Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Топология взаимодействия рецептора DAF с вирусами ECHO иКоксаки 10
1.2. Топология взаимодействия энтеровирусов с каньон-связывающими рецепторами и модели депротеинизации энтеровирусов 14
1.3. Молекулы, обеспечивающие адсорбцию вирусов ECHO на поверхности чувствительных клеток 17
1.4. Механизмы эндоцитоза вирусов ECHO 22
1.5. Исследование топологии вирус-рецепторных взаимодействий с помощью анализа генетических полиморфизмов вирусов ECHO 25
Глава 2. Материалы и методы 28
2.1. Перевиваемые клеточные культуры 28
2.2. Вирусы 28
2.3. Моноклональные антитела 29
2.4. Постановка реакции бляшкообразования и клонирование вируса 30
2.5. Оценка инфекционной активности вируссодержащих жидкостей 31
2.6. Оценка гемагглютинирующей активности вируса 32
2.7. Адсорбция вируса на эритроцитах человека 32
2.8. Ингибирование репродукции вирусов моноклональными антителами 33
2.9. Секвенирование структурной части генома клонированных вариантов EV11 34
2.10. Непрямая иммунофлуоресцентная микроскопия 36
Глава 3. Миссенс-мутации в структурной части генома EV11, возникающие при адаптации к различным перевиваемым клеточным культурам 38
Глава 4. Получение близкородственных daf+ и daf— клонов EV11 в культуре клеток RD 45
Глава 5. Протективный эффект моноклональных антител к клеточным рецепторам при инфицировании клеток RD близкородственными daf+ и daf- клонами EV11 53
Глава 6. Роль фенотипического смешивания в формировании структуры популяции клонированного EV11 в отношении аффинитета к рецептору DAF 60
Глава 7. Обсуждение 67
Выводы и рекомендации 77
Литература 80
- Молекулы, обеспечивающие адсорбцию вирусов ECHO на поверхности чувствительных клеток
- Исследование топологии вирус-рецепторных взаимодействий с помощью анализа генетических полиморфизмов вирусов ECHO
- Постановка реакции бляшкообразования и клонирование вируса
- Получение близкородственных daf+ и daf— клонов EV11 в культуре клеток RD
Молекулы, обеспечивающие адсорбцию вирусов ECHO на поверхности чувствительных клеток
DAF (Decay Accelerating Factor, CD55) является первичным клеточным рецептором для гемагглютинирующих (ГА) вариантов EV11 [29, 31, 140, 141], хорошо изученным на молекулярном уровне [76, 86, 94].
По химической структуре DAF представляет собой гликозилфосфатидилинозитол-заякоренный (GPI-заякоренный) гликопротеин с молекулярной массой 70 кД. Показано, что вирусы ECHO 3, 6, 6 , 7, 11, 12, 13, 19, 21, 24, 25, 29, 30 и 33 серотипов специфически взаимодействуют с рецептором DAF на эритроцитах человека in vitro, вызывая феномен гемагглютинации [61, 110,120,122].
Первая попытка картирования сайта связывания с DAF на поверхности вириона EV11 была предпринята в работе Stuart et al. [141]. Сравнив ряд близкородственных ГА и негемагглютинирующих вариантов EV11, отличавшихся в общей сложности по 8 аминокислотным позициям в структурной части генома, авторы предположили, что DAF взаимодействует с поверхностью вириона вблизи осей симметрии 5-го порядка. Однако, анализ комплексов вируса ECHO 12 с рецептором DAF, полученных методом криоэлектронной микроскопии с трёхмерной реконструкцией изображений, позволил установить, что SCR3 домен DAF связывается с гипервариабельным поверхностным участком вируса ECHO 12 в области оси симметрии 2-го порядка [34, 118].
Ранее были селекционированы и секвенированы близкородственные клоны EV11, отличавшиеся по способности взаимодействовать с рецептором DAF в результате единичных аминокислотных замен в капсидном белке VP2 [15, 16, 21, 126]. Выявленные единичные аминокислотные замены в каждой паре сравниваемых клонов обеспечили однозначность интерпретации структурно-функциональной связи замен аминокислот с изменением сродства EV11 к рецептору DAF при репродукции в культуре клеток ФЭЧ. В совокупности выявленные аминокислотные замены, изменявшие аффинитет EV11 к DAF, образовывали кластер в одном поверхностном домене капсидного белка VP2 (в петле EF), что позволило впервые картировать сайт связывания с рецептором DAF на поверхности вирионов EV11 в области оси симметрии 2-го порядка [15, 16,21,126].
Не et al. [70] методом криоэлектроннои микроскопии с разрешением 16 ангстрем были получены трехмерные реконструкции изображений комплекса EV7 с рецептором DAF, на основе которых сначала был сделан вывод о том, что DAF расположен на поверхности вириона поперек оси симметрии 2-го порядка. В этой работе компьютерное моделирование проводилось с использованием данных рентгеноструктурного анализа для гомологичных участков вируса Коксаки ВЗ по причине отсутствия соответствующих данных для EV7. В дальнейшем той же группой исследователей [119] была выполнена криоэлектронная микроскопия комплекса «вирус-рецептор» с улучшенным разрешением 7,2 ангстрем, а компьютерное моделирование проведено на основе данных рентгеноструктурного анализа EV7 с разрешением 3,1 ангстрем. В итоге, было показано, что молекулы DAF располагаются на поверхности вириона EV7 вблизи осей симметрии 2-го порядка, но не пересекают их, что противоречило ранее опубликованным данным [70], но согласовывалось с экспериментально полученными Pettigrew et al. [118] результатами для комплекса DAF с EV12 и с теоретически предсказанными результатами для взаимодействия EV7 с DAF. Таким образом, экспериментальные данные, полученные методом криоэлектроннои микроскопии с реконструкцией трехмерного комплекса DAF как с EV7, так и с EV12, продемонстрировали высокую степень структурного сходства, несмотря на неидентичность вирусов.
Вместе с тем, данные, полученные методами сайт-направленного мутагенеза двухдоменного фрагмента SCR3-SCR4 растворимой формы DAF (sDAF) [153], сравнения выравненных аминокислотных последовательностей человеческого DAF с последовательностями DAF обезьян, изучения адсорбции и инфекционной активности некоторых ГА вирусов ECHO на культурах клеток обезьян, экспрессирующих DAF [151], позволили сделать вывод о различной локализации сайтов взаимодействия с эховирусами на поверхности DAF. В частности, аминокислотные остатки домена SCR3, взаимодействующие с EV7 и EV12, расположены с противоположных сторон стержнеобразной молекулы DAF [153]. Таким образом, несмотря на внешнее сходство комплексов вируса EV7 и EV12 с рецептором DAF, выявленное методом криоэлектронной микроскопии, взаимодействие рецептора с этими вирусами предусматривает поворот стержнеобразной молекулы DAF вокруг продольной оси.
Результаты сайт-направленного мутагенеза DAF позволили установить, что локализация сайта связывания с EV11 на поверхности DAF отличается от локализации сайтов связывания с EV7 и EV12 [153]. Аминокислотные полиморфизмы (К125А/К126А/К127А) в домене SCR3, картированные на стыке доменов SCR2 и SCR3, избирательно снижали аффинность EV11 к мутантному рецептору DAF, не влияя на аффинность мутантного DAF к EV7 и EV12. Lukacik et al. [94] было выполнено компьютерное моделирование комплекса полноразмерной молекулы DAF с ключевым компонентом альтернативного пути активации комплемента - прототипным доменом типа А фактора фон Виллебранда (vWF-A) в составе фактора В системы комплемента человека. В этой работе было показано, что DAF взаимодействует с vWF-A на стыке доменов SCR2 и SCR3, то есть в том же месте, где были картированы аминокислоты, участвующие в связывании DAF с EV11.
Топология взаимодействия DAF с вирусом Коксаки ВЗ существенно отличается от рассмотренной выше для вирусов ECHO. Hafenstein et al. [65] была выполнена криоэлектронная микроскопия и реконструкция комплекса sDAF и ГА варианта вируса Коксаки ВЗ (CVB3-RD), адаптированного к культуре клеток RD, с разрешением 14 ангстрем. Было показано, что на поверхности вириона CVB3-RD домены sDAF располагаются следующим образом: домен SCR4 начинается в области оси симметрии 3-го порядка, далее молекула sDAF проходит вдоль южного края каньона и перекрывает каньон доменами SCR3 и SCR2, переходя на соседний протомер, где заканчивается доменом SCR1 вблизи оси симметрии 5-го порядка. Согласно уточненной модели, выполненной Yoder et al. [160] с более высоким разрешением (2,74 ангстрем для вириона и 9 ангстрем для комплекса вируса с sDAF), вирион CVB3-RD имеет два сайта связывания с DAF - в области доменов SCR2 и SCR3, причем площадь контакта вириона с SCR2 доменом DAF составляет 75%, а с SCR3 доменом - менее 25%. Поскольку DAF перекрывает область каньона, постольку избыточные концентрации растворимого рецептора DAF (sDAF) способны блокировать адсорбцию CVB3-RD на химерных клетках хомяка СНО, экспрессирующих DAF человека [160].
Исследование топологии вирус-рецепторных взаимодействий с помощью анализа генетических полиморфизмов вирусов ECHO
Оценка ингибирующего эффекта мАТ проводилась на монослойных культурах клеток RD, выращенных в 96-луночных планшетах (Corning Life Sciences Inc., США). Для обнаружения ингибирующего эффекта использовали постоянные концентрации мАТ и 10-кратные разведения вирусных клонов. После удаления среды роста, клеточный монослой однократно промывали средой Игла, затем вносили в лунки по 100 мкл среды Игла с фиксированной концентрацией мАТ. Культуры клеток инкубировали с мАТ 1 час при 37С. Последовательные 10-кратные разведения (от 10"1 до 10 9) исследуемых клонов в среде Игла вносили по 100 мкл в соответствующие лунки. Каждое разведение вируса тестировали не менее чем в четырех репликах. В лунки, использованные для контроля инфекционного титра клонов, вместо мАТ вносили 100 мкл среды Игла и 100 мкл 10-кратного разведения вируса. В лунки, использованные для контроля цитотоксичности мАТ, вместо разведений вируса вносили по 100 мкл среды Игла. В контрольные лунки без мАТ и без вируса вносили по 200 мкл среды Игла.
При исследовании зависимости ингибирующего эффекта от дозы мАТ, разведение соответствующего клона подбирали таким образом, чтобы в 100 мкл разведенного вирусного пула содержалось 100 ТЦД50 вируса. Удалив среду роста, лунки с монослойной культурой клеток RD однократно промывали средой Игла, а затем вносили по 100 мкл среды Игла с 2-кратными разведениями мАТ. Культуры клеток инкубировали с мАТ 1 час при 37С. Исследуемые клоны, предварительно разведенные до нужной концентрации в среде Игла, вносили по 100 мкл в соответствующие лунки. Каждую концентрацию мАТ тестировали не менее чем в четырех репликах. В лунки, использованные для контроля инфекционного титра рабочего разведения вирусных пулов, вместо мАТ вносили по 100 мкл среды Игла. В контрольные лунки с мАТ вместо рабочего разведения вируса добавляли по 100 мкл среды Игла. В контрольные лунки без мАТ и без вируса добавляли по 200 мкл среды Игла.
Состояние монослоя наблюдали в инвертированном микроскопе ежедневно, начиная со 2-го дня после заражения, окончательный учет результатов проводили на 5-е сутки после фиксации монослоя 96% раствором этилового спирта и последующей окраски 0,5% раствором основного карболового кристалвиолета. 2.9. Секвенирование структурной части генома клонированных вариантов EV11 Вирусную РНК выделяли из 100 мкл культуральной жидкости, методом сорбции на силикагелевом носителе с помощью набора реагентов "РИБО-сорб" (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), согласно инструкции производителя.
Для проведения реакции обратной транскрипции использовали комплект реагентов "PEBEPTA-L" (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), содержащий ревертазу M-MLV и гексануклеотидные праймеры со случайной последовательностью нуклеотидов, в соответствии с рекомендациями производителя.
Структурную часть генома (2682 основания, кодирующие белки вирусного капсида VP1 - VP4 с прилегающими к ним участками) амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПНР) в виде трех перекрывающихся фрагментов длиной 952, 921 и 915 нуклеотидов с использованием трех пар праймеров (EF1-ER1, EF2-ER2, EF3-ER3).
Праймерные последовательности, представленью в таблице 2.1, подбирали с учетом анализа опыта предыдущих исследований [12, 15, 16, 126] и на основе общих требований к дизайну праймеров для ПНР [14, 33, 78, 149]. Синтез праймеров выполнен в ЗАО "Синтол" (Москва). Таблица 2.1 Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе.
Для проведения ГЩР 10 мкл раствора кДНК, полученного после проведения реакции обратной транскрипции, добавляли к амплификационной смеси, включающей следующие компоненты: 2,5 мкл 10х DreamTaq буфера (Fermentas International Inc, Канада), 0,2 мМ смеси дНТФ, 10 пМ каждого из пары праймеров и 1,25 Ед DreamTaq ДНК-полимеразы (Fermentas International Inc, Канада). Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл.
Амплификацию проводили с помощью термоциклера "Терцик" ("ДНК-технология", Москва) по следующей схеме: 1-й цикл - 95С - 5 минут; 42 цикла -95С - 10 секунд, 52С - 10 секунд, 72С - 40 секунд; заключительный цикл 72С - 5 минут.
Анализ продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мг/мл) и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе.
Секвенирование фрагментов ДІЖ проводили по методу Сенгера [87, 137] с помощью автоматического генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США) с использованием реакционной смеси ABI Prism BigDye
Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.0 (Applied Biosystems, США) по прямой (праймеры EF1, EF2, EF3, NS1, NS3, NS5) и обратной (праймеры ER1, ER2, ER3, NS2, NS4, NS6) последовательностям в соответствии с рекомендациями производителя. Последовательности праймеров представлены в таблице 2.1. Для подбора праймеров, сопоставления сегментов, выравнивания и сравнения последовательностей нуклеотидов и аминокислот использовали компьютерную программу MEGA, версия 5.1 [142]. Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности депонированы в международном банке генетической информации GenBank NCBI под номерами EU518467, EU518468, EU518469, EU518470, JF925112, JF925113, JF925114, JF925115, JF925116, JF925117. Полная информация представлена в приложении.
Монослойные культуры клеток RD выращивали на покровных стёклах и фиксировали ацетоном. На покровные стёкла с фиксированными клетками RD наносили по 75 мкл раствора, содержавшего 100, 50, 25, 20 и 2 мкг/мл мАТ В9.12.1 в физиологическом растворе. Стёкла инкубировали во влажной камере 45 мин. при 37С, промывали стерильным раствором 0Д5М NaCl и подсушивали при комнатной температуре.
В качестве вторичных антител использовали очищенные козьи поликлональные антитела к мышиным иммуноглобулинам класса G и М, конъюгированные с FITC (BD Pharmingen, США, каталожный номер - 554001).
На каждое стекло наносили 75 мкл раствора вторичных антител, в концентрации 50 мкг/мл, подобранной опытным путем. Стёкла инкубировали во влажной камере 45 мин. при 37С, промывали стерильным раствором 0Д5М NaCl и подсушивали. Окрашенные препараты просматривали в люминесцентном микроскопе со светофильтром 490 нм при увеличении х400 [111]. Оценку интенсивности флуоресценции проводили по условной шкале (-, +, ++, +++) [129]. Положительным результатом считали обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с яркой зелёной флуоресценцией. Отрицательным результатом считали отсутствие во всех полях зрения флуоресцирующих клеток. В качестве негативного контроля использовали монослойную культуру клеток RD, окрашенную только FITC-меченными анти-мышиными антителами.
Постановка реакции бляшкообразования и клонирование вируса
В результате ранее проведённых исследований с использованием экспериментальной модели вируса ECHO 11 и культур клеток ФЭЧ, Л-41 КД/84, RD, НЕр-2 и BGM, было показано, что рецепторная специфичность EV11 является вариабельным признаком и идентифицированы точковые мутации, приводившие к утрате вирусом сродства к рецептору DAF при репродукции в культуре клеток ФЭЧ [15, 16, 21, 126]. Выявленные точковые мутации обусловливали замены аминокислот капсидного белка VP2 вблизи оси симметрии 2-го порядка, что позволило подтвердить локализацию сайта связывания с DAF (антирецептора для DAF) на поверхности вириона EV11, предложенную Pettigrew et al. [118]. Вместе с тем, оставалась неизвестной топология антирецептора, который взаимодействует с неидентифицированными, альтернативными по отношению к DAF рецепторами, обеспечивающими адаптацию EV11 к различным культурам клеток. Также оставалось трудно интерпретируемым наблюдавшееся другими исследователями сочетание монорецепторного тропизма DAF-зависимых вариантов EV11 (блокирование адсорбции вируса на некоторых видах клеток с помощью антител к DAF [139, 140, 141]), и известная неспособность DAF выполнять функцию рецептор-опосредованной депротеинизации [121]. В связи с неспособностью DAF обеспечивать депротеинизацию DAF-зависимых вариантов, оставались непонятыми пространственные взаимоотношения и последовательность взаимодействия неидентифицированного корецептора для DAF и альтернативного рецептора(ов) в обеспечении интернализации и депротеинизации EV11.
В настоящей работе было продолжено изучение молекулярно-генетических основ изменчивости рецепторной специфичности EV11, обеспечивающих адаптацию клонированных вариантов с культуры клеток RD к культурам клеток Л-41 КД/84, НЕр-2 и BGM. Для картирования молекулярно-генетических изменений, возникающих при адаптации EV11 к выбранным перевиваемым клеточным линиям, было проведено секвенирование и сравнительный анализ структурной части генома исходного клона 111/RD и полученных из него клонов 111/L41, 111/Нер и 111/BGM, адаптированных к соответствующим культурам клеток [12, 111, 126]. Особенности топологии выявленных аминокислотных замен в пространственной структуре капсидных белков, наряду с взаимосвязанным изменением биологических свойств вариантов, позволили сгруппировать отдельные аминокислотные замены в два структурно-функциональных кластера [126].
Первый кластер включает аминокислотные замены в области антирецептора к DAF (ТІ65А и А156Т в белке VP2, а также N265S в белке VP1), которые обусловили утрату аффинности EV11 к рецептору DAF при адаптации к перевиваемым клеточным культурам Л-41 КД/84 и НЕр-2, а также восстановление аффинности к рецептору DAF (реверсия А165Т) при обратной адаптации с культуры клеток Л-41 КД/84 к культуре клеток RD.
Второй кластер аминокислотных замен локализован в области северной стены каньона (К88Е и Q129R в белке VP1) вблизи оси симметрии 5-го порядка. Топология аминокислотных замен, выявленных во втором кластере, позволяет заключить, что на поверхности вириона они находятся за пределами сайта, определенного ранее в качестве антирецептора для DAF у эховирусов 7, 11 и 12 серотипов [21, 34, 118, 119]. Кроме того, Stuart et al. [141] также наблюдали аминокислотные замены К88Е и Q132K в белке VP1 при адаптации штамма EV11-207 с культуры клеток человеческого происхождения НТ29 к культуре клеток обезьяньего происхождения Vero. Так как культура клеток Vero и использованная в наших экспериментах культура клеток BGM имеют общее происхождение - почки африканской зеленой мартышки, - то воспроизводимость результата с разными штаммами EV11 и двумя линиями клеток подтверждает необходимость выявленных аминокислотных замен для адаптации EV11 с культур клеток человеческого происхождения к культурам клеток обезьяньего происхождения. С учетом того, что замена всей петли ВС в белке VP1 у апатогенного для мышей полиовируса 1 типа (штамм Mahoney) на петлю ВС VP1 от патогенного для мышей полиовируса 2 типа (штамм Lansing) обеспечивала штамму Mahoney возможность распознавать гомолог рецептора для полиовируса в ЦНС мышей [97, 106], можно вполне обоснованно предположить, что на северной стене каньона вблизи оси симметрии 5-го порядка локализованы важные детерминанты, определяющие видовой тропизм энтеровирусов, а именно - антирецептор для связывающегося с каньоном рецептора.
В результате обратной адаптации к культуре клеток RD четырех Daf-клонов EV11, селекционированных на культуре клеток Л-41 КД/84, были получены daf- клоны EV11, не взаимодействовавшие с DAF, но способные репродуцироваться в культуре клеток RD, то есть использовавшие альтернативный клеточный рецептор в качестве первичного рецептора вместо DAF. Один из полученных клонов (431) был использован для дальнейшей селекции пары близкородственных daf+ и daf- клонов (431-1 и 431-6), которые отличались в структурной части генома единственной аминокислотной заменой ТІ65А в белке VP2. Данная аминокислотная замена картировалась на поверхности вириона в области, идентифицированной в качестве сайта связывания EV11 с рецептором DAF. Daf+ клон 431-1 оказался DAF-зависимым, так как его репродукция в культуре клеток RD блокировалась моноклональными антителами к DAF, в отличие от daf- клона 431-6 [111].
Одинаковая структура каньона у полученной пары daf+ и daf- клонов подразумевала возможность использования либо одного и того же, либо конформационно идентичного каньон-связывающего рецептора как в качестве первичного рецептора для daf- клона, так и в роли корецептора для DAF-зависимого клона, первично взаимодействующего с DAF. С данным предположением согласуется наблюдавшаяся другими исследователями способность DAF-зависимых штаммов EV7 репродуцироваться в культуре клеток Raji, не экспрессирующей DAF [40, 150].
Получение близкородственных daf+ и daf— клонов EV11 в культуре клеток RD
К настоящему времени получены данные, позволяющие предположить существование универсального механизма депротеинизации у большинства вирусов ECHO и Коксаки А9 с участием молекул HLA-I. Молекулярная масса лиганда (gp44) для моноклональных антител мАТ 143, описанных в работах Mbida et al. [99, 100, 101], соответствует молекулярной массе тяжелой цепи молекул HLA-I. Лиганд для мАТ 143 был выявлен в культурах клеток человека и обезьяны, но не в культурах клеток быка, собаки и кролика. Сопоставимый с мАТ 143 широкий спектр протективной активности в отношении эховирусов был продемонстрирован в культуре клеток RD при использовании анти-Ргт [150]. Установлено участие молекул HLA-I и собственно Ргт в интернализации EV11 и вируса Коксаки А9 [40, 72, 146].
Известно, что панспецифичные моноклональные антитела W6/32 не защищают клетки RD от инфицирования EV11 [40] и EV7 [150]. Антитела W6/32 распознают составной эпитоп, в который входят как аминокислоты аг домена тяжелой цепи молекул HLA-I, так и N-концевые аминокислоты Р2П1 [81, 87]. Следовательно, отсутствие протективного эффекта мАТ W6/32 может быть обусловлено диссоциацией составного эпитопа в процессе рециркуляции молекул HLA-I. В отличие от панспецифичных мАТ W6/32, анти-Ргт одинаково эффективно связываются как со свободным Рггп, так и с (Згт в составе молекул HLA-I.
В настоящей работе не обнаружен протективный эффект панспецифичных мАТ В9.12.1 при инфицировании культуры клеток RD daf+ и daf- клонами EV11. Этот результат не согласуется с данными Chevaliez et al. [40], что, возможно, обусловлено различием вирусных штаммов и пассажной истории использованной линии клеток RD.
У трёх daf- клонов (121, 211, 311), выделенных в культуре клеток Л-41 КД/84, в области С-терминала VP1 по сравнению с исходным клоном 111/RD была обнаружена общая аминокислотная замена K286R. Другая аминокислотная замена N265 S в области С-терминала VP1 наблюдалась при адаптации клона 111/RD к культуре клеток НЕр-2. По данным Stuart et al. [141], аминокислотная замена К259Е в области С-терминала VP1 наблюдалась после адаптации штамма EV11-207, полученного в культуре клеток НТ29, к культуре клеток Vero. По данным Heikkila et al. [71, 72], мутации RGDdel и RGE в области С-терминала VP1 у родственного эховирусам вируса Коксаки А9 приводили к смене первичного рецептора. Исходная последовательность RGD обеспечивала взаимодействие вируса Коксаки А9 с осуРб-интегрином в качестве первичного рецептора на клетках А549, в то время как мутации RGDdel и RGE обеспечивали взаимодействие вируса Коксаки А9 с интегрином осуРз в качестве первичного рецептора на клетках RD. Следовательно, мутации, выявленные в С-терминале VP1 EV11, возможно, имеют отношение к взаимодействию с интегринами, экспрессируемыми на поверхности восприимчивых клеток.
Наряду с рецепторами DAF и av интегринами, вирусы ECHO, в частности EV5 [79], так же как вирусы Коксаки А9 [102] и Коксаки ВЗ [161], могут использовать гепарансульфат в качестве первичного клеточного рецептора. В отношении потенциального многообразия первичных рецепторов, вирусы ECHO аналогичны вирусу Коксаки ВЗ, который также способен использовать DAF или гепарансульфат в качестве первичных клеточных рецепторов в условиях ограниченной доступности основного каньон-связывающего рецептора CAR: в частности, на апикальной поверхности поляризованных клеток Сасо-2 [42, 43] и на поверхности клеток RD [39].
Несмотря на то, что каньон-связывающий рецептор для эховирусов в настоящее время неизвестен, гипотеза разнообразия первичных рецепторов и универсального механизма депротеинизации с участием молекул HLA-I класса (в частности - Р2П1) и предполагаемого общего каньон-связывающего рецептора (например, действующего внутриклеточного), может быть применима к энтеровирусам группы В.
Высокая степень изменчивости таких фенотипических признаков энтеровирусов как тканевой / клеточный тропизм и вирулентность, обычно объясняется с позиции высокого потенциала генетической изменчивости РНК-содержащих вирусов [51, 52, 57]. Вместе с тем, у вирусов без оболочки довольно широко распространено явление смешивания геномов и структурных белков внутри клетки при репродукции, приводящее к образованию "химерных" вирионов, фенотипические свойства которых не соответствуют потенциалу упакованного в них генома, т.е. феномен фенотипического смешивания [18].
Для энтеровирусов фенотипическое смешивание было описано между близкородственными вирусами полиомиелита I и II типов [89], и между относительно отдаленными EV7 и вирусом Коксаки А9 [80]. Однако, в доступной литературе не обнаружено данных о возможной роли "химерных" вирионов энтеровирусов, представленных сочетанием РНК, имеющей консенсусную нуклеотидную последовательность мажорной субпопуляции, и капсида, являющегося продуктом трансляции мутантного генома, содержащего значимую для проявления конкретного фенотипа мутацию. При обычных для вирусологических методов исследования размерах популяций, клонированные daf+ варианты EV11 как в культуре клеток ФЭЧ [134], так и в культуре клеток RD [21], содержат минорную субпопуляцию, не взаимодействующую с эритроцитами, но проявляющую инфекционную активность. Меньшая часть минорной субпопуляции представлена daf- мутантами, дающими Daf- потомство, однако, преобладающая часть минорной субпопуляции представлена вирионами, у которых Daf- признак не наследуется (фенотипические Daf- варианты). Одним из возможных объяснений наблюдавшегося явления может быть модификационная (ненаследуемая) изменчивость за счёт внутритиповой транскапсидации. Проведенные ранее расчеты скорости накопления мутантов в клонированной популяции EV11 [10, 112] и имеющиеся данные литературы о скорости накопления внутриклеточного пула РНК у энтеровирусов [13] позволяют с достаточным основанием утверждать, что образование «химерных» вирионов в инфицированной клетке является результатом одновременной трансляции консенсусного и мутантного генома с последующей инкапсидациеи daf+ РНК в Daf- капсид в результате дизъюнктивной репродукции. Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать в пользу участия в патогенезе энтеровирусной инфекции особой субпопуляции энтеровирусов, образующейся в результате эффекта транскапсидации или "фенотипического смешивания" за счет своеобразной маскировки рецепторной специфичности, позволяющей вирусной субпопуляции с консенсусным геномом преодолевать тканевые барьеры за счет мутантного капсида.