Содержание к диссертации
Введение
1 Основные факторы терминации трансляции 11
1.1 Общая схема терминации трансляции 11
1.2 Фактор терминации eRF1 12
1.3 Фактор терминации eRF3 14
1.4 Комплекс eRF1-eRF3 15
1.5 Факторы терминации в рибосоме 16
2 Дополнительные факторы терминации трансляции 22
2.1 ABCE1 22
2.2 PABP 22
2.3 eIF5A 24
2.4 Деацилированная тРНК 26
2.5 Dbp5 28
2.5.1 DEAD-box семейство хеликаз 28
2.5.2 Функция Dbp5 в транскрипции 32
2.5.3 Dbp5 как фактор экспорта мРНК 32
2.5.4 Роль Dbp5 в терминации трансляции дрожжей 35
2.6 GLE1 36
2.6.1 Структура Gle1 36
2.6.2 Gle1 в экспорте мРНК 39
2.6.3 Взаимодействие Dbp5 и Gle1 40
2.6.4 Функция Gle1 в трансляции дрожжей 44
2.6.5 Роль hGle1 в образовании стресс-гранул 46
2.6.6 Олигомеризация Gle1 48
2.6.7 Болезни, ассоциированные с Gle1 49
Материалы и методы 52
1 Материалы 52
1.1 Клетки, штаммы бактерий и плазмиды 52
1.2 Используемые среды 52
1.3 Используемые буферы и реактивы 52
1.4 Используемые антитела 53
1.5 Используемые ферменты 54
1.6 Используемые олигонуклеотиды 54
2 Методы 56
2.1 Полимеразная цепная реакция 56
2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле 56
2.3 Очистка фрагментов ДНК из агарозы 56
2.4 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 56
2.5 Лигирование ДНК 57
2.6 Трансформация E. coli плазмидной ДНК 57
2.7 Анализ клонов методом ПЦР-скрининга 58
2.8 Выделение плазмидной ДНК из E. coli 58
2.9 Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК 58
2.10 Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ 58
2.11 Вестерн-блот анализ 59
2.12 Выделение и очистка белков 59
2.12.1 Выделение и очистка компонентов реконструированной системы трансляции 59
2.12.2 Экспрессия и выделение DDX19 и его мутантов 59
2.12.3 Экспрессия и выделение Gle1 и eRF3a. 60
2.13 Получение мРНК in vitro 60
2.14 Сборка преТК 60
2.15 Toe-print анализ 61
2.16 Анализ гидролиза пептидил-тРНК 61
2.17 GTPазный тест 62
2.18 Pull down анализ 62
2.19 Связывание факторов с преТК 62
2.20 ATPазный тест 63
2.21 Статистическая обработка данных 63
Результаты и обсуждение 64
1 Участие DDX19 человека в терминации трансляции 64
1.1 Описание транскрипционных вариантов генов DDX19A и DDX19B 64
1.2 Белок DDX19 человека связан с полисомами 72
1.3 AMPPNP стимулирует связывание DDX19 с преТК 74
1.4 DDX19 стимулирует образование ТК 77
1.5 DDX19 увеличивает эффективность гидролиза пептидил-тРНК при терминации трансляции 81
1.6 DDX19 активирует терминацию трансляции во время распознавания стоп кодона 82
1.7 Мутантные формы DDX19 активируют терминацию трансляции 84
1.8 DDX19 стимулирует активность факторов элонгации трансляции в рибосоме 85
1.9 Модель функционирования DDX19 в трансляции 89
2 Участие GLE1 в терминации трансляции 90
2.1 Белок Gle1 человека связывается с полисомами 91
2.2 Получение изоформ Gle1 92
2.3 Разные изоформы hGle1 по-разному влияют на гидролиз пептидил-тРНК 93
2.4 Изоформы Gle1A и Gle1B по-разному связываются с рибосомными комплексами 94
2.5 Изоформы Gle1A и Gle1B по-разному влияют на формирование терминационных комплексов 97
2.6 Влияние мутаций С-конца Gle1 на активность в терминации трансляции 99
2.7 Gle1A и Gle1B не влияют на GTPазную активность eRF3 101
2.8 Разный уровень экспрессии мРНК Gle1B и Gle1A в клетках линии HEK293 NT 102
2.9 Уровень экспрессии мРНК Gle1A клетках линии HEK293 NT изменяется во время стресса 103
2.10 Модель функционирования Gle1 в терминации трансляции 105
3 Влияние коротких uORFs на эффективность трансляции у эукариот 106
3.1 uORFs 5 -НТО ингибируют трансляцию в лизате PKM мРНК. Влияние DDX19 и Gle1 на трансляцию uORFs 5 -НТО мРНК PKM 107
Заключение 110
Выводы 111
Благодарности 112
Список литературы 113
- Факторы терминации в рибосоме
- Описание транскрипционных вариантов генов DDX19A и DDX19B
- Модель функционирования DDX19 в трансляции
- uORFs 5 -НТО ингибируют трансляцию в лизате PKM мРНК. Влияние DDX19 и Gle1 на трансляцию uORFs 5 -НТО мРНК PKM
Факторы терминации в рибосоме
После описания кристаллических структур факторов терминации по отдельности и их комплекса, назрела задача описать структуру комплекса факторов терминации с рибосомой, которая была успешно решена в последние годы.
Одной из первых опубликованных работ является структура eRF1-eRF3с-GMPPNP, связанных с очищенными в сахарозном градиенте преТК [9]. Свободные преТК имели разрешение 17 , представляли из себя рибосому в незакрученной конформации с тРНК в P сайте, но со свободными А и Е сайтом. 80S-eRF1-eRF3c-GMPPNP преТК в незакрученной конформации, соответствующий стадии связывания факторов терминации с рибосомой перед гидролизом GTP был получен с разрешением 18 [9]. Немного позже был получен преТК 80S-eRF1-RF3c-GDPNP с разрешением 9,7 , также соответствующий стадии распознавания стоп кодона перед гидролизом GTP и комплекс дрожжевых факторов терминации eRF1-eRF3:GDPNP с рибосомой [7,11]. Позиция и конформация связанных с рибосомой eRF1/eRF3c напоминает структуру связанных аа-тРНК/EFu [7,9,11] (Рис. 5).
N домен eRF1 формирует обширные контакты с 40S субъединицей рибосомы через шпильки h18, h30, h31, h34 и h44 18S рРНК и рибосомные белки rpS30e и rpS31e, ядро С домена и минидомен С домена формируют «мост» между Р стержнем и клювом 40S субъединицы. eRF1 взаимодействует с доменом 3 фактора терминации eRF3 через свой C домен, а М домен eRF1 находится между G доменом eRF3 и 60S. eRF3 связан с универсальным GTPaз-связывающим центром рибосомы между SRL петлей 60S и шпильками h5 и h14 18S рРНК 40S [7,9]. Связывание терминационных факторов индуцирует конформационные изменения и в 40S, и в 60S субъединицах рибосомы [7,9]. Движение шпильки h16 18S рРНК приводит к тому, что голова 40S приближается к телу 40S и происходит сужение канала входа мРНК [9]. L1стержень около Е сайта остается в открытой конформации [7]; а rpL12, H43 и H44, образующие основу Р стебля 60S субъединицы, смещаются от 40S субъединицы, для обеспечения связывания eRF1-eRF3, в частности С домена eRF1.
В 2015 году двумя группами исследователей были опубликованы структуры ТК с очень высоким разрешением, полученные с помощью криоэлектронной микроскопии [5,6].
Группа V. Ramakrishnan получила комплекс с разрешением 3,5-3,5 , в котором еRF1 млекопитающих взаимодействует со всеми тремя стоп кодонами в А сайте рибосомы. Согласно полученной структуре, связывание еRF1 позиционирует нуклеотид А1825 18S pPHK таким образом, что он вступает в стэкинг взаимодействие со вторым и третьим основанием стоп кодона. Эта конфигурация затягивает четвертое основание мРНК в А сайт, где оно стабилизируется путем укладки на нуклеотид G626 18S pPHK [6]. Получается, что мРНК в А сайте находится в уплотненном состоянии. В этой уплотненной конформации стоп кодоны мРНК используют водородные связи для взаимодействия с рРНК и важными для распознавания аминокислотными остатками еRF1 [6] (Рис.6).
Общий вид eRF1AAQ в рибосоме млекопитающих, содержащей стоп кодон UAG, показывающая рибосомные субъединицы 40S и 60S, тРНК в Е сайте (желтая) и Р сайте (зеленая), eRF1AAQ в А сайте (фиолетовый) и ABCE1, занимающий GTPазный центр (синий). Крупным планом показан eRF1AAQ с доменами и мотивами GGQ, NIKS и YxCxxxF, тРНК в Р сайте (зеленая), новосинтезированный полипетид, мРНК, содержащая стоп кодон (серая) и ABCE1 с железо-серным кластером (оранжевый/желтый) в нуклеотид-связанном состоянии по [6].
Метод, использованный в лаборатории V. Ramakrishnan для получения структур ТК, состоит в следующем: они заменили мотив GGQ еRF1 на AAQ [27], и добавили этот мутант еRF1 к in vitro трансляции в лизате ретикулоцитов кролика (RRL). Несколько раундов трехмерной классификации in silico показали, что примерно 10% полученных комплексов содержали еRF1AAQ-ABCE1. ТК были получены на всех трех стоп кодонах [6]. Ассоциация ABCE1 была увеличена в комплексах с еRF1AAQ, что подтвердило данные о том, что для функционирования после терминации ABCE1 нуждается в гидролизе пептидил-тРНК [15]. Во всех комплексах еRF1 находился в «открытой» конформации [11], а ABCE1 оккупировал GTPазный центр.
В группе R. Beckmann сделали крио-ЕМ структуру 80S рибосомы человека с еRF1 на матрице hCMV [5]. Была проведена in vitro трансляция в лизате клеток HeLa S3. hCMV «замораживающий» пептид нарушает ПТЦ таким образом, что еRF1 не может индуцировать гидролиз полипептида [46]. При использовании стоп кодона UAA(A) они разрешили U-петлевую конформацию стоп кодона в кармане, образованном еRF1 и рибосомой, раскрывающую важный вклад геометрии мРНК в механизм распознавания стоп кодонов [5]. После in silico классификации данных они получили более 30000 частиц с разрешением 3.8 . N домен еRF1 проникает в декодирующий центр малой субъединицы и в этом центре остается «узкий карман», в котором должны разместиться все 3 нуклеотида стоп кодона и еще четвертый нуклеотид, следующий сразу за стоп кодоном. Примечательно, что по сравнению с конфигурацией нуклеотидов, которая наблюдается для смысловых кодонов и бактериальных стоп кодонов, конформация стоп кодонов у эукариот резко отличается. А именно, она напоминает геометрию классического «Uurn» мотива РНК [47]. Формирование «Uurn» приводит к укорочению мРНК в 3 области, что хорошо коррелирует с наблюдаемыми ранее изменениями положения рибосомных комплексов при связывании еRF1 в toe-print анализе [1]. Наблюдаемая геометрия стоп кодона стабилизируется водородными связями в «Uurn». Эта геометрия очень похожа на другие «Uurn» этого типа, найденные в антикодоновой шпильке тРНК или в 23S рРНК. У бактерий третье основание стоп кодона стабилизируется путем стекингового взаимодействия с Ec G530. В случае стоп кодона эукариот Hs G626 (Ec G530) вступает в стекинговое взаимодействие с +4 основанием стоп-кодона, позволяя формироваться «Uurn» между +1 и +3 основаниями. Более того, эукариотический стоп-кодон вступает в стекинговое взаимодействие с «вывернутым» основанием Hs A1825, в то время как основание A1824 продолжает входить в состав спирали h44 малой субъединицы рибосомы [5]. Уплотнение мРНК в А сайте, похоже, приводит к тому, что нисходящие нуклеотидные остатки втягиваются в канал для мРНК. Это согласуется с образованием двухнуклеотидного сдвига на toe-print анализе при связывании фактора терминации еRF1 с рибосомой [48,49] (Рис. 7).
Что касается положения eRF1 в рибосоме, все три домена еRF1 перемещаются друг относительно друга в соответствии с опубликованной ранее кристаллической структурой [20]. N и М домены еRF1 независимо друг от друга взаимодействуют с тРНК в P сайте рибосомы и вместе напоминают структуру тРНК в А сайте [6]. Спираль 2 N домена еRF1 расположена параллельно антикодоновой шпильке тРНК P сайта и взаимодействует с ней. М домен еRF1 функционально аналогичен акцепторной шпильке тРНК [20] и позиционирует GGQ мотив в пептидилтрансферазном центре.
А1825, который выворачивается из спирали 44 (h44), а основание +4 с G626 18S рРНК (обозначена желтым). (В) У бактерий RF1(серый) распознает более расширенную конформацию стоп кодона, у которого основание +3 входит в стекинговое взаимодействие с G530 (эквивалент G626) 16S рРНК по [6].
Консервативные мотивы NIKS, YxCxxxF и GTS еRF1 окружают нуклеотидные основания стоп кодона в рибосоме [50,51]. В полученной структуре последовательность аминокислот NIKS (основания 61-64) [23], находящаяся в конце спирали 2, взаимодействует с U в +1 положении стоп-кодона. Asn61 и Lys63 формируют водородные связи с карбонильными группами урацила. Известно, что гидроксилирование Lys63 (в позиции С) уменьшает сквозное прочтение стоп кодонов и увеличивает эффективность терминации трансляции in vivo [52]. Наличие гидроксильной группы допускает дополнительное взаимодействие с сахарофосфатным остовом мРНК и помогает позиционировать -аминогруппу для оптимального формирования водородной связи [6]. Пурины в +1 положении стоп кодона невозможны из-за стерических помех, связанных с еRF1, а цитидин не совместим с требованиями NIKS мотива к образованию водородных связей. Таким образом наличие только уридина в +1 положении стоп кодонов определяется обширным образованием водородных связей с еRF1 [6].
Описание транскрипционных вариантов генов DDX19A и DDX19B
В геноме человека было идентифицировано два гена, кодирующих белок DDX19 (DDX19A и В). Они расположены рядом на хромосоме 16. DDX19B является гомологом хорошо изученного дрожжевого белка Dbp5, а DDX19A аннотирован как DDX19-like белок. По данным базы данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) оба белка DDX19 представлены 5 изоформами. По данным ресурса Ensembl (http://www.ensembl.org) ген DDX19B представлен 16 транскриптами (8 из которых кодируют белковую последовательность, 5 подвергаются NMD и 3 не кодируют белковой последовательности), а ген DDX19A представлен 15 транскриптами (3 из которых кодируют белковую последовательность, 5 подвергаются NMD и 7 не кодируют белковой последовательности).
Данные о вариантах транскрипции по классификации NCBI для DDX19A и DDX19B представлены в таблице 1. Транскрипционный вариант DDX19B_TV1 кодирует самую длинную изоформу 1; DDX19B_TV1 экспрессируется во всех тканях (по данным https://gtexportal.org). Другие транскрипционные варианты имеют особенности экспрессии. DDX19B_TV2, DDX19B_TV3 и DDX19B_TV7 экспрессируются во всех тканях, кроме семенников. DDX19B_TV4 и DDX19B_TV6 экспрессируются только в семенниках. Транскрипционный вариант DDX19A_TV1 кодирует самую длинную изоформу 1; DDX19A_TV1 экспрессируется во всех тканях (по данным https://gtexportal.org). Уровень экспрессии остальных транскрипционных вариантов DDX19A очень низкий, по сравнению с DDX19A_TV1 (Таблица 2). Так как во всех тканях экспрессируются только DDX19B_TV1 и DDX19A_TV1, и они же кодируют самые длинные белковые последовательности, в данной работе мы решили сосредоточиться только на них. Таким образом, в данной работе DDX19A – белок, синтезированный с кодирующей последовательности мРНК DDX19A_TV1, а DDX19B – белок, синтезированный с кодирующей последовательности мРНК DDX19B_TV1.
DDX19 человека – это белок с молекулярной массой 54 кДа, состоящий из N-концевой части (с 1 по 91 аминокислоту), которая обладает авторегуляторной активностью [83], двух RecA подобных доменов и короткой С-концевой части. DDX19A состоит из 478 аминокислот, а DDX19B из 479 аминокислот. Аминокислотная последовательность этих белков идентична на 96%; эти белки отличаются друг от друга всего 17 аминокислотами, расположенными на N-конце между аминокислотами 17 и 44. Последовательность нуклеотидов в этой области вариабельна у DEAD-box хеликаз, и поэтому, вероятно, не имеет существенного значения для их активности. Аминокислотная идентичность DDX19 и Dbp5 составляет всего 46% [77].
Известно, что дрожжевой аналог DDX19, белок Dbp5, связан с фракцией полисом [81]. Чтобы выяснить, является ли эта функция консервативной у высших эукариот, мы проверили ассоциирован ли DDX19 человека с полисомами из лизата клеток HEK293Т. Вестерн-блот анализ фракций сахарозного градиента показал, что значительное количество DDX19 находится во фракциях, содержащих полисомы (Рис. 18). В этих же полисомных фракциях обнаруживается фактор терминации еRF1. Таким образом, мы продемонстрировали, что DDX19 человека также ассоциирован с полисомами во время трансляции в клетках HEK293Т. То есть DDX19 человека может участвовать в биосинтезе белка, либо в его регуляции.
Рис. 18. DDX19 человека ассоциирован с полисомами во время трансляции. Супернатант лизата клеток HEK293T был нанесен на сахарозный градиент 10-60%. После центрифугирования градиент разделили на фракции и содержимое фракций анализировали вестерн-блотом. Для обнаружения рибосом были использованы антитела против рибосомных белков L9 (L9) и S15 (S15). Абсорбция при 260 нм (ОD) показывает распределение полисом в сахарозном градиенте. DDX19 и еRF1 детектировались с помощью специфических антител (DDX19A, DDX19B и еRF1).
Аминокислотная последовательности белков DDX19A и DDX19B идентична на 96%. При вестерн-блот анализе антитела против DDX19A (DDX19A) детектируют оба белка А и B, и антитела против DDX19B ( DDX19B) также детектируют оба белка (данные не показаны). Таким образом, мы не могли однозначно определить, какой именно белок А или В обнаружен нами в полисомах. Поэтому, мы заклонировали оба варианта hDDX19 (DDX19A и DDX19B), очистили их из клеток E. coli и определили их ATPазную активность (Рис. 19). ATPазная активность обоих вариантов была одинакова, поэтому в дальнейших исследованиях мы сосредоточились на изучении наиболее распространенного в клетках белка DDX19B, хотя во многих критических тестах также проверяли активность белка DDX19A.
Факт ассоциации белка DDX19 с полисомами подразумевает возможное его участие в трансляции. Для верификации этой гипотезы, мы попытались определить его влияние на разные стадии трансляции в реконструированной in vitro системе трансляции млекопитающих. На мРНК, содержащей кодирующую последовательность MVHL-UAA, из индивидуальных компонентов были собраны рибосомные комплексы (инициаторные, элонгационные и терминационные) и к ним добавлялся белок DDX19B. Влияние белка DDX19B определяли методом флуоресцентного toe-print, который позволяет детектировать количество и позицию рибосомных комплексов на мРНК. Однако, никакой разницы в эффективности сборки рибосомных комплексов in vitro в зависимости от наличия DDX19B нами обнаружено не было (Рис. 20). Мы предположили, что отсутствие видимого влияния DDX19 на сборку трансляционных комплексов связано с большим избытком в реакционной смеси других факторов трансляции, маскирующих эффект действия DDX19B.
Модель функционирования DDX19 в трансляции
В исследовании на дрожжах Saccharomyces cerevisiae было показано, что оверэкспрессия большинства факторов трансляции не влияет на скорость синтеза белков и рост клеток [151]. Исключением является фактор треминации eRF1, увеличение концентрации которого в 2 раза ведет к усилению белкового синтеза и роста клеток. Снижение же внутриклеточной концентрации eRF1 резко уменьшает скорость синтеза белков в клетке. Вероятно, внутривклеточная концентрация eRF1 лимитирована и находится под строгим контролем для достижения баланса между нормальной терминацией трансляции, реинициацией и NMD.
В наших экспериментах мы использовали 20-кратные избытки факторов терминации относительно рибосом (0,03 pmol преТК и 0,625 pmol eRF1 и eRF3). В используемой нами реконструированной in vitro системе отсутствуют дополнительные стимулирующие терминацию трансляцию факторы, поэтому эффективность распознавания стоп кодонов была довольно низкая, и при таком избытке факторов терминации относительно рибосом, эффективность образования ТК составляла всего 10-15%.
В дрожжах насчитывается около 22000 молекул eRF1 и 200000 рибосомных частиц на клетку [151]. Таким образом, в клетке обратное соотношение концентраций, КР1Ущ5л составляет около 0,1. Очевидно, для поддержания оптимального уровня терминации трансляции в условиях недостатка eRFl/eRF3, в цитоплазме клеток должны присутствовать дополнительные факторы, стимулирующие терминацию трансляции. В данной работе мы показали, что DDX19 является одним из таких факторов. Более того, он, как и недавно описанный фактор eIF5A [66], может стимулировать как стадию терминации трансляции, так и стадию элонгации. На основе полученных данных мы предложили модель функционирования DDX19 в трансляции (Рис. 30).
DDX19 в отсутствии факторов терминации, но при наличии ATP, может связаться с рибосомами, прогидролизовать ATP и после этого высвободиться в раствор. Когда рибосома достигает стоп кодона эта хеликаза, связываясь с преТК, увеличивает эффективность терминации трансляции путем стабилизации взаимодействия фактора терминации еRF1 с рибосомными комплексами, независимо от гидролиза ATP.
uORFs 5 -НТО ингибируют трансляцию в лизате PKM мРНК. Влияние DDX19 и Gle1 на трансляцию uORFs 5 -НТО мРНК PKM
В качестве модельной мРНК для исследования влияния uORF на эффективность трансляции, мы выбрали мРНК, кодирующую PKM. Она содержит протяженную 5 -НТО [155], в которой находится семь потенциальных стартовых кодонов uORF [156]. Чтобы изучить влияние структуры и состава 5 -НТО мРНК PKM на ее трансляцию, мы получили генетические конструкции, где стартовые кодоны ATG были заменены на стоп кодоны TAG в каждой из открытых рамок считывания 5 -НТО. Таким образом мы делетировали все 7 открытых рамок считывания 5 -НТО мРНК PKM последовательно. В итоге получили генетические конструкции (делеционные мутанты), имеющие одинаковую длину, но содержащие разное количество открытых рамок считывания. Чтобы проверить эффективность трансляции этих конструкций in vitro (в клеточном лизате), мутантные 5 -НТО мРНК PKM были встроены в pGEM вектор, содержащий кодирующую последовательность люциферазы. Эффективность трансляции полученных мРНК определялась в лизате ретикулоцитов кролика (RRL) и клеточном лизате асцита карциномы мыши (S30) (Рис. 42).
Активация трансляции мРНК протеинкиназы М (PKMQ с помощью мутагенеза коротких окрытых рамок считывания (uORFs) в 5 нетранслируемом регионе (5 UTR) . (А)
Уровень трансляции мРНК с различными мутантними лидерами протеинкиназы М (PKMQ и кодирующей последовательностью гена люциферазы в лизате ретикулоцитов кролика (RRL). (Б) Уровень трансляции мРНК с различными мутантными лидерами протеинкиназы M (PKM) и кодирующей последовательностью гена люциферазы в Кребс-лизате (S30). мРНК содержит шесть (7), пять (6,7), четыре (5-7) и ни одного (1-7) uORFs. Звездочками ( ) отмечено существенное отличие от соответствующего контроля p 0.001 (n=3), p 0.01 (n=3). Rlu – относительные единицы люминесценции.
Оказалось, что уровень трансляции главной ORF напрямую зависит от количества имеющихся uORF в 5 -НТО. То есть, если мутировать одну, две или все короткие uORF в 5 -НТО мРНК PKM, уровень базового синтеза белка-репортера увеличивается в соответствии с количеством удаленных рамок. Этот результат согласуется с концепцией ингибирования трансляции короткими uORF [155].
Полученные нами данные демонстрируют, что уровень трансляции существенно зависит от наличия коротких uORF, которые конкурируют с главной рамкой считывания за компоненты трансляционной системы. Мы показали, что семь uORF из мРНК PKM значительно подавляют трансляцию и могут быть вовлечены в регуляцию трансляции данной мРНК. В соответствии с нашими данными и данными литературы, многие uORF в 5 -НТО ингибируют трансляцию. Предполагается, что после инициации трансляции факторы инициации остаются на рибосоме некоторое время и могут регулировать трансляцию uORF. Но регуляция трансляции uORF может быть и на уровне терминации, так как терминация может идти не только на стоп кодонах кодирующей последовательности, но и на стоп кодонах uORF. Если терминация трансляции неэффективна на uORF, то рибосома «зависает» в этой позиции; если терминация трансляции эффективна (за счет наличия дополнительных факторов терминации трансляции: DDX19, Gle1, PABP), рибосома после нее диссоциирует и дальнейшей трансляции не происходит. В клетке работать могут оба механизма, но в обоих случаях происходит подавление трансляции.
Для определения влияния DDX19 и Gle1 на трансляцию 5 -НТО мРНК PKM, ставили трансляции мРНК с 5 -НТО PKM дикого типа в RRL в присутствии/отсутствии белков DDX19B и 360Gle1B. Оказалось, что, ни DDX19B, ни 360Gle1B не влияют на эффективность трансляции модельной мРНК (Рис. 43). Таким образом, уровень трансляции главной ORF в мРНК PKM зависит от количества имеющихся uORF в 5 -НТО и не зависит от белков DDX19 и Gle1B.