Структура и функции генома вируса и разработка новых средств диагностики и профилактики ящура Перевозчикова, Наталья Александровна

Введение к работе

1.1 Актуальность темы. Ящур - острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, для которого характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению.

Широкий спектр восприимчивых животных, множество иммунологических типов и подтипов возбудителя, разнообразие путей выделения и распространения, способность длительное время сохраняться как во внешней среде, так и в организме животных - все это определяет необходимость дальнейшего изучения природы возбудителя с целью совершенствования имеющихся и разработки новых, более эффективных средств диагностики вируса и специфической профилактики этого особо опасного заболевания сельскохозяйственных животных.

В связи с изменением стратегии борьбы с ящуром все большее значение приобретает необходимость дальнейшего совершенствования методов диагностики с целью повышения специфичности методов прямого выявления и идентификации- вируса или его структурных компонентов непосредственно в патматериалах от больных животных.

С развитием методов молекулярной биологии и генной инженерии все шире используются для индикации возбудителя и диагностики заболевания такие методы как полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование и сравнительный компьютерный анализ установленных структур генома изолятов с ранее определенными для типирования выделенного вируса, установления возможного источника инфекции, а также изучения природы и эволюции возбудителя.

Характерным признаком этих методов является то, что в их основе лежит изучение особенностей структуры генома вируса и продуктов его

2 экспрессии - вирусных белков. Возможность применения этих методов определяется степенью изученности вируса и прежде всего наличием данных о нуклеотидной последовательности генома и генетической карты кодируемых им белков.

Сравнение установленных первичных структур жизненно-важных генов и кодируемых ими белков для вирусов, отличающихся по биологическим свойствам, дает основание для заключений о роли отдельных участков генома в проявлении тех или иных свойств вируса и также открывает возможность получать путем направленного мутагенеза генома или рекомбинации in vitro штаммы с ослабленной или полностью устраненной вирулентностью, обеспечивающие одновременную защиту как против различных типов одного вируса, так и против возбудителей, относящихся к различным таксономическим группам. -

- В последние годы особое внимание уделяется исследованиям молекулярной структуры белковой оболочки вируса, функции вирусных полипептидов, эпитопной структуры иммуногенных полипептидов, а также возможности направленного воздействия на геном возбудителя с использованием технологии рекомбинантных ДНК для изучения локализации и свойств антигенных детерминант, связи структуры и функции генома вируса с целью создания нового поколения эффективных и безопасных синтетических антигенов для использования в диагностикумах и разработки на их основе вакцин.

Перечисленные обстоятельства явились основополагающими при определении выбора темы диссертационной работы. 1.2. Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилось исследование первичной структуры генома ВЯ отечественных производственных штаммов с целью изучения молекулярной природы

з возбудителя и разработки новых средств диагностики и профилактики ящура с использованием технологии рекомбинантных ДНК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-молекулярным клонированием получить рекомбинантные плазмид-ные ДНК, содержащие кДНК фрагменты геномов ВЯ разных типов, провести анализ и создать банк клонов E.coli с фрагментами вирусспецифических кДНК.

-установить первичную структуру генов Vp1 отечественных производственных штаммов разных типов ВЯ Азия 1- 48 и A₂₂ 550, О, 194, О) 1618, С) 65/67 и некоторых полевых изолятов.

-определить полную первичную структуру генома ВЯ А₂₂ 550;

-провести сравнительный анализ установленных последовательностей с известными последовательностями других штаммов ВЯ; -

-изучить возможность использования данных по первичной структуре антигеннозначимых областей генома в сочетании с методами технологии рекомбинантных ДНК для разработки новых более эффективных средств выявления и идентификации ВЯ;

-сконструировать рекомбинантную плазмиду, содержащую транслируемую область генома ВЯ;

-разработать методы направленного мутагенеза для изучения структуры и функции генома, используя технологию рекомбинантных ДНК;

-исследовать возможности получения генно-инженерных конструкций, способных экспрессировать антигеннозначимые участки генома ВЯ разных серотипов в бактериальных клетках;

-изучить возможность использования экспрессированных в бактериальных системах вирусспецифических белков в качестве защитных * препаратов. 1.3. Научная новизна и теоретическое значение. В результате молекулярного клонирования создан и изучен с использованием методов молекулярной гибридизации, рестрикционного анализа и секвенирования банк рекомбинантных плазмид, содержащих кДНК фрагменты генома производственных штаммов ВЯ типов А₂2, О), Сі и Азия-1 и полевых изолятов типа О.

Впервые определена полная первичная структура генома ВЯ штамма Ад 550, которая депонирована в EMBL банке нуклеотидных последовательностей геномов вирусов, и кДНК фрагментов генов Vp1 отечественных производственных штаммов этого вируса типов О,, C_t и Азия-1, а.также гена Vp1 эпизоотических изолятов О, 1445 и 0 1492.

Полученные данные о первичной структуре генома производственных штаммов могут быть использованы для анализа связи структуры и функции, генома при проведении фундаментальных исследований, в дифференциальной диагностике для анализе полевых изолятов методом секвенирования с использованием ПЦР, а также для получения синтетических вакцин путем генно-инженерного и химического синтеза пептидов.

Разработана стратегия и осуществлена сборка ДНК-копии всей транслируемой области генома ВЯ Azz 550, правильность сборки которой подтверждена секвенированием участков лигирования, а также в реакциях транскрипции и трансляции in vitro.

Разработан метод сегмент-направленной модификации гена Vp1 ВЯ с помощью репликативной формы (РФ) РНК, гибридизованной с кДНК гена

Vp1 и воздействия химического мутагена, позволяющий получать варианты, отличающиеся по антигенным свойствам.

Создан вектор для структурно-функционального изучения методом кассетного мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена Vp1 ВЯ А₂₂.

Созданы- плазмиды, содержащие кДНК гена Vp1 ВЯ разных типов, его фрагменты разной длины или их тандемные повторы, а также всю область структурных белков, экспрессирующие в клетках E.coli вирусспецифические белки, слитые с различными белками-носителями.

Впервые показана секреция клетками B.subtilis гибридного белка, содержащего антигенную детерминанту ВЯ Азия-1 48, что существенно упрощает очистку экспрессированного вирусспецифического белка.

Впервые сконструированы плазмиды, экспрессирующие в клетках E.coli гибридные белки, содержащие в комплексе антигенные детерминанты ВЯ разных типов (А.О.С и Азия-1).

Оптимизированы условия наработки, выделения и очистки из бактериальной биомассы рекомбинантных белков и изучены их основные свойства. Показано, что очищенные гибридные белки, содержащие белок Vp1, его фрагменты или их тандемные повторы, индуцируют у лабораторных и естественно-восприимчивых животных при введении в определенных дозах в составе вакцинного препарата выработку типоспецифических нейтрализующих антител в количествах, обеспечивающих защиту от контрольного заражения ВЯ соответстующего типа, что является основой для разработки синтетических противоящурных вакцин на основе микробиологического синтеза. 1.4. Практическая значимость. Созданный и охарактеризованный банк рекомбинантных плазмид используется для получения кДНК-зондов на

различные участки генома с целью анализа и отбора ДНК-фрагментов при молекулярном клонировании генома ВЯ других типов и вариантов, а также для выявления вирусной РНК в образцах патматериалов методом молекулярной гибридизации.

Предложенный метод избирательного молекулярного клонирования и секвенирования амлифицированных в полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК фрагментов гена Vp1 ВЯ разных типов используется для выявления и идентификации ВЯ в патматериалах от больных животных.

Клонированные фрагменты области всех структурных белков или гена Vp1 в плазмидах под контролем SP6 промотора используются для получения в системах транскрипции in vitro меченых зондов для диагностики ящура методом молекулярной гибридизации.

. Полученные препараты экспрессированных в E.coli белков Зс протеазы и 3d РНК-полимеразы используются для диагностики ящура от других инфекций и анализа сывороток с целью дифференциации переболевших и вакцинированных животных.

Полученная ДНК-копия транслируемой области генома используется для конструирования полноразмерной инфекционной ДНК-копии генома ВЯ.

Экспрессированные в бактериальных клетках гибридные белки, содержащие белок Vp1 ВЯ разных типов, их фрагменты или тандемные повторы, используются в качестве антигена для разработки безвирусных диагностикумов и синтетических моно- и поливалентных противоящурных вакцин.

В процессе выполнения научных исследований разработан комплекс из 30 методик по молекулярному клонированию, оценке и использованию клонированных фрагментов и продуктов их экспрессии.

7 Предложенные методики используются в исследованиях, проводимых с вирусом ящура, и могут быть применены в работе с другими вирусами.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

-определение полных первичных структур генома ВЯ штамма Az> 550, генов Vp1 и кодируемых ими белков производственных штаммов Oi 194, О, 1618, Азия-1 48, d 65/67, полевых изолятов О, 1445, О, 1492, использованных для анализа связи структуры и функции генома возбудителя, в дифференциальной диагностике для анализа полевых изолятов методом секвенирования, а также для получения синтетических вакцин путем генно-инженерного и химического синтеза;

-создание молекулярным клонированием генома ВЯ
производственных штаммов Ад 550, O_t 194, О, 1618, Азия-1 48, С, 65/67,
полевых изолятов О, 1445, О, 1492 банка рекомбинантных плазмид,
охарактеризованного методом молекулярной гибридизации,

рестрикционного анализа и секвенированием;

-разработка методов сегмент-направленной модификации генома ВЯ с использованием репликативной формы РНК, гибридизованной с кДНК гена Vp1, и модификации химическим мутагеном, а также сайт-специфического мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена Vp1 с созданием вектора для кассетного мутагенеза;

-разработка методов диагностики ящура на основе избирательного молекулярного клонирования и прямого секвенирования с использованием полимеразной цепной реакции гена основного антигенного белка Vp1 для выявления и идентификации полевых изолятов ВЯ, а также использования экспрессированных в Є со// неструктурных

8 белков протеазы Зс и РНК-полимеразы 3d в качестве антигенов для серологической дифференциации ящура от других инфекций и выявления переболевших животных;

-создание синтетических моно- и поливалентных противоящурных
препаратов конструированием рекомбинантных плазмид,

зкспрессирующих в клетках E.coli и B.subtilis гибридные белки, содержащие вирусспецифический полипептид структурной области, белка Vp1 ВЯ разных типов, его фрагменты или их повторы в разных сочетаниях в составе различных белков-носителей, которые индуцируют у естественно-восприимчивых животных выработку вируснейтрализующих антител, обеспечивающих защиту от контрольного заражения ВЯ соответствующего типа.

1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены на заседаниях ученого совета и методической комиссии
ВНИИЗЖ (1983-1995 г.), на симпозиумах и конференциях: проводимых во
ВНИИЗЖ(г. Владимир 1983, 1986, 1987, 1988, 1990, 1995г.) и ВНИИВВиМ
(г.Покров 1992г.). На Всероссийских (Всесоюзных) конференциях: Москва,
1991г., Пущино- на-Оке, 1991 г., Владимир, 1995г.

На международных совещаниях и конференциях: Научно-координационные совещания стран СЭВ (Чехословакия, 1986 г., ГДР, 1988 г., Болгария, 1988 г. Международные конференции (СССР, 1991 г., Австрия, 1994 г., Япония, 1995 г.).

1.7. Публикация результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 60 печатных работ, из них 8 статей во Всероссийских
журналах, 15 - в материалах международных конференций и симпозиумов.

9 1.8. Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 406 страницах, включает: введение (15 стр.), обзор литературы (84 стр.), результаты собственных исследований и их обсуждение (234 стр.), заключение (10 стр.), выводы и приложения, где представлены дополнительные документы, подтверждающие научную и практическую значимость отдельных этапов работы.

Список использованной литературы включает 502 источника, в том числе 64 на русском языке. Представленный экспериментальный материал иллюстрирован 72 рисунками и 17 таблицами.

.2.1. Материалы и методы

В работе были использованы производственные штаммы вируса ящура А22 550, О, 194, O_t 1618, Азия-1 48 и С, 65/67 и полевые изоляты О, 1445, О) 1492, выделенные в Московской области в 1987-1988 г. и любезно предоставленные сотрудником ВНИИЗЖк.в.н. ШажкоЖ.А.

В качестве индикаторного ВЯ при изучении иммуногенности вакцинных препаратов на морских свинках использовали адаптированные к ним штаммы 0( 194 и А^ 550, прошедшие 191 пассаж на морских свинках.

В качества индикаторного ВЯ при изучении иммуногенности вакцинных препаратов на овцах использовали адаптированные к ним штаммы ВЯ Ак 550 и Азия1 48, прошедшие ряд перемежающихся пассажей на мышах и овцах по специально разработанной схеме.

Для конструирования рекомбинантных плазмид использовали плаз-мидные ДНК pBR 322, pUC 7, 8, 9, 10, 18 и 19, рКК 223 и ДНК фага М13 тр 8, 9, 18, 19 фирмы "Pharmacia"; плазмиды pUR 290, pUR 291 и pUR 292, pSK 95, pZtet 3, pTK 208, рР 7,5 К получены из ВНИИ МБ (г.Новосибирск); рТМ 261, рСВ 20, pRT2 78, pRN 23, pRN 15, pRN 34, pRT 5 получены из ВНИИ генетики (г.Москва). Плазмиды pTNF-314 и pWFMD и клетки E.coli SG20050 из ИБХ РАН им. М.М.Шемякина-Ю.А.Овчинникова (г.Москва).

Для трансформации использовали штаммы E.coli TG-1, RZ 1032 и B.subtilis BG2036, полученные из ВНИИ генетики ( г. Москва). Штаммы Е.СОІІ ВМН71-18, JM103, JM109, С 600, JS 5318, ТК 1045 МН 3000, полученные из коллекции ВНИИ МБ (г.Новосибирск). Бактерии выращивали на среде Луриа-Бертрана (LB).

Для приготовления буферных растворов при проведении работ по выделению нуклеиновых кислот, ферментативных реакций при молекулярном клонировании фрагментов генома ВЯ и всех работ по технологии рекомбинантных ДНК, анализу и секвенированию генома использовали химические реактивы фирм "Serva", "Sigma", "Fluka", "Merck", а также отечественные реактивы марки не ниже о.с.ч.

Радионуклиды (у-³²Р)АТР, (32P)dNTP - фирмьГИзотоп" (г.Обнинск).

В работе использовали следующие ферменты: РНК-зависимую ДНК-полимеразу вируса миелобластоза птиц и РНК-азин из плаценты человека производства Омутнинского химического завода (г.Омутнинск);

ДНК- полимеразу фага Т4, ДНК-полимеразу 1(фрагмент Кленова), полинуклеотидкиназу фага Т4, терминальную трансферазу, Taq- и Tth-полимеразу, а также эндонуклеазы рестрикции фирм "Serva", "Pharmacia", "Boechringer", "Promega", НПО "Вектор" (г.Новосибирск), НПО "Фермент" (г.Вильнюс), Институт белка (г.Пущино).

1. Концентрирование культурального вируса из вируссодержащего материала и 10% суспензию лапинизированного ВЯ осуществляли двукратным осаждением ПЭГ 6000 и очищали хлороформом, а затем центрифугированием в градиенте цезия-сахарозы по K.Strohmaier et al.(1978). 10% суспензию лапинизированного вируса, приготовленного на 0,02 М фосфатном буферном растворе (рН 7,5), предварительно очищали от клеточных белков хлороформом (30% по объему) и центрифугированием при 17000 g в течение 20 минут в центрифуге "Beckman" J2-21.

2. РНК ВЯ получали из высокоочищеннои вирусной суспензии фенольно-детергентным методом (H.Bachrach,1960) с нашими модификациями.

12 Выделение полноразмерной РНК проводили в градиенте плотности сахарозы 10-30% на буферном растворе STE при рН 7,4 в центрифуге Sorvall при 68000 g в течение 12 часов при 10С.

3. Синтез комплементарной ДНК на вирионной РНК проводили по методу, описанному Т. Маниатисом с соавторами(1984). Синтез второй цепи осуществляли как описано V.Gubler & B.Hoffman(1983).

4. Клонирование кДНК осуществляли в соответствии с методикой, предложенной Уотсон К. и Джексон Д. (1988), с некоторыми модификациями. В качестве векторов использовались плазмидные ДНК pBR 322, pSK 95, pUC18, pUS 19.

2.1.5. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом
(H.Birnboim & Doly, 1979). От клеточных белков ДНК отделяли экстракцией
смесью фенол-хлороформ. Окончательно очищали препарат от тРНК и
солей хромотографией на колонке с сефарозой CL-2B. При аналитическом
выделении большого количества проб ДНК их обрабатывали РНКазой А
для устранения клеточной РНК.

5. Трансформацию клеток E.coli проводили по Ханаан Д., 1988. Уровень трансформации составлял 7x10⁶.

6. Гибридизацию рекомбинантных плазмид с олигонуклеотидными зондами проводили как описано в руководстве по молекулярному клонированию (Маниатис с сотр., 1984). Олигонуклеотиды метили (³²Р)АТР полинуклеотидкиназой Т4, кДНК фрагменты метили (³²P)dNTP ДНК-полимеразой в реакции ник-трансляции согласно инструкции к наборам фирмы "Amersham".

При проведении дот-гибридизации выделенные плазмиды наносили на фильтр в количестве 10-100 нг в 1 мкл, отжигали и вели гибридизацию по методу, описанному B.Hames и S.Higgins(1985).

13 2.1.7. Олигонуклеотид-направленный, сайт-специфический мутагенез с фенотипической селекцией мутантов осуществляли методом T.Kunkel et al.(1985).

2.1.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили двумя методами: по А.Махат и W.Gilbert (1977) в модификации А.Махат et al. (1980) и методом F.Sanger et al. (1977) в модификации R.Komeluketal. (1985).

2.1.9. Амплификацию кДНК в цепной полимеразной реакции проводили по
методу R.Saiky (1988) с химически синтезированными универсальными
праймерами в автоматическом амплификаторе "Биотерм" (г. Голицино).

10. Транскрипцию in vitro проводили по методу D. Melton et al.(1984).

11. Трансляция in vitro вирионной РНК или РНК-транскриптов вели в лизатах ретикулоцитов кролика по методу C.OIIiver.(1984).

12. Анализ продуктов экспрессии осуществляли электрофорезом в ПААГ-ДСН различной концентрации по U.Laemmli (1970).

13. Проверку вирусспецифической антигенной активности рекомби-нантных белков, экспрессированных в Е.соН, осуществляли с помощью иммуноблота. С этой целью белки после электрофореза в ПААГ-ДСН переносили на нитроцеллюлозные фильтры и проводили иммунофермент-ный анализ согласно методике, описанной H.Towbin et al. (1979) и I.Crowtheretal. (I979).

2.1.14. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур
нуклеиновых кислот, расчет олигонуклеотидов. Обработку информации по
первичной структуре проводили с использованием пакетов прикладных
пограмм DNASIS/PROSIS версия 3.00 1987г.( Hitachi software engineering
Со.) и PC Gene, версия 5.15 1988 (Intelligenetics, Швейцария).

Для сравнения вновь установленных и имеющихся в банке последовательностей использовали программу множественного выравнивания ALIGN, версия 1.01 1989 г. (Scientific and Educational Software, США) и пакет прикладных программ для сравнения последовательностей и предсказания филогенетических отношений SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версия 1,0 ( N.J. Knowles, IFAH, Великобритания).

Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот (Zuker, 1986) с использованием энергетических правил Салсера (Salser, 1977).

Синтез олигонуклеотидов проведен Н-фосфонатным методом по R.Stromberg(1987).