -5-и получении биологических препаратов: -"Методика получения очищенного и концентрированного антигена лапинизированного вируса ящура А.,.,"-Утверждена директором института iff.05.86 г. -"Методика получения высокоочищенных суспензий вирусе ящура".Утверддена директором института.01.Об.83 г. -"Методика получения высококонцентрированного вируса ящура".Утверждена директором института 19*01'.88.г. -"Методика препаративного выделения 146$ частиц вируса ящура и их количественная оценка".Утверждена 'директором института 19.01.88 г. По результатам исследований морфологического и молеку-лярно-биологического строения вируса ящура разработана следушцие методики: -"Методика оценки количественного и качественного состояния вируса ящура с помощьо электронной-микроскопии". Утверждена директором института &.12.87 г. -"Методика изоэлектричеокого фокусирования балков вируса ящура'в полиакриламидном геле".Утверадена директором института Э1.01.89 г. Методики внедрены в лабораторную практику института 1.7.Основные положения диссертационной работы,выноси- , , .' 1.7Л.Результаты .определения оптимальных условий очи* стки,концентрирования я.выделения 1465 частиц вируса ящура с переводом последних в обезвоженное поровхооОразное. -6- . состояние". 1.7.2.Результаты электронно-микроскопических исследований строения вируса ящура по выявлении признака асимметрии в структуре вирусных частиц. i.7.J.Результаты электронно.-микроскопического изучения изменений электрофизического состояния вирусных частиц при различных внешних воздействиях. і.7.4.Результаты исследований структурных особенностей вируса,ящура различных типов._ і.ї.Ь.гезультати проверки рН-зависимой устойчивости вируса ящура в составе очищенных суспензий,замороженных при температуре минус Ю+2С. 1.7.6.Результаты обоснования структурно-функциональной модели отроения вируса ящура. 1.7.7.Результаты исследований механизмов инактпзации виру-са ящура под воздействием внешних факторов в процессе культивирования-в суспензии клеток ВНК-21,при образовании пены в 'суспензии,влияние на вирус различных температур, высушивании вирусных препаратов,действии ферментов,специфических антител,химических веществ,электрического и магнитного полей. 1.8.Апробация рзботы.Сюновные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета БНІШ (1980-1990);на симпозиуме специалистов стран-членов СЭВ по проблеме-"Профилактика и эффективная борьба с ящуром,а также создание высокоэффективных противоящурных вакцин"(1981,г.Владимир);1У,У и УІ Всесоюзных ветеринар- ; ных вирусологических конференциях "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии" СІ976,г.Зладимир;г.Казань,І980Г г .-Владимир, 1990) всесоюзной конференции "Разработка, апро-_ бация и государственный контроль ветеринарных препаратов4 -7-(1981, г. Москва); на восьми научных конференциях ВНИЯИ (1974-1966); на Всесоюзной научно-технической конференции "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине* (1990, г. Нижний Новгород); на международной научной конференции 'К новой стратегии борьбы с ящуром" (1991, г. Владимир). 1.8. Публикации результатов нссладаваннй. По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ. Получено 7 авторских свидетельств. 1.10- Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 361 странице машинописного текста, включает введение (6 стр.), обзор литературы (48 стр.), материалы и методы (6 стр.), результаты исследований (194 стр.), обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения (37 стр.). Список использованной литературы включает 233 источника на русском языке и 163 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 37 таблицами и 87 рисунками. В приложении (32 стр.) представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.
ящура под воздействием внешних факторов в процессе куль
тивирования вируса в суспензии клеток БНК-21,при образо
вании пены в суспензии,при замораживании вируссодержашх
суспензий,влиянии на вирус различных температур,высушива
нии вирусных препаратов,действии ферментов,специфических
антител,химических веществ,электрического и магнитного
полей.
и использовались также при получении концентрированных
препаратов вируса ящура в промышленных условиях завода
"ирьёвецветбиопрвпарат".Выполненные разработки вошли в
технологические разделы ТУ на изготовление "Вакцины против
. ящура оиваленгной типа А,0 Сиз вируса,выращенного на клв
тках ВЩ-2І.)",утвержденных департаментом ветеринарии МСХ ';
Российской Федерации (.1993). . ..
мые на защиту: ; _*..'.