Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика болезни Марека 11
1.2. Специфическая профилактика болезни Марека 22
1.3. Технология производства вирусвакцин против болезни Марека 28
1.4. Заключение по литературному обзору 41
2. Собственные исследования 45
2.1. Материалы 45
2.2. Методы исследований 48
2.3. Результаты исследований 52
2.3.1. Повышение эффективности технологических процедур изготовления лиофилизированной вакцины против БМ 52
2.3.1.1. Получение матровой расплодки ВГИ с использованием последовательных пассажей на разных чувствительных системах 52
2.3.1.2. Оптимизация технологии получения внеклеточного ВГИ 55
2.3.1.2.1. Сравнение способов дезагрегации клеточного монослоя, инфицированного ВГИ 55
2.3.1.2.2. Отработка параметров ультразвуковой дезинтеграции вируссодержащих клеток 57
2.3.1.3. Разработка метода контроля стабильности лиофилизированной вакцины против БМ 62
2.3.2. Разработка разбавителя для вирусвакцин против БМ 67
2.3.2.1. Подбор оптимального состава разбавителя 68
2.3.2.2. Физико-химические свойства экспериментального разбавителя 72
2.3.2.3. Изучение динамики изменения инфекционной активности ВГИ в экспериментальном разбавителе 74
2.3.2.4. Влияние температуры разбавителя на инфекционную активность корпускулярного и клеточно-ассоциированного ВГИ 76
2.3.2.5. Исследование безопасности разбавителя 80
2.3.2.6. Установление срока годности разбавителя 82
2.3.2.7. Клинические испытания экспериментального разбавителя
3. Обсуждение результатов исследований 86
4. Выводы 103
5. Практические предложения 105
6. Список сокращений и условных обозначений 106
7. Список литературы
- Специфическая профилактика болезни Марека
- Технология производства вирусвакцин против болезни Марека
- Оптимизация технологии получения внеклеточного ВГИ
- Влияние температуры разбавителя на инфекционную активность корпускулярного и клеточно-ассоциированного ВГИ
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - широко распространенное лимфопролиферативное заболевание кур, возбудителем которого является онкогенный ДНК-содержащий герпесвирус.
В настоящее время БМ распространена повсеместно. Вакцинация против этой болезни проводится во всех странах с развитым птицеводством, поэтому БМ не относится к списку болезней обязательной международной нотификации. Болезнь способна наносить ощутимый экономический ущерб птицеводству в случае невыполнения ряда мероприятий по ее профилактике. Борьба с БМ является комплексной и включает соблюдение мер биобезопасности, выведение генетически устойчивых линий птицы, однако важнейшее место занимает вакцинопрофилактика [1, 3, 7, 9].
Для профилактики БМ применяют жидкие клеточно-ассоциированные
вакцины, где вакцинный вирус находится внутри инфицированных клеток, и
лиофилизированные препараты, содержащие внеклеточный
(корпускулярный) вирус. Основой лиофилизированных препаратов являются штаммы вируса герпеса индеек (ВГИ, или серотип 3). Клеточно-ассоциированные вакцины против БМ хранят в резервуарах с жидким азотом, что требует соблюдения специальных условий при транспортировке, размораживании и подготовке к применению. Лиофилизированные препараты хранят в холодильных камерах при 4С, что определяет их значительные преимущества при использовании и транспортировке на дальние расстояния.
Поскольку для вируса БМ показана возможность персистенции полевых вариантов на вакцинированном поголовье, то имеется высокая вероятность изменения их фенотипа в сторону усиления вирулентности [7, 11]. Бройлеры представляют собой биологический резервуар, в котором может ускоренно протекать процесс эволюции вируса, особенно если в хозяйстве на одной территории содержатся цыплята-бройлеры и взрослая птица. В таких случаях вакцинация бройлеров против БМ является необходимой мерой. Ввиду короткого срока содержания бройлеров и
отсутствия у них, как правило, неопластических изменений внутренних органов, целесообразно и экономически оправдано применение вакцин на основе ВГИ, в том числе в лиофилизированной форме. В связи с этим повышение эффективности определенных технологических этапов изготовления и контроля лиофилизированных вакцин против БМ, а также разработка вспомогательных средств, необходимых для приготовления готовой лекарственной формы вирусвакцин и способствующих сохраняемости вакцинных вирусов во время иммунизации птицы, представляются актуальными в научном и практическом аспекте.
1.2 Степень разработанности проблемы. Для вакцин против БМ, в частности для препаратов на основе ВГИ, в целях сохранения необходимых биологических свойств вакцинного вируса используют приём последовательных пассажей на восприимчивой птице и культуре клеток (5, 6). Однако детального описания указанного метода, позволяющего его воспроизвести и получить ожидаемый эффект, в доступной литературе не представлено.
Важным технологическим этапом является получение корпускулярного ВГИ, а именно дезагрегация монослоя с последующей дезинтеграцией вирусинфицированных клеток. Известно, что для дезагрегации монослоя применяют механический и ферментативный методы, а для дезинтеграции клеток – осмотический шок клеток в дистиллированной воде, метод последовательного замораживания-оттаивания и обработку ультразвуком. Однако количественных характеристик и технологических параметров данных процедур в доступной литературе недостаточно, что предполагает необходимость экспериментальной сравнительной оценки результативности указанных технологических приёмов.
Одним из наиболее важных показателей качества живых вирусвакцин является инфекционная активность. При хранении инфекционные свойства вакцинного вируса снижаются. Пороговое значение данного параметра отражается в технической документации как срок годности препарата. Очевидно, что ускоренные методы оценки изменения активности данного лекарственного средства весьма целесообразны.
Для приготовления готовой лекарственной формы клеточно-ассоциированных и сухих вирусвакцин против БМ существуют разбавители. Во многих случаях разбавители предназначены для определенной формы вакцины. Поэтому изыскание универсальной прописи было бы рациональным с точки зрения технологии их изготовления и применения.
1.3 Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось
повышение эффективности и рационализация определенных
технологических этапов изготовления и контроля лиофилизированной
вакцины, а также разработка разбавителя, пригодного для работы как с
жидкими, так и лиофилизированным вариантами вакцин против БМ. В
рамках поставленных целей были определены следующие задачи:
– разработать методику получения и поддержания матровых расплодок ВБМ путем проведения последовательных пассажей в организме восприимчивой птицы и культуре клеток ФЭК;
– провести сравнительную оценку различных способов дезагрегации вирусинфицированного монослоя клеток;
– отработать параметры ультразвуковой дезинтеграции
вируссодержащих клеток;
– разработать метод контроля стабильности инфекционной активности лиофилизированной вакцины при хранении;
– разработать новый состав разбавителя для сухой и жидких вакцин против болезни Марека, охарактеризовать его основные физико-химические свойства, изучить стабилизирующую способность и безвредность.
1.4 Научная новизна исследований.
1. Проведена сравнительная оценка величин инфекционных титров
ВГИ штамм «Владимир» в суспензиях, полученных ферментативным,
криодеструктивным и биологическим способами дезагрегации клеточного
монослоя.
2. Изучено влияние продолжительности и величины амплитуды
ультразвукового воздействия на инфекционную активность ВГИ при
дезинтеграции клеток и определены оптимальные значения исследуемых
параметров.
3. Разработан способ опосредованной экспресс-оценки изменения
инфекционной активности ВГИ в составе лиофилизированного препарата
при хранении.
4. Разработан новый состав разбавителя для вирусвакцин против БМ,
изучены его физико-химические свойства, а также стабилизирующая
способность и безвредность для птицы.
1.5 Теоретическая и практическая значимость исследования.
1. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором
ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Методические рекомендации по поддержанию штаммов
вируса болезни Марека путём последовательных пассажей в эпителии
перьевых фолликул птицы и культуре клеток».
2. Результаты проведенных исследований послужили основой для
составления нормативных документов: «Промышленного регламента на
производство разбавителя для вирусвакцин против болезни Марека»;
Стандарта ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Разбавитель для вирусвакцин против болезни
Марека. Технические условия» (СТО 00495527-0246-2016); Инструкции по
применению разбавителя для вирусвакцин против болезни Марека.
-
Методология и методы исследований. При выполнении работы были освоены следующие методы: получение и культивирование первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбрионов кур; вирусологические (культивирование и оценка титра, получение корпускулярного вируса с помощью ультразвуковой установки, вакцинация, оценка безвредности и выделение вируса от естественно-восприимчивых птиц); бактериологические (исключение контаминации микрофлорой растворов и реактивов); физико-химические (составление растворов и оценка концентрации водородных ионов); обработка экспериментальных данных (определение статистических характеристик средних значений, корреляционно-регрессионный анализ и подбор лианеризующих функций в системах зависимых переменных).
-
Положения, выносимые на защиту.
Использование последовательных пассажей вируса БМ в организме естественно-восприимчивой птицы и культуре клеток ФЭК для поддержания матровых расплодок.
Сравнительная оценка ферментативного, криодеструктивного и биологического способов дезагрегации клеточного монослоя, инфицированного ВГИ.
Оптимальная продолжительность и величина амплитуды ультразвукового воздействия при дезинтеграции клеток, инфицированных ВГИ.
Экспресс-оценка изменения инфекционной активности
корпускулярного ВГИ при хранении лиофилизированной вирусвакцины.
Новый состав разбавителя для вирусвакцин против БМ, его физико-химические свойства, а также стабилизирующая способность и безвредность для птиц.
-
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. В ходе выполнения отдельных этапов работы практическую и консультативную помощь оказывали к.б.н. Пяткина А.А., к.в.н. Кулаков В.Ю., к.в.н. Константинов А.В., Константинова Е.А., а также сотрудники лаборатории профилактики болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ», за что автор выражает им искреннюю благодарность.
-
Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность экспериментальных данных подтверждена соответствующими статистическими критериями и комиссионными испытаниями. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2011-2015 гг.), ІІІ Международной научно-практической конференции молодых ученых "Достижения молодых ученых в ветеринарную практику" ( г. Владимир, 2012 г.).
-
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В диссертационной работе представлены результаты исследований по оптимизации технологии изготовления и контроля лиофилизированной вакцины против БМ, а также по разработке разбавителя для вирусвакцин против БМ. Результаты научного исследования соответствуют 1, 2, 3 и 10 пунктам паспорта специальности 03.02.02 «Вирусология».
-
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах, содержит введение, обзор литературы, собственные
исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, состоящий из 203 источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 8 рисунками и дополнена приложенной аннотацией документов.
Специфическая профилактика болезни Марека
Аттенуированные штаммы ВБМ (Сu-1, CVI 988) крайне редко индуцируют опухоли или вызывают только нервные изменения у чувствительной птицы и применяются в качестве вакцинных.
Важно отметить, что для ВБМ характерна постепенная эволюция в сторону увеличения вирулентности [60, 128, 196]. В течение многих лет БМ была классическим заболеванием, при котором паралич был основным изменением, вызываемым вирусами патотипа mВБМ. Более вирулентная форма БМ была впервые выявлена в конце 40-х гг. 20 века, она была связана с патотипом vВБМ, который в течение 60-х гг. стал доминирующим. Патотип vvВБМ был впервые обнаружен в конце 70-х гг., преимущественно в стадах, вакцинированных против ВГИ, и нанёс значительный ущерб, что инициировало разработку и внедрение в практику в конце 80-х гг бивалентных вакцин на основе вакцинных штаммов ВБМ 2 и 3 серотипов. В начале 90-х гг. проявили себя vv+ штаммы, которые вместе с vv штаммами стали доминирующими.
Ко 2 серотипу ВБМ (вирус герпеса кур, ВГК) относят неонкогенные или апатогенные штаммы (SB-1, HPRS-24, HN-1). ВГК не вызывают характерных для БМ поражений, но могут вызывать инфекцию воспалительного типа у птиц с ослабленным иммунитетом. Штамм SВ-1 используется в качестве вакцинного, так как защищает цыплят от новообразований при заражении вирулентным ВБМ.
К 3 серотипу ВБМ (вирус герпеса индеек, ВГИ) включает неонкогенные штаммы (HPRS-26, FC-126). Впервые ВГИ был выделен от индеек. На основании проведенных серологических исследований ВГИ считают антигенно родственным вирусу болезни Марека. Поскольку ВГИ не патогенен для кур, но индуцирует в организме выработку антител, перекрестно реагирующих с антигенами ВБМ, его широко используют в качестве компонента для вакцин [80, 161, 189, 195, 202]. Источники и пути передачи заболевания. ВБМ передаётся прямым и непрямым контактом между курами, чаще всего аэрогенным путём. Источником контаминации являются клетки эпителия перьевых фолликулов (ЭПФ), в которых происходит формирование полноценных вирионов. Цыплята чаще всего заражаются при контакте с пылью и слущенным эпителием, находящимися в помещении, или при заносе ВБМ из близлежащих птичников с аэрозолями, контаминированным инвентарем и персоналом. В пыли птичника вирус сохраняет свои инфекционные свойства несколько месяцев при температуре 20-25С и в течение нескольких лет при температуре 4С. Вне зависимости от вакцинального статуса, инфекция быстро распространяется от птицы к птице. Выделение вируса во внешнюю среду начинается примерно через 2 недели после инфицирования, и достигает максимума на 3-5 неделю. Инфицированные цыплята являются пожизненными вирусоносителями. Жуки-чернотелки (Alphitobius diaperinus) могут быть механическими переносчиками вируса. Вертикальной передачи ВБМ не происходит. Передача вируса от наседки цыплятам путем контаминации яичной скорлупы также маловероятна из-за плохой переносимости вирусом условий окружающей среды [5, 19, 24, 128, 138, 139, 140, 149, 173, 188].
Патогенез. В настоящее время принято выделять следующие фазы инфекции in vivo: ранняя продуктивно-рестриктивная (цитолитическая) инфекция, вызывающая преимущественно дегенеративные изменения (2-7 сутки после инфицирования); латентная инфекция (7-10 сутки после инфицирования); поздняя фаза продуктивно-рестриктивной (цитолитической) инфекции, совпадающая с постоянной иммуносупрессией (18 сутки после инфицирования); пролиферативная фаза (28 сутки после инфицирования), в которую вовлечены непродуктивно инфицированные лимфоидные клетки и которая может прогрессировать в формирование лимфом. Это деление несколько условно, поскольку 2-4 фазы могут совместно протекать в различных клетках одного организма. Инфекция некоторыми vv+ штаммами может не следовать такой основной схеме, и гибель может происходить и без начала латентной фазы [75]. Ранняя продуктивно-рестриктивная (цитолитическая) инфекция (фаза 1). Вирус проникает в организм через респираторный тракт, и, по-видимому, попадает в лимфоидные органы, находясь в фагоцитирующих клетках. Внеклеточный вирус достигает лимфоидных органов за 24-36 часов после внутритрахеального инфицирования. Вскоре после этого цитолитическую инфекцию можно обнаружить в селезёнке, бурсе и тимусе. Она достигает своего пика на 3-6 сутки. Было выявлено, что первоначальными клетками-мишенями во всех трёх органах являются В-клетки. Также цитолитической инфекции могут подвергаться активированные, но не находящиеся в состоянии покоя Т-клетки. Вследствие этого развивается атрофия лимфоидных органов, особенно тимуса и бурсы. В зависимости от вирулентности штамма, птицы могут выздоравливать на 8-14 сутки после инфицирования, в противном случае атрофия становится постоянной [123, 139, 141, 150, 153, 154].
Латентная инфекция (фаза 2). Примерно на 6-7 сутки, когда цитолитическая инфекция больше себя не проявляет, а опухоли ещё не появляются, наступает латентная инфекция. Развитие латентности происходит одновременно с развитием иммунных реакций. Взаимодействие между вирусом и клетками во время латентной стадии недостаточно хорошо изучено. Нарушения клеточного иммунитета являются причиной задержки начала латентной стадии. У генетически устойчивых птиц инфекция часто остаётся латентной в лимфоцитах и может длиться в течение всей жизни, за исключением персистентной вялотекущей продуктивной инфекции в ЭПФ. У восприимчивых или устойчивых птиц, инфицированных vv или vv+ штаммами, может развиваться вторая волна цитолитических инфекций после второй или третьей недели с сопутствующей постоянной иммуносупрессией [2, 5, 61, 127, 153].
Технология производства вирусвакцин против болезни Марека
Иммуногенность живой вакцины обусловлена инфекционной активностью вируса, являющего основой препарата. Таким образом, сохранность инфекционного титра вакцинного вируса определяет эффективность вакцинации. Лекарственной формой формой вирусвакцины против БМ (как клеточно-ассоциированной, так и лиофилизированной) является суспензия, приготовленная на разбавителе, который обязательно прилагается к данному лекарственному средству. Разбавитель для вакцин против БМ должен обладать по-крайней мере двумя обязательными качествами. Во-первых, он должен обеспечивать сохранность суспендированного вакцинного вируса до его инъекции птице. Во-вторых, данный препарат не должен быть токсичен или реактогенен для цыплят. Целью данного этапа исследований была разработка разбавителя, способного сохранять (стабилизировать) инфекционность как клеточно-ассоциированного, так и корпускулярного вируса. При этом полученный препарат должен быть безвреден для птицы.
Большинство известных разбавителей являются изотоничными, обладают буферными свойствами и имеют биологически оптимальный водородный показатель (7,0рН7,4).
Изучали сохранность инфекционного титра корпускулярного и клеточно-ассоциированного ВГИ после суспендирования и экспозиции в различных средах. Концентрация инфекционного вируса во всех случаях составляла не менее 3lgФОЕ/0,2 см. План эксперимента предполагал испытания 9 различных прописей, которые готовили из ингредиентов, указанных в научных публикациях или инструкциях по применению коммерческих препаратов. Контролем в опытах с корпускулярным ВГИ являлась дистиллированная вода, а с клеточно-ассоциированным - 2% полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Приготовленные суспензии лиофилизированной вакцины содержали при комнатной температуре (20±2)С в течение 30 мин. Определяли величину инфекционного титра вируса (Т, ФОЕ) через 3 и 30 минут после ресуспендирования препарата. В качестве контрольного показателя приняли значение титра, установленного в дистиллированной воде (Т0). Изменения титра, полученные в испытуемых разбавителях, выражали в относительных показателях контраста: dTjl = lgTjl - lgT0l , где: dTjl - искомая величина контраста титров тестируемого разбавителя (j) на заданном интервале времени; Tjl и T0l - значения инфекционных титров вируса, установленные в разбавителе и контроле для данных условий, соответственно. Были получены выборки значений dTjl, на основании которых вычисляли соответствующие средние оценки и их стандартные ошибки (±m) (n3). Полученные результаты представлены в таблице 5.
Из данных, приведенных в таблице 5 следует, что воздействие тестируемых разбавителей на инфекционную активность вируса было не одинаковым. Некоторые составы (№№: 3, 8, 9) как через 3 так и через 30 мин экспозиции имели отрицательный эффект или статистически были тождественны действию контроля.
В свою очередь другие составы обеспечивали большую сохранность вируса. В аспекте выбора наиболее перспективного варианта разбавителя во внимание принимали только положительные значения lgdT, которые воспроизводились на обоих временных интервалах и были статистически достоверны (p0,05). Принятым условиям отвечали образцы 2, 4, 5 и 7.
Далее изучали сохранность клеточно-ассоциированного ВГИ. Сравнивали стабилизирующие свойства образцов разбавителей (R) № 2, 4, 5, 7. Концентрация инфекционного вируса во всех случаях составляла не менее 3 lgФОЕ/0,2 см. Приготовленные суспензии ВГИ содержали при комнатной температуре (20±2)С в течение 30 мин. Определяли величину инфекционного титра вируса (Т, ФОЕ) сразу после ресуспендирования (T0R) и через 30 минут экспозиции препарата (T30R).
Оценочным показателем считали величину разности логарифмических титров (величину контраста), установленных до и после 30-минутной экспозиции. Расчёт проводили по формуле: dR=lgT30R–lgT0R, где: dR – значение оценки контраста; T30R – инфекционный титр, установленный через заданный интервал времени; T0R – исходная величина инфекционного титра. Результаты экспериментов представлены в таблице 6. - существенность среднего контраста определяли проверкой выполнимости неравенства, имеющего вид ttp, где t=”/m; tp – табличное значение коэффициента Стьюдента, для избранного уровня значимости (p) и данного числа степеней свободы (v=n-1); - жирным шрифтом выделен существенный контраст.
В результате анализа данных таблицы 6 установили, что во всех исследуемых образцах разбавителей происходило снижение инфекционной активности ВГИ. Так, максимальное снижение титра ВГИ (в 1,5 раза) отмечали в разбавителях № 2 и № 5, минимальное (в 1,12 раза) - в разбавителе № 4. Анализ результатов показал, что полученные средние оценки для экспериментальных разбавителей № 2, 5, 7 были статистически значимы (p0,05), а существенных различий между величиной инфекционного титра ВГИ, суспендированного в разбавителе №4, до и после экспозиции выявлено не было (р 0,05).
Таким образом, разбавитель №4, который обеспечил наибольшую сохранность вакцинного вируса, был выбран для проведения дальнейших испытаний. Задачей следующего этапа исследований было сравнение экспериментального разбавителя с коммерческим разбавителем производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», изготовленного на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) и используемого в настоящее время для жидких вирусвакцин против болезни Марека. С этой целью определяли существенность различий между величинами контраста (dR=lgT30R–lgT0R) инфекционного титра вируссодержащей суспензии в разбавителе № 4, установленных до и после 30-минутной экспозиции, относительно контроля - разбавителя на основе ПЭГ. Полученные данные приведены в таблице 7. Из результатов, представленных в таблице 7, следует, что экспериментальный разбавитель обеспечивает сохранность вируса лучше, чем разбавитель на основе ПЭГ (р0,05) в течение 30-минутной экспозиции. Таким образом, в результате экспериментальных работ по подбору оптимального состава разбавителя для вирусвакцин против БМ был выбран разбавитель, представляющий собой изотонический раствор, содержащий в своем составе неорганическую буферную композицию, углеводный компонент, продукты гидролиза белка и индикатор. Вероятно, что перечисленные компоненты создают среду, благоприятную для сохранения инфекционной активности корпускулярного и клеточно-ассоциированного ВГИ при нахождении его в суспензии.
Оптимизация технологии получения внеклеточного ВГИ
На этом основании целью настоящего этапа исследований являлась разработка экспресс-метода оценки, позволяющего прогнозировать сохраняемость инфекционной активности ВГИ в течение продолжительного времени. В этой связи представлялось целесообразным установить зависимость величины константы от температуры и вычислить соответствующий коэффициент пропорциональности, который предоставит возможность прогнозировать значение константы для пермиссивных условий и рассчитать ожидаемую величину инактивации вируса через значительный временной интервал (например, 360 суток и более).
Изучали динамику изменения инфекционной активности ВГИ в составе лиофилизированного препарата с известной инфекционной активностью (lgТо) в условиях воздействия различных температур. С этой целью через заданные интервалы времени оценивали величину изменения титра (dТj=lgTj-lgT0, где lgTj -оценка инфекционной активности ВГИ через заданный интервал времени (j)).
Установили, что для всех изученных температур динамика снижения оценок dТ была нелинейна и отображалась на графике в виде несимметричной кривой (рис.5). При этом повышение температуры экспозиции ускорял процесс инактивации вируса.
Регрессионный анализ показал, что наиболее адекватной моделью связи в системе «dТ - Cут» является уравнение "ki=0,049-0,035(ti), где "ki - ожидаемая оценка константы инактивации вируса при заданной температуре ti. Поскольку оценка ординаты регрессии, а при Сут=0 не может иметь биологического смысла, то показателем эффекта воздействия различных температур считали значение регрессионного коэффициента (k).
Следует сделать уточнение, что в связи с высокой степенью вариации показателей единичных измерений dT при вычислении значения k использовали непараметрический метод множественных угловых наклонов Тейла [51]. Данный метод не зависит от типа распределения первичных показателей и не чувствителен к значительным отклонениям от средней оценки по ординате. Результирующий показатель вычисляется как медиана из ранжированного ряда констант, установленных для всех пар экспериментальных точек в неповторяющихся комбинациях. Таким образом, для каждой изученной температуры (ti) была установлена константа инактивации вируса (ki,,lgФОЕ/lgСут). Соответственно изученным температурам (t,С) были получены оценки медиан kt и границы их доверительных интервалов k4=0,139{0,070,224}; k20=0,767{0,6980,825}; k30=0,853{0,7460,950}; k35=1,166{1,0611,252}; k40=1,50{1,4281,576}; k45=1,478{1,3411,593}. Изучение связи между температурой экспозиции и оценкой инактивации вируса показало, что зависимость между параметрами k и t была близка линейной (рис. 4) и характеризовалось высоким коэффициентом корреляции (r=0,984, p0,001). Соответствующая регрессионная модель имела небольшое по величине значение ординаты регрессии. Это в свою очередь предполагало, что в диапазоне изученных температур соотношение между значениями констант может быть описано простым коэффициентом пропорциональности. Другими словами величина константы, установленная при более высокой температуре, должна превосходить предыдущую в определенное число раз. Здесь следует ещё раз подчеркнуть, что все экспериментально полученные количественные показатели справедливы только в диапазоне изученных положительных температур. Линейная экстраполяция в область отрицательных температур может быть некорректна в связи с тем, что лиофилизированный препарат содержит определённый процент остаточной влаги, которая при значениях t 0C может изменить агрегатное состояние, что в свою очередь неопределённым образом может повлиять на биологические свойства вируса. Для прогнозирования состояния биопрепарата, где основную функцию выполняют белковые структуры, использование данных, полученных при температурах свыше 40С, также некорректно, поскольку при значениях t 40C могут происходить необратимые процессы денатурации белков. Косвенным свидетельством этого явления может служить тенденция к образованию "плато", выраженная в том, что показатели k40 и k45 были практически идентичны.
Принимая во внимание все рассмотренные аргументы, приняли, что наиболее удобной для экспресс-оценки стабильности инфекционных свойств вакцины из ВГИ следует считать экспозицию при температуре 37С. При этом учитывали, что в большинстве литературных источников, где рассматриваются методы ускоренной оценки биологической функции лекарственных средств, используется экспозиция при указанной температуре [19, 40, 106, 178].
Принцип предлагаемого методического подхода состоял в определении коэффициента пропорциональности констант инактивации вируса при при двух температурах t: 4 и 37 (С). Ранее полученные оценки констант k4 и k37 показали, что коэффициент пропорциональности данных величин составил значение K=(-1,236/-0,139)=8,89. В биологическом смысле это означало, что скорость инактивации вакцинного ВГИ штамма «Владимир» при 37С в 8,89 раза превосходит инактивацию, наблюдаемую при 4С. При этом важно подчеркнуть, что статистически достоверное определение величины k4 потребует более 8 недель, тогда как k37 с достаточной достоверностью может быть определена через 2 недели.
С целью проверки предлагаемого методического подхода провели ряд опытов по определению коэффициента пропорциональности K=k37/k4. Полученный эмпирически коэффициент составил величину К=9,057±0,993p0,05. Ранее установленное в результате регрессионного анализа значение константы (K=8,89) оказалась в границах приведенного доверительного интервала, что подтверждало возможность практического применения данного методического подхода.
Влияние температуры разбавителя на инфекционную активность корпускулярного и клеточно-ассоциированного ВГИ
Приняли, что в производственных условиях наибольшее время возможной экспозиции препарата, суспендированного в стандартном объеме разбавителя (200 см, т.е. 1000 доз) составит около 1 часа (продолжительность процедуры прививки 1000 голов цыплят). Используя фактическую величину потери инфекционного титра за указанный период (d60=-0,17lg), и значение регрессионного коэффициента, определили, что соответствующее прогнозируемое время составит оценку "t = (-0,17)/(-0,0023) 70 мин. Инструкции по использованию коммерческих разбавителей для вирусвакцин против БМ указывают на сохранение инфекционной активности вируса в течение от 1 до 2 часов (разбавители производства «Merial», «ABIC Biological Laboratories Ltd», «Intervet International B.V.», «Zoetis Inc.»). Однако экспериментальных обоснований этим величинам в доступной литературе не встречалось.
Влияние температуры разбавителя на инфекционную активность корпускулярного и клеточно-ассоциированного ВГИ. Предыдущие исследования по изменению инфекционной активности вируса, суспендированного в экспериментальном разбавителе, проводили при комнатной температуре (20±2С). Данный этап работы был посвящен оценке влияния температуры на сохранность вакцинного вируса. Динамику изменения инфекционных титров оценивали при температурах 4, 22, 37 (С). Были построены соответствующие регрессионные модели, которые имели высокие коэффициенты адекватности и позволяли с удовлетворительной точностью прогнозировать величину потери титра вируса. При этом регрессионные коэффициенты показывали скорость, с которой происходила инактивация вируса. Установили, что коэффициенты корпускулярно и клеточно-ассоциированного препарата были близкими. Однако, корпускулярный вирус, вероятно, оказался более чувствительным к температуре, превышающей комнатную. В итоге, полученные результаты позволили считать, что предлагаемая рецептура разбавителя позволяет сохранить необходимый уровень инфекционной активности вируса при комнатной температуре в течение 1 часа. Результаты опубликованных научных исследований, посвященных проблеме сохраняемости ВБМ в готовой лекарственной форме [112, 178], указывают, что отмеченные условия является допустимыми для данного вируса и наиболее удобными в практическом аспекте.
Исследование безопасности разбавителя. Любое лекарственное средство, кроме своей основной фармакологической функции, должно гарантировать безопасность, т.е. не оказывать отрицательного влияния на гомеостаз организма-реципиента. В качестве наиболее вероятных побочных эффектов после введения разбавителя были приняты возможность воспалительных реакций в области инъекции и общетоксический эффект. В целях более осторожного прогноза проявления побочного действия препарата также были испытаны образцы, содержащие различные концентрации компонентов, и многократное введение разбавителя со стандартной концентрацией компонентов.
Все образцы были введены цыплятам внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра в объеме 0,2 см. В течение 10 суток учитывали сохранность и признаки, которые могли быть связаны с токсическим действием (состояние перьевого покрова, потребление корма и воды и т.д.). По завершении эксперимента после эвтаназии птиц исследовали состояние тканей в месте введения.
Проведённые эксперименты позволили исключить общетоксическое и местнораздражающее действие при введении как стандартного состава препарата, так и в диапазоне заведомо превышающих концентраций ингредиентов, а также при многократном введении разбавителя. Проведенные эксперименты были построены в соответствии со стандартным подходом к исследованию местораздражающего или/и токсического действия лекарственного средства путем испытания его различных концентраций на чувствительных объектах [38].
Установление срока годности разбавителя. Согласно современным требованиям к производству любое лекарственное средство должно пройти испытания по стабильности своих свойств, отвечающих за его фармакологическое действие при хранении. На этом основании устанавливают срок годности препарата.
С этой целью у образцов разбавителя, отобранных из трёх независимо изготовленных серий, хранящихся при температуре (20±2)С в течение 36 месяцев, исследовали следующие показатели: цвет, прозрачность, рН-показатель и стабилизирующую способность. Результаты эксперимента позволили сделать ряд заключений. 1. В течение всего срока испытаний каких-либо видимых изменений внешних признаков у разбавителя отмечено не было. 2. Оценки рН-показателя у изученных образцов не выходили за рамки принятого диапазона 7,0 - 7,4. 3. Значимые снижения способности разбавителя сохранять необходимый уровень инфекционной активности вакцинного вируса было зарегистрировано на 30 месяце хранения. Учитывая статистику оценок стабилизирующего действия препарата (dj), а также ориентируясь на более осторожный прогноз, приняли, что допустимое время хранения разбавителя не должно превышать 24 месяцев. Следует отметить, что многие известные коммерческие препараты, предназначенные для разведения вакцин против БМ, имеют аналогичные сроки хранения (разбавитель Нобилис Дилуент СА, производство «Intervet International B.V.», Нидерланды; разбавитель для вакцины Пулвак Марек CVI+HVT, производство «Zoetis Inc.», США). Клинические испытания экспериментального разбавителя. Производственные испытания предлагаемого разбавителя проводили как с жидкими, так и лиофилизированным вариантами вирусвакцин. Установили, что предлагаемый вариант разбавителя для получения готовой лекарственной формы вирусвакцин против БМ производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» является безвредным препаратом, поскольку поствакцинальных осложнений не отмечалось. Показатели сохранности привитого поголовья соответствовали принятым нормативным характеристикам.