Введение к работе
Актуальность работы. Семейство аренавирусов насчитывает 15 оболочечкых РНК-содержзпга виру сое, объединены* общностью уникальной морфологии частиц и ітрушоспецифичесіоасі антигенами fRowe w.P. et.al., 19701. Прототипным представителем всего семейства является вирус лш&сцитарного хориокеиингата (ЛХМ). Серологичесіотй анализ и географическое распространение вирусов позволяет разделить их на две большие группы - вирусы Старого Света и вирусы Нового Света. Первая группа - ЛХМ/Лассв - включает вирусы: Ласса, ЛХМ, Мопейя, Мобала, Скухуза, Иппи; вторая 2"руппэ - Такарибе: вирусы Мачупо, Хунин, Такарибе, Латино, Пичкнде, Амапари, Тамиамк, Парана, Флексал. С помощью поли- и мсноклональкых антител (ЫКЛ) {Casals J., 1975; Buchmeir M.J.et al, 1931; Sanchez et al., 1989] в группе Такарибе выделяют две антигенные подгруппы. Между вирусами первой подгруппы (Мачупо, Хунин, Такарибе, Амапари, Лати-но) выявляются более близкие антигенные связи, чем меаду ними и вирусами второй полгруппы (Пичивде, Парана, Тамиами).
Из патогенных аренавирусов наибольшую опасность для человека представляет вирус Ласса, вызывавдий одноименную лихорадку. Описаны случаи завоза этого заболевания в страны Европы и Северной Америки [Дроздов С.Г., Сергиев В.П., 1984].
Кроме этог^, в последние года продолвается изоляция Ласса-подобных вирусов на Африканском континенте [Gonzales J.Р., 1982; 1984; Kiley Ы.Р. et al.,19361 .
Поиск групповых и тшоспецифических эпитопов и выявление антигенных взаимоотношений у аренавирусов с помощью МКА по-прекне-му привлекает повышенное внимание [Sanchez A. et al.,19891. Для . идентификации вновь выделенных изолягов необходимо получеиио МКА ко всему спектру антигенных детерминант. Необходимость получения МКА к аренавирусам обусловлена еще и тем, что
_4-
они могут оказаться удобным инструментом для анализа функциональных и биологических свойств аренавируссв.
В качестве экспериментальных вирусных моделей для получения гибридом, продуцирующих МКА, нами были выбраны основные представители семейства: непатогенный для человека вирус Иичкпце и патогенные вирусы Мачупо и Ласса.
Настоящая работа выполнена в плане научно-исследовательских работ, предусмотренных заданием МЗ СССР "Изучить субвирионные компоненты и факторы патогенности для разработки средств и методов диагностики, специфической профилактики и химиотерапии геморрагических лихооадок, вызываемых патогенными аренавирусами", * гос. регистрации 01.85.0062071.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы бы::э получение гибридом, продуцирующих МКА к патогенному и непатогенному для человека аренавирусам Мачупо и Пичинде комплекса Такарибе и патогенному вирусу Ласса, комплекса ЛХМ/Ласса, для выявления на их основе типо- и группоспецифячвских антигенных детерминант в структурных белках этих вирусов.
Поставленная цель обусловила необходимость решения следующих задач:
-отработка методики инактивации инфекционной активности патогенных для человека аренавирусов;
-отработка оптимальной схемы иммунизации мышей ВАЬВ/с инактивированным- вирусом с целью получения гипериммунных животных;
-отработка метода приготовления суспензионных препаратов, пригодных для массового скрининга образцов специфических антител в гибридомной технологии;
-получение и отбор стабильных штаммов гибридных клеток-продуцентов МКА к непатогенному для человека вирусу Пичинде и патоген-
-5--ным вирусам Мачупо и Ласса;
-исследование адтителпродуцирующей способности полученных гибридом при культивировании их in vitro и in vivo;
-изучение свойств МКА и специфичности к антигенам арснавиру-сов;
-выявление взаимородственных антигенных связей у представителей комплексов Такарибе и ЛХМ/Ласса;
-выявление группо- и типоспецифических антигенных детерминант в структурных белках аренавирусов.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований и разработок впервые получены гибридомы, продуцирующие МКА к антигенным детерминантам патогенного вируса Мачупо. Штамм гибридных клеток АРМА-М, продуцирувдий МКА к вирусу Ыачупо, защищен авторским свидетельством (рею. на выдачу Авт. свид. JM843403 /13 от 27.02.91 г.)
Впервые в стране получены гибридомы, продуцирующие МКА к непатогенному для человека вирусу Пичинде (комплекс Такарибе), направленные к поверхностному гликопротеиду. Штамм - продуцент МКА к вирусу Пичинде защищен авторским свидетельством Л 1426086 (дата приоритета 27.07.1986).
Впервые в стране получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к антигенным детерминантам патогенного для человека вируса Ласса (комплекс ЛХМ/Ласса). Штаммы гибридных клеток АРМА-Л, AFMA-L-1 защищены авторскими свидетельствами (й 1628525, дата приоритета 19.06.1989; реш. на выдачу ввт.свид. » 4906435/13 ОТ 22.05.91 г.).
Проведен анализ секреторной способности полученных гибридом. Изучены свойства МКА в различных серологических реакциях: реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализация (РЯ), непрямая
иммунофлюоресценция (ИФ), твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунопреципитация (РИП).
С помощью полученной коллекции МКА обнаружены и подтверждены общие антигенные детерминанту у вирусов Мачупо, Лаоса, Молейя, Такарибе и Тамиами.
Впервые были получены тилоспецифические МКА к вирусу Мачупо н Пичияде, позволяющие проводить свродиффореншацшо вирусов.
Впервые получены МКА, специфичные к белку GP-2 вируса Ласса, обладающие нейтрализующей актизностью, что показывает наличие нейтрализующего сайта в белке, являющимся высококонсервативным.
Практическая ценность работы. Разработана методика, позволя-ящая в'условиях максимальной безопасности получать стабильные и технологичные штаммы гибридных клеток, продуцирующие МКА к патогенным и кепэтог8нным для человека аренавирусам.
Серии стабильных и технологичных гибридом применены в качестве базы для наработки МКА с целью получения усовершенствованных иммунсдиагностических препаратов.
Препараты МКА к групповой антигенной детерминанте вирусов комплекса Такарибе и ЛХМ/Ласса, а также препараты МКА, обладающие нейтрализующей активностью, продуцируемые гибридомами серии АРМА-Л, используются в научно-практических целях в БелШИЭМ МЗ БССР, а также переданы в вирусологическую лабораторию Республики Гвинея. Получена и испытана в Новосибирском ВНЩ молекулярной оиологии Микмедпрома в декабре 1990 г. экспериментальная серия диагностического препарата на основе МКА к вирусу Ласса, конъгагированных с тароксидазой хрена.
Препараты МКА :< вирусам Мачупо и Пичинде, продуцируемые гибридомами AFMA-M к АГМА-П, используются в научно-исследовательских разработках в отделе ООВИ БелНИИЭМ МЗ БССР.
- 7 -Основные положения, выносише на защиту.
-
Отработаны условия инактивации патогенных для человека аро-навирусов с целью использования в" дальнейшем при получении МКА. Показано преимущество длительной схемы иммунизации мишей линии Ваіз/с, что позволяет получить активированные спленоциты животных, исполъзузмке в гибрадомной технологии.
-
Впервые получены 37 линии гибридом, продуцирующих МКА к антигенным детерминантам вируса Мачупо. Кроме этого, получено 40 линий гибридных клеток, продуцирующих МКА к вирусу Ласса, и 3 линии - к вирусу Пичинде. Полученные гибридные линии клеток могут служить перспективным источником гомогенных специфических антител, пригодных для изучения антигенной структуры вирусных белков, их взаимородствешшх отношений.
-
Наличие общих антигенных детерминант у вирусов Ыачупо, Такарибе и Тамиами и отсутствие таковых, у вирусов Пичинде и Амапари подтверждает наличие в серокомшівксе Такарибе двух антигенных подгрупп.
-
Поверхностный белок гликопротевда GP-2 вируса Пичинде и нуклеопротеид вируса Мачупо содержат типоспецифические антигенные детерминанты, выявляемые с помощью МКА.
-
С помощ j МКА, специфичных к вирусу Ласса, выявлены общие антигенные детерминанты для вирусов Ласса, Мачупо, Такарибе, Тамиами и Мопейя, локализование в белках NP и gp-2.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на пленумах проблемной комиссий союзного значения "Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций, особо опасіше и медленные инфекции'', Минск, 1984, 1936 гг; на II Всесоюзном совещания "Культивирование клеток гявотных и человека" в г. Пушино в ноябре I9S5; на XII Мечниковской конференции молодых
-8-ученых-медиков "Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии" в г.Одессе в сентябре 1989 г.; на 2-ом рабочем Совещании Координационного сосета по комплексной программе. Моноклональные антитела'в изучении и диагностике природно-очаговых инфекций, в Ростове-на-Дону в июне 1991 г.
В завершенном виде диссертационная работа была доложена на конференции отдела ООВИ, протокол * 7 от 29.05.91 г., на заседании Ученого совета БелНИИЭМ, протокол J* 5 от 13.06.91 г.
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследований, обсуждения, выводов и спис "а литературы. Последний включает 1-55 источников отечественной и зарубежной литературы.
Работа изложена на 122 листах машинописи, включает 7' рисунков и 19 таблиц.
Обзор литературы. В соответствии с ' основными задачами диссертациионной работы обзор литературы состоит из главы, состоящей из 3 частей. В главе отражены: основная характеристика аренавирусов, анализ антигенной структуры аренавирусов с помощью поли- и моноклональных антител, а также рассмотрены вопросы взаимородственных антигенных связей у представителей семейства аренавирусов.