Содержание к диссертации
Введение
2 Основная часть 15
2.1 Обзор литературы 15
2.1.1 Влияние вирусов герпеса на популяционное здоровье животных и человека
2.1.1.1 Герпесвирусные заболевания в популяциях сельско- 16
хозяйственных животных
2.1.1.2 Герпесвирусы популяции человека 20
2.1.1.3 Реализация инфекционного потенциала вируса герпеса
2.1.1.4 Особенности иммунитета при герпесвирусной инфекции
2.1.2 Особенности моделирования вирусных заболеваний животных и человека
2.1.2.1 Патогенность вируса простого герпеса для лабораторных животных
2.1.2.2 Чувствительность лабораторных животных к возбудителям в зависимости от генетической характеристики
2.1.2.3 Влияние половых гормонов на реализацию инфекционного потенциала возбудителя
2.1.2.4 Влияние способа введения вируса на развитие экспериментальной герпесвирусной инфекции
2.1.2.5 Модели хронической герпесвирусной инфекции 47
2.2 Собственные исследования 49
2.2.1 Материалы, объекты и методы исследова-ния
2.2.1.1 Объекты экспериментальных исследований 50
2.2.1.2 Методика подбора экспериментальной модели для воспроизведения хронической герпесвирусной инфекции 51
2.2.1.3 Методы лабораторной диагностики, использованные
в экспериментальных исследованиях 62
2.2.1.4 Характеристика референтных популяций человека и животных 69
2.2.1.5 Клинико-лабораторные тесты, использованные для обследования в референтных популяциях человека и животных
2.2.1.6 Методика изучения эффективности применения лио филизированного препарата аллофибробластов (АФБ) для
лечения герпесвирусных поражений кожи и слизистых оболочек в референтных популяциях человека и животных 72
2.2.2 Особенности реализации вариабельности инфекционного патенциала вируса простого герпеса в популяции рандбредных мышей 76
2.2.2.1 Динамика распространения вируса в организме экспериментальных мышей и клинические формы герпетического заболевания 76
2.2.2.2 Динамика изменений иммунологического статуса, биохимического профиля и морфофункциональных показа телей в популяции рандбредных мышей при хронической герпесвирусной инфекции 87
2.2.2.3 Формы исхода герпетического заболевания 106
2.2.3 Влияние хронической герпесвирусной инфекции на биологический потенциал мышей – самцов 109
2.2.3.1 Инфицированность органов мочеполовой системы и морфофункциональные особенности строения семенников мышей – самцов при экспериментальной герпесвирусной инфекции 110
2.2.3.2 Количественные и качественные характеристики спермы мышей – самцов при хронической герпесвирусной инфекции 122
2.2.3.3 Влияние хронического герпесвирусного процесса у мышей – самцов на зачатие, развитие плодов и исход беременности у мышей – самок, и здоровье потомства 126
2.2.4 Адекватность экспериментальной модели для оценки популяционного здоровья человека и животных 137
2.2.4.1 Применение усовершенствованного алгоритма диагностики ГВИ для оценки популяционного здоровья челове- 138
ка
2.2.4.2 Перспективность применения препарата АФБ для лечения герпетических поражений кожи у человека 141
2.2.4.3 Оценка популяционного здоровья крупного рогатого скота по усовершенствованному алгоритму диагностики ГВИ 144
2.2.4.4 Эффективность применения лиофилизированного препарата АФБ в лечении коров с генитальной формой инфекционного ринотрахеита 148
3 Заключение 152
3.1 Обсуждение 153
3.2 Выводы 166
3.3 Практические предложения 168
Список сокращений 169
Список литературы
- Реализация инфекционного потенциала вируса герпеса
- Клинико-лабораторные тесты, использованные для обследования в референтных популяциях человека и животных
- Инфицированность органов мочеполовой системы и морфофункциональные особенности строения семенников мышей – самцов при экспериментальной герпесвирусной инфекции
- Оценка популяционного здоровья крупного рогатого скота по усовершенствованному алгоритму диагностики ГВИ
Введение к работе
Актуальность темы. На современном этапе воздействия неблагоприятных эндогенных и экзогенных факторов представляют растущую угрозу для популя-ционного здоровья человека и животных. Различные химические и физические факторы, в первую очередь радиация и соединения тяжелых металлов, считаются основной причиной мутаций на хромосомном и молекулярном уровне (В.В. Косарев, С.А.Бабанов, 2010; О.Г. Макеев, М.Э. Бураев, 2012). Однако с этими факторами контактирует относительно небольшая часть популяции, тогда как уникальной особенностью вирусов является их повсеместное распространение.
Инфицированность населения вирусами семейства Herpesviridae по данным Всемирной Организации Здравоохранения в разных странах составляет от 52 до 90%. Число людей, инфицированных только вирусом простого герпеса (ВПГ), по данным российских и зарубежных исследователей в странах СНГ и России составляет более 21 миллиона (В.И. Покровский, 2012; Н.В. Скрипченко, 2013). В животноводческих хозяйствах Российской Федерации, по данным Рахманова А.М. с соавторами (2010), вирусами герпеса инфицировано от 17 % до 43 % животных племенных и товарных хозяйств.
Вопросы о влиянии герпесвирусов на живой организм в целом, изучении отдаленных последствий вирусных инфекций, как острых, так и особенно перси-стирующих приобретают важное теоретическое и практическое значение для сохранения популяционного здоровья человека и животных на современном этапе.
Задачи по обеспечению условий снижения риска распространения герпетических заболеваний на основе внедрения комплекса лечебно-диагностических и профилактических мероприятий являются актуальными как для медицины, так и для ветеринарии
Степень разработанности темы. Клинические и экспериментальные исследования доказали, что герпесвирусная инфекция протекает как общее системное заболевание организма с поражением многих органов и тканей, нередко в тяжелой форме (J. D. Connor, L.A. Wilson, 2003; И.М. Каримова, 2004; А.Г. Глотов, 2006; О.Г. Петрова, 2007; В.А. Исаков, Г.Ю. Кнорринг, 2008). Однако механизмы формирования системного заболевания в настоящее время не до конца выяснены. Оценка влияния взаимодействий «вирус – хозяин» на состояние популяционного здоровья человека и животных также требуют системного и более детального изучения процессов персистенции герпесвирусов. Генетическая общность герпесвирусов человека и животных позволяет использовать эталонные штаммы для создания экспериментальных моделей при изучении общебиологических проблем, в частности, разработки прикладных и
фундаментальных вопросов (В.М. Жданов, С.Я. Гайдамович, 1987; И.Д. Лоскутов, 1996; M. Cook, 2003).
Для изучения механизмов развития, течения и последствий инфекционного процесса в настоящее время используются две модели - in vitro и in vivo (Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева, 2010; Р.Я. Фрешни, 2010). Однако механизмы воздействия вируса на клеточные культуры in vitro и на клетки в условиях животного организма могут быть столь различны, что речь идет уже не о количественных различиях, а о качественных особенностях и существенных закономерностях (Р.М. Хаитов, Н.И. Ильина, 2009). Исход инфекции определяется возрастом и генетическими особенностями организма «хозяина», состоянием и зрелостью его иммунной системы, сопутствующими заболеваниями, физическими и химическими факторами окружающей среды (Н.В. Каражас, Н.А. Малышев, Т.Н. Рыбал-кина, 2007). Модель in vivo позволяет не только воспроизвести определенную форму герпесвирусного заболевания, но и проследить влияние инфекции на иммунные, биохимические процессы, происходящие в организме экспериментального животного (Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева, 2010). Проведенный анализ литературных источников показал, что в основном экспериментальные модели гер-песвирусной инфекции создавались для конкретных форм заболеваний (Л.М. Алимбарова, И.Ф. Баринский, 2000; Ю.Ф. Майчук, 2001; L.A. Scott, M.S. Stone, 2003). Исходя из поставленных задач, вирусный антиген вводили непосредственно в исследуемый орган или систему.
Вопросы разработки модели in vivo для изучения механизмов перехода острой герпесвирусной инфекции в хроническую форму и оценка ее влияния на развитие патологических процессов в организме на протяжении всего жизненного цикла экспериментального животного остаются актуальными.
Цель работы. Изучить теоретические и практические аспекты моделирования хронической герпесвирусной инфекции.
Задачи исследования:
- получить адекватную экспериментальную модель герпесвирусной инфекции
in vivo для изучения механизмов взаимодействия «вирус – хозяин»;
изучить особенности персистенции вируса простого герпеса в периоды «рецидив – ремиссия»;
провести комплексное исследование иммунологических и биохимических показателей в динамике у животных в эксперименте в условиях персистенции вирусного генома;
изучить характер изменений, обусловленный хронической герпесвирусной инфекцией органов иммунной, нервной, кроветворной и репродуктивной систем;
изучить влияние хронического герпесвирусного процесса на биологический потенциал экспериментальных животных-самцов;
оценить риск вертикальной передачи и развития неонатального герпеса у экспериментальных животных при хронической герпесвирусной инфекции;
усовершенствовать алгоритм диагностики герпесвирусной инфекции с использованием современных методов детекции возбудителя;
- изучить на экспериментальной модели герпесвирусной инфекции in vivo
эффективность иммунобиологического лиофилизированного препарата аллофиб-
робластов (АФБ) для лечения заболеваний человека и животных, вызванных ви
русом герпеса.
Научная новизна. Получены новые данные о механизме персистенции гер-песвирусов в организме:
- персистирующий вирус формирует в организме животного множественные
очаги инфекции, что и обеспечивает постоянную антигенную нагрузку на
организм;
- развитие хронического процесса сопровождается сложным комплексом
патологических изменений на клеточном и органном уровнях, что приводит к
функциональному перенапряжению организма;
- хроническая воспалительная реакция, вызванная герпесвирусной
инфекцией, активирует субклинические аутоиммунные процессы, усугубляя
тяжесть и интенсивность патологических изменений в организме.
Получен ряд новых данных о характеристике герпесвируса, как вектора генетической информации:
- патогенное действие герпесвируса на сперматогенез осуществляется на
уровне клеток сперматогенного эпителия;
- в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии у эксперименталь
ных мышей-самцов диагностирована абортивная форма герпесвирусной инфек
ции.
Впервые подтвержден риск вертикальной передачи вируса подвижными сперматозоидами нормальной морфологии, которые содержат ДНК либо белки стадий жизненного цикла вируса простого герпеса. Инфицирование эмбрионов вирусом проявляется в виде неонатального диссеминированного герпеса с вовлечением висцеральных органов.
Впервые в алгоритме диагностики герпесвирусной инфекции использовано устройство на основе лазерного модуля для оценки активности вируса в клеточной системе.
Доказана эффективность иммунобиологического лиофилизированного препарата аллофибробластов (АФБ) для лечения поражений кожи и слизистых при ге-
нитальном герпесе у человека и пустулёзного вульвита у крупного рогатого скота.
Теоретическая и практическая значимость. На основании теоретического обобщения и результатов собственных исследований предложена научно-обоснованная модель хронической герпесвирусной инфекции in vivo, которая по существу отражает механизмы взаимодействия комплекса «инфекционный агент – макроорганизм». Валидность экспериментальной модели хронической герпе-свирусной инфекции и высокий уровень экстраполяции полученных данных были установлены при сравнительных клинико-лабораторных исследованиях. Показано, что заболевание у человека, и у крупного рогатого скота развивается по сходному алгоритму.
Для сохранения биологического потенциала и репродуктивного здоровья популяций человека и животных на основе экспериментальной модели был усовершенствован алгоритм диагностики герпесвирусных инфекций (Патент на полезную модель № 2013158784/15 (140765).
Изучение эффективности антивирусных препаратов с использованием разработанной экспериментальной модели позволило оптимизировать комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на сохранение популяци-онного здоровья человека и животных (Патент на изобретение № 2012102733/15 (2483739).
По результатам исследования разработаны и внедрены в практическое здравоохранение и ветеринарную практику Уральского Федерального округа 3 методических документа по диагностике, лечению и профилактике герпесвирусных инфекций (2009-2013 г.г).
Методология и методы исследования. Предмет исследования – герпесви-русная инфекция животных и человека. Объекты исследований – крупный рогатый скот уральского типа черно-пестрой породы, человек, лабораторные животные, эталонный штамм вируса простого герпеса человека 1 типа Л2 – ВПГ-1, образцы клинических материалов: кровь, сыворотка крови, моча, слюна, соскобы эпителия со слизистых оболочек ротовой полости, глаз, урогенитального тракта, образцы проб органов и тканей экспериментальных животных.
Исследования проводились с использованием вирусологических, серологических, биохимических, гематологических, патологоанатомических, клинических, статистических методов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Рандбредная популяция лабораторных мышей-самцов является валидной экспериментальной моделью для изучения стратегии персистенции вируса простого герпеса и вариабельности реализации его инфекционного потенциала.
-
Реализация инфекционного потенциала вируса простого герпеса в период "рецидив - ремиссия" происходит непрерывно в виде литической, латентной и абортивной форме инфекции: в одном макроорганизме они протекают одновременно на разных уровнях инфекционного очага.
-
Определяющим звеном в регуляции баланса между "организмом - носителем" и "инфекционным агентом" является персистенция ВПГ в "органах - мишенях": головном и спинном мозге, печени, легких, почек и клетках сосудистого эндотелия.
-
Сложный комплекс патологических изменений в организме экспериментальных животных обусловлен как прямым, так опосредованным действием вируса простого герпеса. Нарушения иммунорегуляторных процессов выражаются в количественных и качественных изменениях клеточного иммунитета, которые осложняются генерализацией воспалительной реакции и развитием полиорганной дисфункции.
-
Деструктивные эффекты генерализованного процесса в организме млекопитающих являются следствием тяжелых метаболических расстройств в системе углеводного и липидного обмена.
Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертации, были доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, (2006); «Актуальные вопросы диагностики и лечения вирусных инфекций», Екатеринбург, (2007); на XV российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, (2008); IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, (2008); на конгрессе педиатров Урала «Актуальные проблемы педиатрии», Екатеринбург, (2008); всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва, (2009); «Актуальные вопросы вирусных инфекций», Екатеринбург, (2010); «Современные проблемы развития биотехнологий», Екатеринбург, (2011); «Инфекция и иммунитет», Санкт-Петербург, (2012); «Диагностика и профилактика инфекционных болезней», Новосибирск, (2013); VIII окружной научно-практической конференции «Современные методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний», Екатеринбург, (2014); Международной научно-практической конференции «Инновационные подходы к решению современных проблем ветеринарной медицины», Екатеринбург, (2015); на заседаниях Учёного Совета ФГБНУ «Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт».
Соответствие паспорту специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 03.02.02 «Вирусология» по п. 3, п.6, п.7, п.10
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 38 научных работ, в том числе 19 – в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 патент РФ на изобретение, 1 патент РФ на полезную модель, 1 монография, 3 методические рекомендации.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 191 странице печатного текста, содержит 14 таблиц и 44 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и практических предложений, 4 приложений. Список литературы содержит 138 наименований, в том числе 22 на иностранном языке. Весь материал диссертации получен, обработан и проанализирован автором.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту д.м.н. Н.П. Глинских за научную и методическую помощь в работе над диссертацией. Отдельную благодарность за ценные замечания, рекомендации и совместную работу заведующей лабораторией вирусных инфекций животных ФГБНУ Уральского НИВИ д.в.н. Е.Н. Шиловой, старшему научному сотруднику лаборатории гриппа и ОРВИ Екатеринбургского НИИВИ к.м.н. Н.Н. Александровой и научному сотруднику лаборатории патоморфологии Екатеринбургского НИИВИ Н.Я. Пашниной.
Реализация инфекционного потенциала вируса герпеса
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 191 странице компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 44 рисунками. Список литературы включает 138 наименований, в том числе 22 на иностранном языке.
Герпесвирусы характеризуются убиквитарным распространением и поражают широкий круг хозяев – от беспозвоночных до высокоорганизованных организмов, в том числе – человека. Семейство Herpesviridae включает около 70 представителей патогенных для животных и человека [33, 44, 129]. Вирусы репродуцируются в ядре инфицированных клеток, образуют икосаэдральные капсиды диаметром 100 нм, состоящие из 162 капсомеров, которые в последующем обретают супер-капсидную оболочку глико- и липопротеиновой природы. Размеры зрелых вирио-нов 150 – 220 нм. Вирусный геном представлен линейной двухцепочечной ДНК с относительной молекулярной массой более 80 х 106. По физико-химическим особенностям вирионов и биологическим свойствам герпесвирусов выделено четыре подсемейства: Alphaherpesvirinae ( – герпесвирусы); Betaherpesvirinae ( – герпе-свирусы); Gammaherpesvirinae ( – герпесвирусы) и неклассифицированные гер-песвирусы.
Эта многочисленная группа ДНК-вирусов обладает уникальной способностью к пожизненной персистенции в организме хозяина. Между организмом «хозяина» и герпесвирусами устанавливается своеобразное биологическое равновесие, которое может нарушаться под влиянием как эндогенных, так и экзогенных факторов [7, 22, 24,105]. Нарушение этого «биологического равновесия» приводит к рецидиву герпетической инфекции, который протекает в виде острого процесса с характерными клиническими проявлениями. Как продуктивный, так и абортивный цикл инфекции может сопровождаться трансформацией клеток с развитием лим-фопролиферативных синдромов и заболеваний, в том числе и онкологических [5, 23, 51, 146].
В этиологической структуре вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц герпесвирусы занимают одно из первых мест наряду с аденовирусами и парагриппом-3. Одними, из наиболее распространенных, являются вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирус псевдобешенства свиней, вирус болезни Марека птиц. Нередко герпесвирусы циркулируют в организме животных и птиц в ассоциациях с другими возбудителями, что осложняет течение заболевания [19, 79,105,135].
Герпесвирусные заболевания в популяциях крупного рогатого скота. В животноводческих хозяйствах Российской Федерации существует две основные проблемы, обусловленные герпесвирусной инфекцией – респираторно-кишечная патология и нарушение репродуктивной функции. Причиной формирования респираторной и генитальной патологии является вирусоносительство среди племенного стада [21, 110, 135].
Ведущим патогеном респираторных болезней крупного рогатого скота является вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ), относящийся к – герпесвирусам -Herpesvirus bovis 1. Заражение животных происходит контактным путем. В естественных условиях к вирусу восприимчив только крупный рогатый скот [33,105].
Вирус ИРТ размножается главным образом в клетках слизистых оболочек респираторного и полового трактов. Для него характерно длительное носительство реконвалесцентами – вирус выделяется со слизистых оболочек в течение 12-14 дней после заболевания. Подобно ВПГ человека вирус ИРТ поражает ганглии тройничного нерва и персистирует в них. Ещё в 1982 году Ackermann M. et al. выделил ДНК ИРТ из тройничного ганглия больного теленка и наблюдал реактивацию вируса ИРТ при культивировании изолированных участков тройничного нерва от этого животного [15]. Длительное носительство вируса ИРТ обнаружено у быков-производителей, страдающих орхитом и азооспермией. Вирус выделялся в области крайней плоти, из эякулята; ДНК вируса обнаруживалась в клетках те-стикул [144, 151].
Переболевание ИРТ сопровождается длительным иммунитетом и образованием вируснейтрализующих антител. Однако, как и у человека, наличие антител может свидетельствовать не только об иммунитете, но и о носительстве вируса и потенциальной опасности таких животных для окружающих восприимчивых животных [105,134].
Заболевания крупного рогатого скота, обусловленные вирусом ИРТ, распространены в странах, как Старого, так и Нового света. По результатам исследований Relman D.A. et al., (2010) в западных штатах США, северной Англии, Новой Зеландии и Северной Африке инфицированность крупного рогатого скота вирусом ИРТ составляет от 17 до 60% поголовья. В Российской Федерации, по данным Рахманова А.М. с соавторами (2010), вирусом ИРТ инфицировано от 16,8% до 42,7% животных племенных и товарных хозяйств. В Уральском регионе в 2007-2010 годах сотрудниками НИВИ РАСХН Донник И.М., Печурой Е.В., Шиловой Е.Н. было показано, что респираторная форма ИРТ выявляется у телят в 41% модельных хозяйств, генитальная у коров – в 17%, смешанная (респираторная + ге-нитальная) – в 42% хозяйств [110, 135].
Респираторное заболевание взрослых животных, как правило, протекает 10-14 дней в слабой форме с умеренными поражениями респираторного тракта. У телят инфекционный ринотрахеит имеет более тяжелые формы. Поражения респираторного тракта у них сопровождаются острым воспалением, в 63,8% случаев диареей и в 26,9%- конъюнктивитами и кератоконъюнктивитами различной степени тяжести. Развитие крупозной пневмонии на фоне ИРТ у телят наблюдается в 22,6% случаев. Поражения центральной нервной системы, как у телят, так и взрослых животных достаточно редкие и составляют не более 3-5%. При тяжелых эпизоотиях ИРТ смертность среди молодняка крупного рогатого скота может достигать 75%. В этих случаях при патоморфологических исследованиях наблюдается некроз слизистых оболочек всего респираторного тракта, изъязвление сычуга и поражение надпочечников. Вирус ИРТ у переболевших животных выделяется из экскретов носовой полости в течение 1-3 месяцев [19, 79].
Генитальная форма ИРТ (пустулезный вульвовагинит) у коров и телок в 57-60% случаев протекает латентно. Рецидив же заболевания в период стельности имеет характерную, четко выраженную клиническую картину – многочисленные различной величины везикулы и пустулы в эпителии слизистой влагалища, его преддверии и вульве. Уровень абортов у инфицированных коров при острой форме генитального ИРТ составляет 4-5%, у нетелей – до 8-13% [110].
Болезнь Ауески в популяциях домашних свиней. Вирус болезни Ауески (ВБА) является типичным представителем – герпесвирусов и вызывает серьезные заболевания многих видов животных [33, 105]. ВБА интенсивно размножается в миндалинах слизистой носа, ретрофарингиальных лимфоузлах, легких, трахеи, мозге и селезенке свиней. Переболевшие животные длительное время являются вирусоносителями, несмотря на наличие антител. Особую опасность заболевания представляет для крупных свиноводческих комплексов с непрерывными опоросами, где благодаря длительной персистенции вирулентных штаммов ВБА зачастую приобретает энзоотическое течение и периодически вызывает массовую гибель новорожденных поросят. У старших поросят развиваются выраженные парезы и параличи, наблюдается расстройство дыхания и высокая температура. Через 12-14 часов животное, как правило, погибает, но в редких случаях может быть и полное выздоровление. У взрослых животных обычно развивается легкое заболевание верхних дыхательных путей с умеренной лихорадкой и потерей аппетита; инфекция также может протекать субклинически.
Клинико-лабораторные тесты, использованные для обследования в референтных популяциях человека и животных
По данным литературы обезьяны вида Astus trivirgatus восприимчивы к вирусу герпеса, особенно при инфицировании в конъюнктивальный мешок, при котором развивается генерализованная инфекция с поражением печени, надпочечников и легких. Через 6-8 дней после заражения животные погибают [155]. Восприимчивость к ВПГ-1 обезьян шимпанзе и макак-резус зависят от возраста животного и способа введения вируса. Введение вируссодержащего материала в брюшину или в кожно-мышечную складку шеи 2-3 месячным обезьянам вызывает развитие менингитов и менингоэнцефалитов, в 73% случаев животные погибают через 10-12 дней после инфицирования [6,101].
Кролики. Животные восприимчивые к вирусу простого герпеса используются в основном в качестве экспериментальных для воспроизведения модели «офталь-могерпеса». При инфицировании на скарифицированную роговицу глаза развивается кератоконъюнктивит. Летальность при этом способе заражения составляет от 3 до 12 % экспериментальных животных [60]. Введение вируса непосредственно в слюнную железу у кролика развивается бессимптомная инфекция протоков [54]. Инфицирование ВПГ-1 новорожденных крольчат и молодняка вызывает у них развитие острых менингоэнцефалитов, гибель животных наблюдается в течение 3-5 суток в 100% случаев [101]. Морские свинки являются одной из самых часто используемых экспериментальных моделей для изучения «генитального герпеса» и «герпетических поражений кожи» [38, 108, 142]. Заражение вирусом на скарифицированную роговицу глаза ведёт, как и у кроликов, к развитию кератоконъюнктивита. После внутри-мозгового инфицирования взрослых особей морских свинок развивается лихорадочная реакция с судорожным синдромом, гибель животных наблюдается в 8-15% случаев. Использование в качестве экспериментальной модели молодняка морских свинок, по мнению российских и зарубежных авторов, считается нецелесообразным, так как в 92-97% случаев животные погибают на 2-6 сутки после заражения вирусом [54].
Сирийские хомячки восприимчивы к вирусу простого герпеса, особенно при внутримозговом заражении, которое вызывает у них развитие менингита и менин-гоэнцефалита. При внутривенном введении развивается общая инфекция, но животные, как правило, не погибают [6, 49, 101].
Лабораторные крысы высоко восприимчивы к ВПГ при интраназальном заражении. У животных развивается пневмония, которая заканчивается гибелью в 60-87% случаев. Почти 100% смертность наблюдается при заражении 4-8 недельных крыс [101, 114].
Белые мыши. Восприимчивость белых мышей к вирусу герпеса варьирует в зависимости от возраста; наиболее восприимчивыми являются мыши в возрасте от 4 суток до 1 месяца, у которых независимо от способа и места введения вируса развивается герпетический энцефалит, заканчивающийся гибелью животных на 3-4 сутки после заражения [54, 106].
Перечисленные выше лабораторные животные являются традиционными моделями in vivo для воспроизведения экспериментальной герпесвирусной инфекции. Реже используются суточные цыплята, куриные эмбрионы, хорьки, кошки, собаки [143]. В исследованиях Rell R., Dick G. et all приведены данные по инфицированию ВПГ-1 карпов и лимонных акул для получения особо чистых мо-ноклональных антител [121]. Анализ литературных данных и собственных, ранее проведенных исследований показал, что у новорожденных и молодняка всех видов лабораторных животных, независимо от дозы и способа введения вируса, развивается острая генерализованная инфекция ЦНС с летальным исходом в 96-100% случаев. Высокая чувствительность новорожденных и молодняка традиционных лабораторных животных к ВПГ-1 обусловлена не только нейротропностью вируса, но и физиологическими особенностями. Большинство лабораторных животных рождается физиологически незрелыми, что в первую очередь сказывается на функциональном состоянии центральной нервной системы, эндокринной и кроветворной систем. Компенсаторно-приспособительные реакции на патогенное воздействие ограничивается реакциями гуморального звена иммунитета [138]. В патологический процесс при инфицировании ВПГ-1 сосунков и молодняка лабораторных животных сразу же вовлекаются печень и селезенка. Эти органы в I постнатальном периоде у животных осуществляют гемо- и лимфопоэз. Только к 4-5 неделе жизни физиологические, гематологические, биохимические и функциональные показатели достоверно приближаются или соответствуют таковым показателям у взрослых животных [106]. По мере старения у животных наблюдаются изменения активности многих ферментов, нарушаются обменные процессы, снижается функциональная активность желез, возникают дистрофические процессы в органах и тканях. Старение сопровождается сужением адаптационных и регуляторных механизмов организма; быстрее наступает истощение компенсаторных возможностей [106,124].
Таким образом, возраст лабораторных животных является одним из важных объективных критериев при выборе модели in vivo для изучения хронических вирусных инфекций. Описанные выше возрастные особенности сосунков, молодняка и стареющих животных значительно влияют на степень гематологических, биохимических, функциональных и морфологических сдвигов и гибель экспериментальных животных.
Инфицированность органов мочеполовой системы и морфофункциональные особенности строения семенников мышей – самцов при экспериментальной герпесвирусной инфекции
На 397 – 400-е сутки после инфицирования рецидив заболевания характеризовался сочетанными поражениями в виде слабовыраженных конъюнктивита, ринита, кожного зуда, тремора конечностей. Менингиальный синдром с яркой клинической картиной наблюдали только у 2 мышей, которые погибли во время судорожного припадка. В последующие 30 суток заболевание протекало монотонно. В большинстве случаев антиген ВПГ-1 обнаруживали в клетках слизистой уретры – 61,5% и глаз – 38,4% экспериментальных мышей. На 430-е сутки эксперимента у 24,4% мышей отмечено обострение: поражение полового органа в виде отечности, гиперемии; обильное слизистое отделяемое из мочеиспускательного канала; острый болевой синдром, протекающий на фоне острого ринита и выраженного кожного зуда. Через 3-5 суток у них появлялись манежные движения и тремор конечностей. В этот период обострения у 39,6% особей сформировался выраженный астенический синдром. В течение 10-12 суток острые клинические проявления исчезали. Однако практически все экспериментальные животные имели болезненный вид: матовую взъерошенную шерсть, бледные и сухие кожные покровы лап, ушей и хвоста, заострившийся контур морды. Животные были вялыми, сонливыми, отказывались от пищи.
Дальнейшие наблюдения (до 465-ых суток включительно) за инфицированными животными изменений в характере течения клинических проявлений ГВИ не выявили. Эксперимент был завершён по нескольким причинам. Во-первых, продолжительность жизни лабораторных мышей составляет в среднем 2 года, и первые признаки старения организма – изменение состава крови и биохимических показателей – у мышей отмечаются в возрасте 17-18 месяцев [54, 106, 138]. На момент завершения исследования возраст экспериментальных животных составлял 16 месяцев, то есть был критическим. При продолжении эксперимента необ 85 ходимо было бы учитывать показатели геронтологических особенностей, что не входило в цель нашего исследования. Во-вторых, общее состояние животных с признаками астенизации организма могло в значительной степени осложнить интерпретацию результатов эксперимента.
Анализ полученных результатов показал, периоды клинических проявлений экспериментальной ГВИ у мышей чередовались с периодами «клинического благополучия», что соответствовало «классической» форме течение герпесвирусного заболевания – «рецидив – ремиссия» [81]. Стадия первичного инфицирования (до 30-х суток наблюдения) характеризовалась острой клинической симптоматикой: катаральным конъюнктивитом, стоматитом, выраженным менингиальным синдромом и острой интоксикацией. Затем длительная персистенция вируса в организме экспериментальных мышей-самцов проявлялась тремя основными формами инфекции:
«Хроническая рецидивирующая» форма герпесвирусной инфекции, при которой персистенция вируса манифестировалась клинической симптоматикой заболевания в течение длительного времени;
«Хроническая латентная» форма ГВИ, при которой полный цикл репродукция вируса был нарушен и/или минимален, клиническая симптоматика заболевания отсутствовала;
«Медленная» форма ГВИ, при которой инкубационный период был длительным (до 300-х суток наблюдения) с последующим медленным прогредиентным течением с развитием тяжелых поражений нервной системы.
«Медленной» формой ГВИ регистрировалась в 3,6 % случаев, «Хроническая рецидивирующая» и «Хроническая латентная» формы – в 96,4% случаев.
По характеру клинических проявлений герпесвирусная инфекция в популяции экспериментальных мышей имела следующие формы. В 46% случаев наблюдалось сочетанное поражение слизистых оболочек глаз, ротовой полости, урогени-тального тракта. Сочетанное поражение урогенитального тракта и кожных покровов отмечалось в 18% случаев. Поражение центральной нервной системы с развитием моно- и поли – параличей и парезов, приводящих к летальному исходу, заре 86 гистрировано в 14%. Опухолевидные образования в области шеи и паха были выявлены в 6%. Признаки астенизации организма у мышей-самцов на момент завершения эксперимента наблюдались в 90,5% случаев.
Таким образом, было показано, что реализация биологического потенциала инфекционного вируса в организме экспериментальной модели осуществлялась через экспансию «органов – мишеней»: головного и спинного мозга, печени, легких, с формированием множественных очагов персистенции возбудителя. Диссе-минирование герпесвирусного генома в ткани и сосудистое русло «органов – мишеней» происходило в течение 15 суток после инфицирования. Алгоритм реализации биологического потенциала инфекционного вируса характеризовался фаз-ностью его репродукции в тканях «органов – мишеней» в виде литической и абортивной форм, которые происходили непрерывно и одновременно в одном макроорганизме на разных уровнях локализации очагов персистенции возбудителя, что отражало патогенез процесса в естественных условиях. Длительная персистенция вируса и характер вызываемых им клинических проявлений свидетельствовали о развитии системного хронического заболевания у экспериментальных мышей-самцов. 2.2.2.2 Динамика изменений иммунологического статуса, биохимического профиля и морфофункциональных показателей в популяции рандбредных мышей при хронической герпесвирусной инфекции
Одним из критериев, определяющих тяжесть инфекционного процесса, является оценка состояния общей резистентности организма. Исследование крови экспериментальных мышей показало, что на начальных стадиях развития герпе-свирусного заболевания наблюдалась адекватная картина развития защитной реакции организма (Рисунок 7). В первую очередь увеличивалась лейкоцитарная составляющая крови, происходила стимуляция моноцитарно-макрофагального звена, активировались окислительные процессы. Вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови, характеризующие уровень специфического иммунитета, выявлялись, начиная с 10-ых суток в титре 1:10. Далее титр антител увеличивался, достигая максимального уровня к 90-ым суткам (1:80) и сохранялся до 8-го месяца наблюдения. В последующий период отмечалось умеренное снижение титра ви-руснейтрализующих антител до уровня 1:40, который сохранялся до времени окончания эксперимента
На выраженность иммунного ответа у экспериментальных мышей указывали не только изменения иммунологических реакций клеток крови. О морфофункцио-нальной реакции костного мозга на введение ВПГ свидетельствовало изменении количественного содержания тучных клеток (ТК) в коже, брыжейке и перитоне-альном лаваже у экспериментальных животных. Острая фаза заболевания (10 – 15-е сутки) сопровождалась достоверным снижением количества ТК и их массовой дегрануляцией. В период реконвалесценции (20 – 40-е сутки) содержание ТК в организме экспериментальных животных возрастало и несколько превышало исходный уровень, что вероятно было обусловлено компенсаторной репродукцией клеточных предшественников ТК в костном мозге (таблица 11).
Оценка популяционного здоровья крупного рогатого скота по усовершенствованному алгоритму диагностики ГВИ
Деструктивные эффекты иммуносупрессивного воздействие вируса выражались в тяжелых дистрофических изменениях во всех системах и органах экспериментальных животных. В тканях органов (печень, почки, селезенка, легкие, головной и спинной мозг) обнаруживались очаги некробиоза и дискомплексации, диффузная лимфоидная гиперплазия и инфильтрация; воспалительная трансформация эндотелия капилляров и посткапиллярных венул. В патологический инфекционный процесс были вовлечены и репродуктивные органы. В тканях семенников выявлялись дистрофические и некробиотические изменения, лимфоидная инфильтрация и микроциркуляторные расстройства в сосудистом русле.
Таким образом, сложный комплекс патологических изменений в организме экспериментальных животных был обусловлен как прямым, так опосредованным действием вируса простого герпеса. Множественные очаги персистенции ВПГ в организме индуцировали иммунодефицитное состояние, которое осложнялось генерализацией воспалительной реакции и развитием полиорганной дисфункции.
В работах Бочаровой Е.Н. (2008), Брагиной Е.Е. с соавторами (2000), Климова Р.Р. с соавторами (2010), Луцкого Д.Л. с соавторами (2011) было показано, что одной из причин идиопатического бесплодия является нахождение в эякуляте вирусов герпеса [16, 17, 43, 55].
В доступной литературе обнаружено мало сведений о патогенном действии ВПГ на сперматогенез.
При диссеминации вируса в репродуктивные ткани происходит формирование множественных локальных очагов с латентной, хронической и медленной формами инфекции. Гистологические исследования показали, что структурные изменения в виде расстройства микроциркуляции в сосудистом русле семенников инфицированных мышей-самцов формируются к 120-м суткам. Через 6 месяцев после инфицирования возникают явления отека интерстициальной ткани семенника. Вокруг мелких и крупных сосудов наблюдалась лимфоидная инфильтрация, в самих сосудах – стаз крови и тромбоз. В просвете канальцев обнаруживались отторгшиеся клетки спермиогенного эпителия и клеточный детрит. Морфострук-турные изменения достигают максимума на 220 – 240-е сутки. На гистологических препаратах поперечных срезов семенников выявлены дистрофические изменения и очаговый некробиоз паренхиматозной ткани спермиогенного эпителия, периваскулярные инфильтраты, склероз, дезинтеграция клеток и обнажение клеток Сертоли. В ряде случаев отмечался частичный некроз перегородки между семенными канальцами и некробиоз сперматоцитов. В стенке части семенных канальцев наблюдался незавершенный процесс сперматогенеза с образованием сперматозоидов без хвостовой части. Общее количество патологических форм сперматозоидов к 120-ым суткам заболевания составляло 17, 6% в эякуляте, к 200-ым – 32,1% и к 420-ым – свыше 40%. Патологические формы сперматозоидов характеризовались аномалиями головки и жгутика. Учитывая полученные результаты о повышении числа патологических форм сперматозоидов, мы считаем правомерным утверждать, что у экспериментальных животных развитие ХГВИ сопровождается тератозооспермией.
Важнейшим фактором фертильности сперматозоидов является сохранение их подвижности. Количество прогрессивно подвижных сперматозоидов (a+b) должно составлять не менее 50% [103]. В исследуемых образцах эякулятов содержание c-сперматозоидов с непоступательным движением и неподвижных d-сперматозоидов увеличивалось до 56,7 ± 3,5%, у интактных мышей-самцов суммарно такие формы не превышали 30%. Во фракции прогрессивно подвижных сперматозоидов (a+b) у экспериментальных самцов превалировали b-сперматозоиды с медленным поступательным движением (до 40%). Причинами изменения фертильности сперматозоидов являлось не только инфицирование репродуктивных тканей. При герпесвирусной инфекции у экспериментальных мышей-самцов сформировался сложный комплекс метаболических и иммунных нарушений, который прямо или опосредованно мог влиять на подвижность сперматозоидов. Так в сыворотке крови у мышей с ХГВИ содержание глюкозы почти в 2 раза ниже, чем у интактных животных. Глюкоза, по общему признанию является основным энергетическим субстратом для многоклеточного организма. Её производная – фруктоза – основной энергетический субстрат для сперматозоидов, отвечающий за двигательные характеристики половых клеток и их оплодотворяющие способности [16, 55].
В наших исследованиях было показано, что развитие ХГВИ сопровождается выраженным лейкоцитозом. Таким образом, мы можем утверждать, что изменение подвижности сперматозоидов у экспериментальных животных связано со снижением уровня фруктозы. Дисбаланс провоспалительных и противовоспалительных цитокинов также может являться провоцирующим фактором в угнетении подвижности сперматозоидов.
Основной причиной бесплодных браков считается бессимптомная герпесви-русная инфекция у женщин [1, 2, 12, 72, 115]. Однако, в работах Бочаровой Е.Н. (2008), Брагиной Е.Е. (2000) и ряда других исследователей было показано, что морфологически нормальные сперматозоиды могут содержать в своей структуре вирусные детерминаты [16, 17, 43, 147].
В наших исследованиях было показано, что сперматозоиды, несущие вирусные белки, способны к преодолению защитных механизмов женских половых путей и оплодотворению. В развивающихся эмбрионах вирусная информация реализуется в виде латентной внутриутробной герпесвирусной инфекции, что вызывало патологические изменения на органном и системном уровне у плодов.
Внутриутробная гибель плода наблюдалась в 2% случаев. При вскрытии в рогах маток были обнаружены плоды с очагами некротических изменений. При лабораторных исследованиях тканей плодов и маток погибших мышей самок методами ПЦР и РИФ в них обнаруживались вирусная ДНК и антиген ВПГ.
Развитие герпетического заболевания у мышат, обусловленного внутриутробным инфицированием, имело ряд характерных особенностей. В недельный период после рождения погибло 39 мышат (24,8%). Вирусологическими исследованиями антиген вируса герпеса был обнаружен в тканях голов 160 ного и спинного мозга у 12,8% от общего числа погибших мышат. В гистологических образцах от погибших животных выявлены патологические изменения органов. В органах ЦНС – лимфоидная инфильтрация оболочек, выраженный пери-васкулярный и перицелюллярный отек, хроматолиз и некробиоз в отдельных нейронах. В тканях легких и сердца – лимфоидная инфильтрация и отек стромы. В почках, селезенке, поджелудочной железе – некробиоз клеток, гипоплазия лим-фоидной ткани. В тканях печени у всех погибших мышат выявлена баллонная дистрофия и некроз гепатоцитов, пролиферация купферовских клеток, периваску-лярная лимфоидная инфильтрация.