Введение к работе
Актуальность проблеми. Исследование структура и особенностей выражения вирусного генома - бурно развивающееся направление ; молекулярной вирусологии: Знание первичной структуры Шрусншс геномов позволяет.построить модель организации и экспрессии генома, выдвинуть обоснованные гипотезы о функциях: кодируемых полипептидов и некодирующих областей, и в -сочетании с широким спектром генно-инженерных подходов, проводить функциональные исследования. Изучение механизмов експресии генома вирусов растения, среди которых преобладают РНК-содеркащие вирусы, . имеет большое теоретическое и практическое значение, давая сведения об 'общих' принципах экспрессии генома и позволяя приблизиться к более глубокому понимании молекулярных аспектов инфекции,' к созданию новых векторных систем, к разработке эффективных методов борьбы с вирусными заболеваниями растений.:
РНК-содэржащиэ вирусы характеризуются исключительным разнообразием принципов организации и экспрессии генома.. Их разделяют на вирусы с позитивным (+) и негативным (-) однонитевым . РНК геномом, а также вирусы с двухцепочечным (дц) РНК геномом. (+)РНК-содержащие вирусы представляют - собой наиболее обширную группу. На основе различий в организации генома, морфологии частиц и биологических свойств - таких как круг хозяев, эпидемиология и характер симптомов - среди (+)РНК-содержащих вирусов выделяют ряд семейств (среди бактериофагов,'вирусов животных) или групп'(среди вирусов растений). В самое последнее время в связи с накоплением информации о. последовательностях вирусных генов детальный компьютерный ". анализ белковых последовательностей позволил сгруппировать (+)РНК-содержащие %ирусы в пределах строго ограниченного числа так называемых "супергрупп" (Goldbaoh and Wellink, 1938). Первоначально было предложено, выделить две супергруппы - пикорна- и альфа-подобные вирусы. Проведенный недавно полный анализ . известных. в литературе аминокислотных последовательностей РНК полимераэ .'. (+)РНК-содержащих , вирусов позволил выделить третью супергруппу - кармо-подобнне вирусы (Koonin, 1990, 199D.
Структура геномов клостеровирусов к моменту начала выполнения настоящей работы описэпа не была. Объектом исследования был выбран типовой представитель этой группы - вирус желтухи свеклы. Частицы
- г -
ВЖС СОСТОЯТ ИЗ ОелКОВ-МОНОМероВ С МОЛ. ЬвСОМ'22300 И РНК длиной 14.5.TUC. НТ (Bar-Joseph & Hull, 1974; Carpenter et аї., 1977). РНК ВЖС лишена 3' концевой поли (А) и несет на 5'-конце кэп-структуру (Karaeev et »;., .1909). Продукты трансляции ы ипт-о вирионной РНК ВЖС представлены мажорным полипептидом с мол. весом 250- кДа; СООІБЄТСТБУКЩИЙ ген, по-видимому, охватывает 5'-концевую половину генома ВЖС (Karaeev et al.. 1939; Dolja et oi.,.1990).
Цель н задачи исследования. Целью представленной работы было изучение первичной структуры и Бкспрессии генома клостеровируса желтухи свеклы, компьютерный анализ последовательности РНК ВЖС с целью выяснения кодирующей емкости генома и предсказания возможных функций кодируемых, балков, а таете установление систематического положения клостеровирусов среди других (+)РНК-содвржащих вирусов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые определена первичная структура з.'-концевой половины генома ВЖС, предложена общая организация генома ВЖС.
В процессе работы был получен набор pTZia-19 клонов, содержащих -последовательности нуклеотвдов у-концевой половины генома ВЖС. Эти клоны используются для дальнейшего изучения ВЖО методами рекомбинантшх ДНК в Отделе биохимии вирусов растений ШШЛ им. А.Н. Белозерского МГУ.
На основании анализа первичной структуры . РНК ВЖС впервые описана организация генома клостеровирусов. Высказаны обоснованные гипотезы о возможных функциях продуктов 0РС1, 2, 3, 5 и б. Показано, что продукт 0РС1 - гипотетическая РЖ зависимая РНК лолимераза, филогенетически близка РНК полимеразам трикорнавирусов. Продукт 0РС2 - 6.4К белок обнаруживает сходство с небольшими гидрофобными 12-14К белками потеке- и карлавирусов, которые обладают мембрано-связывающими свойствами и, по-видимому, вовлечены в транспорт вируса по растению (Morozov et oi., 1987, 1989, 1990). Уникальным свойством генома ВЖС является кодирование 65К белка -' прямого гомолога белков теплового шока семейства HSP70. Это первый пример кодирования белков теплового шока вирусным геномом. Обнаружено достоверное сходство продукта 0РС5 - 24К белка, с вирусным белком оболочки (продукт 0РС6). Предполагается, что ген 24К белка возник путем дупликации цистрона белка оболочки, а функция его продукта (24К) связана с транспортом вируса по растению. 24К в белок оболочки вкопрвссированы под Т7 промотором и показьяо, что 24Х б-элок транслируется о первого из двух
гипотетических AUG кодонов.
Полученные результата имеют большое значение для прикладных., исследований. Потери урожая сахарной свеклы в случае заражения ВЖС достигают 40%. Перспективно создание растений, устойчивых к ВЖС.
Апробация работы состоялась на семинаре каф. вирусологии МГУ 1
ноября 1991 года. .
Материалы исследований были доложены на VII и VIII Международных конгрессах по вирусологии (Вена, 1987; Берлин, 1990).