Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 5 1.
Структурно-функциональная организация транскрипционного аппарата бактерий
Этапы формирования транскрипционного комплекса
Зависимость генной экспрессии от регуляторных белков (факторов транскрипции) 18
Современные методы исследования регуляции транскрипции
Влияние топологии двойной спирали и пространственной упаковки бактериальной ДНК на транскрипцию
Белки нуклеоида как глобальные регуляторы транскрипции
Регуляция экспрессии гена dps 1.
Заключение по обзору литературы
Материалы и методы
Компьютерные программы и алгоритмы
Бактериальные штаммы и условия культивирования
Выделение геномной ДНК E. coli 44
Амплификация участков регуляторной области гена dps
Получение радиоактивно меченных олигодезоксрибонуклеотидов
Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле
Экстракция фрагментов ДНК из полиакриламидного геля
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК по Максаму-Гилберту 47
8. Оценка способности фрагментов ДНК к образованию комплексов с а РНК-полимеразой E. coli 9.
10. Определение транскрипционной активности промоторов in vitro 48
11. Клонирование промотор-со держащих фрагментов в вектор рЕТ28Ь-EGFP з
Выделение суммарной клеточной фракции РЕК
13. Реакция удлинения праймера in vivo 51
14. Количественная ПЦР (qRT-PCR) 51
15. Измерение активности промоторов в репортерном векторе, содержащем ген (3-галактозидазы
Эксперименты «pull-down» 54
«DNA-sampling» 55
Суперпродукция белков Dps и CRP в клетках E. coli 56
Очистка рекомбинантного белка Dps 57
Локализация сайтов взаимодействия белка Dps с фрагментами ДНК 57
Электрофоретическое фракционирование белков
Задержка комплексов фрагментов ДНК с очищенным белком Dps
Исследование структурно-функциональной организации регуляторной области гена dps 2. Оценка функциональной активности предсказанных промоторов in vitro и in vivo
Влияние дополнительных промоторов на экспрессию гена dps в стрессовых
4. Исследование возможности участия белка Dps в регуляции экспрессии гена dps
5. Поиск регуляторов, учавствующих в модуляции экспрессии гена DPS
Список публикации по теме диссертации
Список литературы
Благодарности
- Современные методы исследования регуляции транскрипции
- Белки нуклеоида как глобальные регуляторы транскрипции
- Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле
- Электрофоретическое фракционирование белков
Введение к работе
Актуальность проблемы
Белок Dps играет важнейшую роль в адаптации бактериальных клеток к различным стрессам, в том числе к аминокислотному голоданию при переходе бактерий к стационарному росту. Его уникальной особенностью является сочетание двух трудно совместимых функциональных активностей: ферментативное окисление двухвалентного железа с разложением гидропероксида и компактизация бактериальной хромосомы, для которой опасно соседство с активными формами кислорода [Almiron et al., 1992; Zhao et al., 2002]. Свойства самого белка интенсивно изучались на протяжении последних десятилетий, однако регуляция экспрессии его гена, по-прежнему, остается не до конца понятной.
Известно, что транскрипция гена dps запускается под действием широкого спектра химических и физических факторов, однако имеющиеся данные о механизмах активации не могут объяснить большую часть регистрируемых изменений. До начала этой работы в регуляторной области гена dps был картирован один промотор, распознаваемый двумя разными сигма-субъединицами РНК-полимеразы. Вблизи него расположены сайты для взаимодействия с 5 регуляторными белками, два из которых стимулируют транскрипцию в ответ на окислительный стресс и при переходе к стационарному росту, а три являются репрессорами и блокируют транскрипцию во время быстрого роста клеток [Salgado et al., 2013]. Однако внутри регуляторной области гена dps компьютерный алгоритм PlatProm предсказал ещё 4 промотор-подобных сайта, удалёных от ATG кодона и способных модулировать экспрессию гена dps в ответ на изменение внешних факторов. Задачей исследования было изучение их функциональных свойств, роли в регуляции транскрипции гена dps и поиск регуляторных белков, способных влиять на активность дополнительных промоторов. Актуальность исследования обусловлена фундаментальной значимостью понимания особенностей экспрессии генов, контролируемых множественными промоторами и уникальным сочетанием функциональных свойств у белка Dps.
Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы было изучение особенностей регуляции гена dps в клетках Escherichia coli (E.coli). Конкретными задачами были:
-
Исследование структурно-функциональной организации промоторной области гена dps.
-
Оценка возможности участия белка Dps в регуляции гена dps.
-
Поиск новых регуляторов экспрессии гена dps.
Научная новизна работы
Впервые установлено, что в регуляторной области гена dps есть дополнительные промоторы, способные взаимодействовать с РНК-полимеразой и инициировать синтез РНК. Несмотря на низкую активность, они необходимы для максимальной экспрессии гена, причём вклад дополнительного промотора P3
оказался непропорционален его собственной транскрипционной активности. Это предполагает возможность функционирования РНК-полимеразы на некоторых промоторах не только в качестве фермента транскрипции, но и в качестве регуляторного белка, влияющего на экспрессию соседних промоторов.
Впервые показано, что белок Dps способен селективно связываться с промоторами своего гена и участвовать в регуляции его экспрессии, играя роль активатора или репрессора.
В регуляторной области гена dps впервые обнаружены потенциальные сайты связывания для 11 новых факторов транскрипции. Взаимодействие с нею впервые зарегистрировано для двух регуляторов клеточного метаболизма -глобального CRP и специфического ExuR. Так как ген dps кодирует структурный белок нуклеоида с ферментативной ферроксидазной активностью, зависимость его экспрессии от метаболических регуляторов не является тривиальной. Потенциальные сайты связывания CRP и картированные сайты связывания ExuR находятся вблизи дополнительных промоторов. Филогенетический анализ этой области предполагает её появление в геноме E. coli в результате горизонтального переноса. Поэтому функциональная организация промоторной области гена dps может быть результатом адаптивной ассимиляции чужеродного генетического материала, которая предоставила кишечной палочке возможность оперативного сопряжения метаболический статус клетки со структурным состоянием генома.
Научно-практическое значение работы
Ключевая роль Dps в упаковке бактериальной хромосомы и защите генома от повреждающих факторов предполагает зависимость экспрессии его гена от малейших изменений в режиме роста. В работе впервые было показано, что эта зависимость в значительной степени опосредована дополнительным промотором Р3, который вносит существенный вклад в модуляцию транскрипции гена в стрессовых условиях. В процессе выполнения работы было создано несколько промоторных конструкций, которые в сочетании с геном репортёрного белка GFP позволяют детектировать минимальные изменения в условиях роста, что делает возможным их использование в качестве биосенсоров. Информация о белках, регулирующих транскрипцию гена dps в зависимости от скорости роста, делает возможным управляемое снижение его экспрессии. Замедляя переход клеток к стационарному росту, т.е. увеличивая время продуктивного биосинтеза, это может оказаться полезным для промышленной биотехнологии. Т.к. обнаруженные в работе дополнительные промоторы необходимы для максимальной экспрессии гена dps, их введение в промышленные вектора может улучшить систему для суперпродукции рекомбинантных белков в клетках E.coli под контролем промотора Pdps, предложенную в работе [Sethia et al., 2014].
Апробация работы
Результаты работы были представлены на XXII зимней школе-конференции молодых ученых «Перспективные направления Физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010), 14 и 18 Пущинских международных школах-конференциях молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2010 и 2014 г.), 2ом Международном форуме по биотехнологии “EurasiaBio-2010”
(Москва, 2010), съезде EMBO (Барселона, 2010), 2ом международном семинаре по биологии и физике бактериальной хромосомы (Бирмингем, 2014), а также на 6-ом конгрессе FEMS (Маастрихт, 2015). Работа также докладывалась на внутренних семинарах лаборатории функциональной геномики и клеточного стресса ИБК РАН. По материалам диссертации было опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе, 5 статей в реферируемых журналах и 1 статья в сборнике.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 271 источник. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста и содержит 37 рисунков и 3 таблицы.
Современные методы исследования регуляции транскрипции
Транскрипция у эубактерий осуществляется РНКП, которая существует в двух состояниях: кор-фермент и холофермент. В первом состоянии РНКП включает в себя 5 высоко консервативных субъединиц (о РР ю), которые имеют высокий уровень гомологии с субъединицами РНКП как архей, так и эукариотических организмов. Кор-фермент (Е) осуществляет синтез РНК на ДНК-матрице, однако не способен узнавать промоторные последовательности, которые обеспечивают стабильное связывание фермента на ДНК, необходимое для инициации транскрипции. Фактором промотор-специфичности являются а-субъединицы, входящие в состав холофермента (EG). Именно они ответственны за связывание холофермента с промоторной областью а также за плавление ДНК в месте контакта, с-субъединицы имеют ДНК-связывающий мотив «спираль-поворот-спираль», который контактирует с обеими цепями ДНК, но после инициации транскрипции они диссоциирует из комплекса РНКП-ДНК-мРНК.
В клетках Е. coli имеется семь а-факторов [Ishihama, 2012]. Фактор а отвечает за экспрессию большинства генов во время экспоненциального роста - генов «домашнего хозяйства». Остальные а-факторы, часто называемые альтернативными, необходимы клетке для экспрессии специализированных генов, обеспечивающих адаптацию бактериальных клеток к стрессовым условиям. Большинство альтернативных факторов похожи на а как генетически, так и структурно, кроме одного - а , который использует особые механизмы образования отрытого комплекса [Gruber, Gross, 2003]. Фактор а (с ) необходим для экспрессии генов на стационарной фазе роста и в условиях разных стрессов; с (а ) включается при росте бактерий в среде, обедненной азотом, а (а ) - в ответ на тепловой шок, a28 (ар) контролирует гены, отвечающие за клеточную подвижность и хемотаксис, а24 ( тЕ) отвечает за экспрессию генов в условиях роста при экстремально высоких температурах и включается в ответ на появление в клетках денатурированных белков, а с19 ( /ecI ) активирует транскрипцию пока только одного гена (feci), белковый продукт которого принимает участие в транспорте ионов железа [Gaal et al, 2006; Grainger, Busby, 2008].
Таким образом, процесс транскрипции начинается с того, что холофермент РНКП узнает сигнальные элементы в промоторной ДНК, после чего фермент связывается с промотором, и образуется транскрипционный комплекс. Именно на этой стадии обычно осуществляется первый этап регуляции генной экспрессии.
Связавшись с промотором, РНКП формирует так называемый «закрытый» промоторный комплекс, отличительной особенностью которого является сохранность двуспиральной структуры ДНК. Закрытый комплекс не способен к синтезу РНК, он нестабилен (время его жизни 10 с) и легко диссоциирует при повышении ионной силы или в присутствии конкурентов - гепарина и poly d(A) [Tsodikov et al, 1998].
Для инициации синтеза РНК необходимо образование открытого» промоторного комплекса. Процесс перехода от «закрытого» к «открытому» комплексу включает серию последовательных конформационных превращений, приводящих к локальному плавлению ДНК вблизи точки старта [Вис, McClure, 1985; Tsodikov et al., 1998]. При этом а-субъединица образует специфические контакты с нематричной нитью элемента -10 [Huang et al., 1997]. Время жизни «открытого» промоторного комплекса гораздо больше, чем «закрытого», и в среднем составляет 200 и более секунд [Craig et al, 1995], но процесс образования «открытого» комплекса тоже является обратимым. Стабильность «открытого» комплекса обычно падает с увеличением ионной силы, так как это повышает стабильность двойной спирали ДНК, РНКП становится труднее удерживать комплекс в "раскрытом" состоянии и равновесие сдвигается в сторону «закрытого» комплекса. Образование «открытого» (RPo) комплекса в упрощенном виде можно представить следующей схемой: R + Р - RPc - RPo, где R - РНКП, Р - промотор, RPc - «закрытый» промоторный комплекс. Однако было показано, что переход «закрытого» комплекса в «открытый» включает как минимум одну дополнительную стадию. Модель, наиболее полно отражающая конформационные перестройки, происходящие при взаимодействии РНК-полимеразы с промотором, может быть представлена в виде следующей схемы [de Haseth et al, 1998; Haugen
В соответствии с этой схемой, взаимодействие РНКП с промотором начинается с формирование «закрытого» комплекса первого типа (RPci). При этом образуется ряд промотор-специфических и неспецифических связей, которые, однако, не приводят к существенным конформационным изменениям в структуре ДНК и РНКП. Значительные конформационные перестройки происходят при переходе к закрытому комплексу второго типа (RPc2), когда вокруг двуцепочечной ДНК образуется белковый канал из (3- и (3 -субъединиц РНКП [Polyakov et ah, 1995]. Переход от RPc2 к открытому промоторному комплексу (RPoi) сопровождается локальным плавлением ДНК вблизи точки инициации транскрипции и дальнейшими изменениями в конформации РНКП, что приводит к расширению области контакта ДНК с ферментом. Показано, что присутствие ионов Mg + увеличивает размер локально расплетенного участка [Suh et ah, 1992, 1993; Zaychikov et ah, 1997].
К одной из расплетенных цепей ДНК могут присоединяться гетероциклические группы инициирующих субстратов (рибонуклеозидтрифосфатов, NTP). В этом случае становится
Присоединение инициирующих субстратов может быть причиной дополнительных конформационных превращений, определяющих относительную эффективность абортивного и продуктивного синтеза. При абортивном синтезе образуются короткие олигонуклеотиды длиной от 2 до 11 нуклеотидов, а холофермент остается связанным с промотором. Если же синтез РНК не был прекращен после присоединения первых 8-11 нуклеотидов, начинается продуктивный синтез РНК. При этом о-фактор обычно отсоединяется от РНК-полимеразы, существенно уменьшается поверхность контакта с ДНК, и инициирующий комплекс трансформируется в элонгирующий [Krummel, Chamberlin, 1989]. Gre-белки могут стимулировать переход полимераза-промоторных комплексов от инициации к элонгации путем предотвращения преждевременного освобождения продуктов абортивного синтеза [Goldman et ah, 2009]. Gre-белки, а также ряд других транскрипционных регуляторов (DksA, TraR, Rnk, ppGpp), связываются с РНКП в так называемом вторичном канале, образуемом аминокислотными остатками (3- и (3 -субъединиц при конформационном переходе комплекса к RPC2 [Borukhov, Severinov, 2002].
С энергетической точки зрения процесс формирования транскрипционно-компетентного «открытого» комплекса может быть описан как «связывание- изомеризация -плавление». Закрытый комплекс занимает участок ДНК, начиная с позиции -55 до +1 (стартовая точка транскрипции); при этом ДНК остается двунитевой. Затем этот комплекс подвергается изомеризации, при которой происходят конформационные перестройки как в молекуле ДНК, так и в ферменте. Протяженность промежуточного комплекса RPci несколько больше - он достигает позиции +12, при этом в позиции -10 происходит частичное плавление цепей ДНК. В отрытом комплексе ДНК расплавлена на участке от -11 до +3, а сам комплекс занимает еще 20 оснований ниже стартовой точки транскрипции [Record et ah, 1996; Helmann, deHaseth, 1999]. Продвижение транскрипционного комплекса до точки начала транскрипции происходит без дополнительных затрат энергии в виде АТФ [Haugen et al, 2008].
Белки нуклеоида как глобальные регуляторы транскрипции
HU - это высококонсервативный белок, контролирующий конфигурацию ДНК. Он состоит из двух субъединиц, Ниа и Ни[3, которые на 70% идентичны друг другу. В клетках кишечной палочки он может существовать как в форме гомодимеров, так и гетеродимеров, в зависимости от фазы роста [Claret, Rouviere-Yaniv, 1997]. Белок HU неспецифически связывается с ДНК, хотя имеет некоторую избирательность в отношении нестабильных участков ДНК, таких, например, как изгибы двойной спирали [Castaing et ah, 1995]. Он использует для этого структурный модуль, аналогичный ДНК-связывающему домену IHF и принимает участие в рекомбинации и поддержании топологии ДНК [Broyles, Pettijohn, 1986]. HU может влиять на экспрессию широкого спектра генов, включая гены дыхательных и метаболических путей [Oberto et ah, 2009] и взаимодействует с топоизомеразой I, что приводит к изменению суперскрученности ДНК и, следовательно, к модуляции генной экспрессии [Dillon, Dorman, 2010]. Кроме того, этот белок может взаимодействовать с иницициатором репликации DnaA, т.е. способствовать началу синтеза новой копии ДНК. Согласно рентгеноструктурным данным, белок HU может формировать мультимеры, состоящие из октамеров. Это позволило предложить модель его взаимодействия с ДНК (Рис. 41). Согласно этой модели, в низкой концентрации HU индуцирует одиночные изгибы двойной спирали ДНК, а в высокой концентрации он образует филаменты, на которые может быть накручена отрицательно спирализованная ДНК [Guo, Adhya, 2007]. Внутриклеточная концентрация HU варьирует от 30000 во время логарифмической фазы роста до 15000 в условиях стационарного роста. Однако экспериментального подтверждения данной гипотезы пока не получено. В дополнение к своему влиянию на суперспирализацию ДНК, белок HU влияет на ее гибкость, при низких концентрациях локально понижая жесткость контактирующего с белком участка ДНК, а при высоких концентрациях, наоборот, повышая её [Luij sterburg et ah, 2008]. Благодаря этим свойствам, он играет важную роль в формировании петель, которые определяют и эффективность транскрипции, и архитектуру нуклеоида [Becker et ah, 2007]. HU может конкурировать с другим белком нуклеоида H-NS, также стимулирующим формирование петель [Dillon, Dorman, 2010].
H-NS (Histone like nucleoid-structuring protein) - это гистоноподобный белок, который играет ключевую роль в организации ДНК во время экспоненциального роста, образуя ДНК-белковые мостики между петлями ДНК [Lucchini et ah, 2006; Dorman, 2007]. Кроме этого, НNS является глобальным регулятором, в регул он которого входят почти две сотни генов. Он играет значительную роль в адаптации бактерий к новым условиям окружающей среды [Hinton et ah, 1992; Dame et ah, 2006]. Считается, что H-NS отвечает за блокирование транскрипции горизонтально перенесенных генов, поэтому в литературе его часто называют “genome sentinel” (геномный страж) [Kahramanoglou et ah, 2011]. Белок H-NS относительно небольшой (137 аминокислот, 15,5 кДа) и функционирует в виде димера. Он может связывать ДНК двумя способами: in trans — связывая два удаленных участка ДНК; и in cis — связывая последовательные сайты на одном и том же участке [Schneider et ah, 2001; Janga et ah, 2009]. Считается, что первый димер H-NS связывает специфический сайт, а затем дополнительные димеры связываются с прилегающей к нему области [Schneider et ah, 1997; Grainger et ah, 2006, Oshima et ah, 2006]. Мишенью для H-NS являются А/Т-богатые области, имеющие консенсус tCGATAaAtt. Аналогично гистоновым белкам эукариот, во взаимодействии участвуют аргинины его С-концевого домена, которые формируют контакты с малой бороздкой ДНК. Такие контакты часто образуются в местах формирования доменных петель на хромосоме [Noom et ah, 2007]. Опосредованное H-NS образование петель на ДНК чувствительно к присутствию солей магния, поскольку при низких концентрациях ионов Mg белок олигомеризуется, и формирования белок-ДНК-белковых мостиков не происходит. Такие мостики могут задерживать продвижение РНКП и ингибировать транскрипцию [Chintakayala et ah, 2015]. H-NS имеет множество гомологов, которые имеют сходный механизм узнавания и связывания ДНК, а также часто содержат консервативный мотив в активном центре Q/RGR [Joyeux, Vreede, 2013]. Паралогом H-NS у Е. coli, например, является белок StpA.
Fis (Factor for inversion stimulation). В активно растущих клетках содержится порядка 60 000 молекул белка Fis, однако на стационарной фазе его содержание снижается практически до нуля. Экспрессия Fis индуцируется при высокой степени суперспирализации ДНК, во многом за счет саморегуляции на транскрипционном уровне [Travers et ah, 2001; Ishihama, 2010]. Fis контролирует ряд генов трансляционного аппарата (рРНК, тРНК и гены рибосомных белков), генов вирулентности, формирования биопленок, ферментов энергетического метаболизма, клеточного ответа на стресс, подвижности и хемотаксиса, а также генов биосинтеза аминокислот и углеводного метаболизма [Ishihama, 2009]. Он может выступать как в роли активатора, так и репрессора транскрипции. Fis связывается с частично симметричными участками ДНК, как правило, А/Т-богатыми и чаще всего расположенными в межгенных областях. ДНК-связывающий модуль Fis имеет мотив «спираль-поворот-спираль» и, следовательно, взаимодействуя с большой бороздкой ДНК, Fis способен узнавать специфические последовательности оснований. Но консенсус для сайтов связывания этого белка очень вырожден: G—wwwwww-AC (w=a=t). При связывании с ДНК Fis изгибает ее и тем самым влияет на эффективность транскрипции, а также способствует компактизации нуклеоида [Ishihama, 2009]. Этот белок часто формирует ДНК-белок-ДНК мостики и способствует поддержанию транскрипционной активности определенных локусов [Schneider et ah, 2001]. Fis стимулирует инициацию репликации через взаимодействие с DnaA и влияет на распределение топоизомераз на хромосоме. Было показано, что в делеционных мутантах по fis повышена отрицательная спирализация ДНК на стационарной фазе роста [Kahramanoglou et ah, 2011]. Fis может выступать в роли репрессора углеводного метаболизма, так как его сайты связывания частично перекрываются с сайтами связывания глобального регулятора CRP [Browning et ah, 2005; Galn et ah, 2008].
StpA (Suppressor of ttf phenotype A) - это белок нуклеоида, вьшолняющий несколько функций. Он может выступать в роли репрессора транскрипции ряда генов [Wolf et ah, 2006] и шаперона [Grossberger et ah, 2005; Mayer et ah, 2007], а также участвовать в упаковке генома, формируя в комплексах с ДНК плотные филаменты [Lim et ah, 2012]. StpA играет важную роль в утилизации гликозидов, гомологичной рекомбинации и предотвращении повреждений блеомицином [Free et ah, 1998, 2001; Shiraishi et ah, 2007]. Также было показано, что он может быть вовлечен в регуляцию экспрессии трибутилтин-индуцируемого оперонаygaVP [Gueune et ah, 2008]. Экспрессия гена stpA негативно регулируется самим белком StpA [Wolf et ah, 2006]. При этом на сегодняшний день не обнаружено ни одного активатора его экспрессии. Механизм упаковки генома белком StpA сходен с таковым для белка H-NS, однако StpA обладает существенно большим сродством к ДНК и особенно к ее изогнутым участкам [Zhang, Belfort, 1992; Shi, Bennett, 1994; Sonnenfield et ah, 2001]. Он связывается преимущественно с характерными для промоторных областей А/Т-богатыми последовательностями ДНК, но без выраженного консенсуса. В ряде исследований было показано, что StpA может комплементировать делецию гена hns и аналогичным образом регулировать гены, находящиеся под контролем H-NS. Однако, молекулярные механизмы этого процесса пока остаются не выясненными [Sonden, Uhlin, 1996, Uyar et al, 2009]. Суперпродукция StpA в клетках может подавлять активность H-NS - так же, как и H-NS может ингибировать активность StpA. Эти белки могут образовывать гетеродимеры, связываясь друг с другом посредством N-концевых доменов. При этом блокируется доступ к чувствительному к Lon-протеазам междоменному линкеру, и белки приобретают устойчивость к протеолитической деградации [Johansson et al, 2001]. StpA может образовывать гетеродимеры и с другими белками, такими как Hha и YdgT [Paytubi et al, 2004]. N-концевой домен белка StpA отвечает за его димеризацию, а С-концевой домен - за взаимодействие с РНК-мишенями. Выступая в роли шаперона, он может локально расплавлять вторичную структуру РНК, тем самым снижая ее стабильность. Примером такой активности может служить ингибирование малой регуляторной PHKMicF [Deighan et al, 2000; Delihas, Forst, 2001].
Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле
Индукцию закодированной в pACBSR-DLl мегануклеазы проводили добавлением в среду 0,2% арабинозы с последующей инкубацией в течение 20 минут. На этой стадии идёт биосинтез мегануклеазы, которая вырезает исследуемый участок из pRW902 по сайтам Seel (см. Рис. 11), делая возможным взаимодействие белков с фрагментом непосредственно в
Затем клеточную культуру центрифугировали 15 минут при 18000 об/мин. Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCb, 10% сахарозы, 0,1% Triton Х100, 200 мкг/мл PMSF. Затем к пробам добавляли РНКазу А (Fermentas, Литва) до конечной концентрации 150 мкг/мл и лизоцим (Sigma, США) до конечной концентрации 200 мкг/мл. После этого клетки разрушали ультразвуком 3 раза по 30 секунд на льду. Клеточные обломки и нерастворимые белки осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 4С на 18000 об/мин. Для специфической сорбции исследуемого фрагмента ДНК со связанным регуляторними белками к 10 мл полученного клеточного лизата добавляли 20 мг магнитных частиц Dynabeads М-270 Ероху (Invitrogen, Life technologies, Норвегия), покрытых anti-FLAG антителами (Pierce, США) согласно протоколу производителя. Пробы инкубировали при 4С на вращающейся платформе в течение 30 минут. Содержащийся выше исследуемого промотора /ас-оператор (Рис. 11) связывался с Lad, который в данном штамме сшит с последовательностью FLAG. LacLFLAG, в свою очередь, взаимодействовал с пришитыми к магнитным шарикам anti-FLAG антителами. Для освобождения от неспецифически связавшихся белков магнитные частицы промывали 5 раз буфером, содержащем 20 мМ HEPES рН 7,4, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween 20. Специфически связанные белки смывали с шариков буфером, содержащим 0,1 М NaHCCh, и идентифицировали с помощью хромато-масс-спектрометрии LC/MS (liquid chromatography-mass spectrometry) в CRG/UPF Proteomics Unit (Барселона, Испания). Контролем служили магнитные частицы, проикубированные с клеточным лизатом не содержащего плазмид штамма Escherichia coli К12 MG1655 lacI-FLAG.
В качестве основы для создания вектора для суперпродукции белка Dps был использован вектор pGEMEX-1 [Igarashi, Ishihama, 1991]. Ген dps был амплифицирован с геномной ДНК Е. coli К12 MG1655 с помощью праймеров dpsforw и dpsrev (Табл. 2), содержащих сайты Xbal, и поставлен под контроль индуцируемого промотора фага Т7. Полученный вектор был проверен на отсутствие мутаций прямым секвенированием и назван pGEMdps [Покусаева и др., 2012]. Трансформированные полученной плазмидой клетки BL21(DE3) выращивали до ранней экспоненциальной фазы (ОБбоо=0,4) в 10 мл жидкой среды LB с ампициллином (100 мкг/мл, рН 7,4), после чего индуцировали синтез рекомбинантного Dps добавлением IPTG в концентрации 0,02 мМ, 0,1 мМ и 1 мМ и инкубировали клетки при 37С на протяжении 2-8 часов.
Белок cAMP-CRP был индуцирован аналогичным образом с использованием вектора pET28b_CRP (см. Табл. 1). Эффективность индукции в обоих случаях проверяли с помощью денатурирующего электрофореза белков в полиакриламидном геле. Клетки осаждали центрифугированием, отмывали от среды буфером ТЕ (ЮмМ Tris-HCl рН 8,0, 1мМ EDTA) и ресуспендировали в буфере для нанесения.
Рекомбинантный белок Dps получали как описано в [Покусаева и др., 2012]. Клетки BL21 (DE3), трансформированные полученной плазмидой pGEM-dps, выращивали на чашках Петри с агаризованной средой LB и в колбах со средой LB (рН 7,4) при температуре 37С в присутствии ампициллина (100 мкг/мл). Индукцию белка проводили при ОБбоо 0,4-0,6 добавлением в клеточную культуру 0,02 мМ IPTG, после чего клетки выращивали еще 12 часов при 37С. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 10 000 rpm (+4С) и отмывали два раза от среды холодным 0,01 М Tris-HCl буфером, рН 8,0. Затем клетки ресуспендировали 3 мл охлажденного лизисного буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0); 1 мМ EDTA; 0,1 М NaCl. Клеточную массу разрушали добавлением лизоцима (3 мг/мл), PMSF (4 мкМ) и дезоксихолата натрия (0,0016%) с последующей ультразвуковой дезинтеграцией в течение 1 минуты на дезинтеграторе УРСК-7Н-18. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 13000 g в течение 10 минут. Полученный лизат наносили на ионообменную колонку БЕАЕ-Сефадекс-А25 (Sigma-Aldrich, США), предварительно уравновешенную элюирующим буфером, содержащим 50 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,1 мМ EDTA, 0,1 мМ DTT и разделяли на хроматографической системе LKB. Для элюции был использован градиент концентраций NaCl от 50 до 700 мМ, скорость элюции составляла 20 мл/ч. Фракции, содержащие целевой белок, подвергали дальнейшей очистке с помощью гель-фильтрации на сефадексе G200 (Pharmacia, Швеция). Перед этим белок осаждали сульфатом аммония (конечная концентрация 90%) в течение 30 минут при 0С. Полученный раствор наносили на колонку и осуществляли элюцию буфером, содержащим 500 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,01 мМ EDTA, со скоростью 20 мл/ч. Затем белок концентрировали на колонках Vivaspin 20 (Sartorius, Германия) с порами, пропускающими белки массой менее 10 кДа, и диализовали против буфера, содержащего 50 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,01 мМ EDTA. Концентрацию очищенного белка определяли с помощью спектрофотометра Nanodrop ND-1000 (ND Technologies, USA).
Для локализации мест связывания очищенного белка Dps с промоторной ДНК использовали метод футпринтинга ДНКазой I. Для этого предварительно помеченные [у- Р] промотор-содержащие фрагменты инкубировали 20 минут при 37С в 30 мкл 1х-транскрипционного буфера для стабилизации структуры. Затем к опытным образцам добавляли очищенный белок Dps в 2х-, 5х- или 10х-кратном избытке по сравнению с количеством ДНК (оптимальный избыток определяли по эффективности связывания промотор-содержащего фрагмента с белком, предварительно оцененной методом задержки в геле) и инкубировали образцы при такой же температуре в течение 20 минут. После этого к пробам добавляли панкреатическую ДНКазу I до концентрации 1 мкг/мл, выдерживали 25 секунд и останавливали реакцию равным объемом 8 М ацетата аммония. Продукты гидролиза осаждали 2,5 объёмами этанола, оставляли на 12-14 часов при -20С и центрифугировали. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали, растворяли в 5 мкл формамидного буфера и анализировали в 8% денатурирующем полиакриламидном геле.
Электрофоретическое фракционирование белков
Для проверки этих предсказаний был осуществлен экспериментальный поиск факторов транскрипции, ассоциированных с регуляторной областью гена dps, с помощью метода «DNA-sampling». Использованный ранее метод «pull-down» позволил нам доказать взаимодействие белка Dps со своей регуляторной областью (Рис. 31), но при этом мы не обнаружили ни одного из известных регуляторов гена dps, что явно свидетельствует о недостатках метода. В экспериментах «pull-down» используется искусственно синтезированный в большом количестве фрагмент ДНК, который вступает в реакцию комплексообразования в связанном с магнитными шариками виде. При добавлении лизата, с ДНК-мишенями связываются все белки, имеющие к нему сродство, и эффективность этого взаимодействия напрямую зависит от их относительных концентраций. Т.е. этим методом можно определить только способность фрагмента связываться с клеточными белками, а для того, чтобы найти белки, которые реально взаимодействуют с данным участком ДНК в клетке, более подходит метод ДНК-сэмплинга («DNA-sampling») (более подробное описание см. в разделе Материалы и Методы). Он, в принципе, позволяет идентифицировать все белки, связанные с исследуемым фрагментом в условиях in vivo.
Для тестирования была взята вся регуляторная область гена dps (праймеры 2-3). Все белки, связавшиеся с исследуемым участком, были идентифицированы с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии LC/MS. В качестве контроля специфичности связанных белков был использован спектр белков, ассоциированных с покрытыми anti-FLAG антителами магнитными шариками после их инкубации с лизатом клеток Е. coli К12 MG 1655 дикого типа и его /ac/:FLAG производного, трансформированных плазмидой pRW902 без вставки промоторной области dps.
В результате анализа данных масс-спектрометрии среди белков, специфически взаимодействующих с регуляторной областью dps в клетке, был обнаружен один полноразмерный белок - регулятор двойного действия MetR (Табл. 3). Он регулирует гены биосинтеза аминокислоты метионина, которая инициирует трансляцию у прокариот. В отсутствие метионина MetR уходит с репрессируемых промоторов, запуская тем самым транскрипцию генов, отвечающих за его биосинтез. Не исключено, что MetR связывается с регуляторной областью гена dps, тоже в качестве репрессора, для того, чтобы предотвратить или замедлить конденсацию нуклеоида и остановку роста бактерии при наличии аминокислот. То есть, MetR в данном случае может играть роль одного из факторов, сопрягающих метаболический статус клетки и активность генома.
К сожалению, среди полностью идентифицированных белков опять не оказалось ни одного из известных регуляторов экспрессии гена dps и не оказалось Dps. Поэтому более детальному анализу были подвергнуты все идентифицированные в высокой концентрации пептиды, которые представляли собой фрагменты следующих регуляторов транскрипции: SdiA, cAMP-CRP, ExuR, LysR, FNR, ZraR, DeoR, EvgA, GntR, MntR, NhaR. С помощью такого подхода нам удалось обнаружить известный ранее репрессор гена dps MntR, а также некоторые из предсказанных с помощью Virtual Footprint потенциальные регуляторы с известными консенсусными последовательностями, такие как CRP, NhaR и GntR. Но среди них тоже не оказалось белка Dps, что, по-видимому, свидетельствует об относительно низком сродстве этого белка к собственной промоторной области, по крайней мере, во время экспоненциального роста клеток.
Тем не менее, мы обнаружили, что с регуляторной областью dps, кроме MetR, могут связываться и другие регуляторы метаболических генов, в частности генов углеводного метаболизма. Это было не совсем ожидаемо, поэтому мы решили проверить, действительно ли cAMP-CRP, имеющий два потенциальных сайта связывания вблизи промоторов Рз и Pi (Рис. 33, Таблица 3), может взаимодействовать с содержащими эти сайты фрагментами ДНК. Для этого белок cAMP-CRP был клонирован в плазмиду рЕТ28Ь под контроль индуцируемого промотора фага Т7. Полученный вектор был трансформирован в клетки Е. coli BL21 (DE3) (см. Таблицу 1) и подобраны оптимальные условия для суперпродукции белка.
Рис. 34. А: Электрофоретическое фракционирование клеточных лизатов, полученный после индукции экспрессии гена сгр в трансформированных плазмидой pET28b_CRP клетках Е. co7i BL21 (DE3). В качестве контроля были использованы клетки Е. coli BL21 (DE3), не содержащие плазмиды с сгр. Б: Электрофорез с задержкой в геле комплексов, формируемых указанными фрагментами регуляторной области гена dps с лизатом клеток, после индукции биосинтеза CRP 0.1 мМ IPTG. Гель был окрашен бромистым этидием и визуализирован на трансиллюминаторе.
Итог оптимизации показан на Рис. 34А. Видно, что CRP составлял более 80% от всех белков клеточного лизата при индукции как 0.1 мМ, так 1 мМ IPTG. Поэтому для эксперимента была использована меньшая концентрация индуктора. Затем был приготовлен лизат клеток с суперпродуцированным CRP и использован для тестирования возможности формирования комплексов с теми же фрагментами регуляторной области dps, которые были использованы ранее для проверки способности связываться с Dps (Рис. 32). Результаты эксперимента с задержкой в геле комплексов двух участков промоторной области dps с CRP показаны на Рис. 34Б.
В соответствии с тем, что сайты связывания CRP были предсказаны как на промоторе Рз, так и вблизи промотора Pi (Рис. 33), вошедший в гель комплекс виден с фрагментом, содержащим все промоторы между праймерами 1 и 9. Его специфичность была подтверждена с помощью Western-блот-гибридизации с антителами к белку CRP (результаты не показаны). Убыль свободной ДНК при увеличении концентрации белка свидетельствует о возможном контакте CRP и со вторым фрагментом ДНК, содержащим Pdps и Pai (праймеры 7 87 и 10). Так как убыли свободной ДНК при добавлении контролвного лизата (дорожки «К») не наблюдалось, этот контакт может быть опосредован другими регуляторами гена dps (Рис. 12), например Fis и H-NS, которые присутствуют в клетках в больших количествах.
Неожиданной находкой среди пептидов, ассоциированных с регуляторной областью гена dps, оказались фрагменты регулятора ExuR, контролирующего транспорт и метаболизм галактуроната и глюкуроната. Его связывание с промоторами Рз и Рг (Рис. 35) подтверждают данные ChlP-seq с антителами к белку ExuR, при котором все участки ДНК, образовавшие комплексы с ExuR в клетке были собраны с помощью соответствующего антитела подвергнуты прямому секвенированию.
Распределение «прочтений» вдоль регуляторной области dps, полученных в результате секвенирования на платформе Illumina HiSeq фрагментов ДНК, экстрагированных из клеток E.coli в виде комплексов с белком ExuR и собранных антителами к белку ExuR. (Эксперимент выполнен М.Н. Тутукиной).
Поскольку ExuR является регулятором метаболизма глюкуронатов и галактуронатов, то данный эксперимент был проведен при росте клеток на D-глюкозе как основном источнике углерода и D-глюкуронате. При сравнении левой и правой панели на Рис. 35 видно, что при росте клеток на глюкуронате характер взаимодействия ExuR с промоторной областью dps изменился. Сайт связывания ExuR вблизи Рг наблюдался в обоих случаях. При росте на глюкозе ExuR связывается ещё с одним сайтом, центр которого находится в позиции -41 от стартовой точки транскрипции промотора Рз. Именно в этом месте с помощью Virtual Footprint обнаруживается потенциальный сайт связывания регулятора глюконатного метаболизма GntR (Рис. 33). Поскольку ExuR принадлежит к этому же семейству регуляторов с характерным высококонсервативным консенсусным мотивом, то из-за отсутствия ExuR в базе данных Virtual Footprint можно допустить, что сайт связывания данного белка был предсказан и компьютерным методом, а с учетом высокого уровня гомологии всех белков семейства GntR, пептиды, атрибутированные масс-спектрометрически как “GntR-like” могут относиться к ExuR.
Расположение ExuR в позиции -41 относительно стартовой точки транскрипции Рз позволяет отнести его к активатору II класса. Для проверки этой гипотезы, а также для оценки влияния на экспрессию dps другого регулятора углеводного метаболизма, cAMP-CRP, с помощью метода qRT-PCR был оценен уровень dps-мРНК в клетках дикого типа, а также мутантных по генам crp и exuR. Поскольку оба эти белка являются регуляторами метаболизма Сахаров, то клетки выращивали на глюкозе или глюкуронате в качестве основного источника углерода. В остальном условия роста были идентичны использованным для анализа активности дополнительных промоторов гена и их реакции на изменения условий роста. В качестве контроля был использован ген hns, для которого ранее было показано отсутствие зависимости от сахара в среде, от исследуемых регуляторов, а также от уровня экспрессии антисмысловых РНК, расположенных в регуляторной области dps, который оставался неизменным во всех экспериментах.
Изменения уровня транскрипции с промоторов Рз-Pdps (праймеры 6 и 5) и, отдельно, Р3 (праймеры 1 и 8), зарегистрированные методом qRT-PCR. Показан относительный уровень мРНК. В качестве контроля были использованы клетки дикого типа К12 MG1655, растущие на глюкозе. Эксперименты проведены в трех биологических и двух технических повторностях.
Транскрипционная активность полного набора промоторов гена dps (образцы Рз-Pdps) явно возрастала при росте на глюкуронате по сравнению с ростом на глюкозе (зелёные столбики в первых двух группах). Эта стимуляция, как минимум, частично опосредована белком ExuR, т.к. его отсутствие практически полностью элиминировало активацию (красные столбики в этих же группах). На глюкозе, ExuR, напротив, выполнял ингибиторную функцию (красный и зелёный столбик в первой группе), что может говорить о вкладе этого белка в поддержание транскрипции dps на уровне, необходимом клетке в тех или иных условиях роста. CRP при этом выполнял роль активатора, независимо от условий роста (серые столбики в первых двух группах). Это хорошо согласуется с расположением его сайта с центром в позиции -46,5 относительно стартовой точки Pdps, что типично для активаторов II класса, которые связываются с UP-элементами промоторов и контактируют aCTD (Рис. 37).