Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что специфические антитела "узнают" не всю молекулу капсидного белка, а лишь определенный участок - эпитоп (антигенную детерминанту). Изучение строения и локализации эпитопов играет одну из главных ролей при идентификации и классификации фитовирусов. Исследование топографии эпитопов в капсиде важно для познания молекулярной организации вириона и достоверной точной диагностики вирусов, а также создания синтетических антигенов и генно-инженерных сывороток. Поэтому иммунохимические исследования капсидных белков фитовирусов актуальны. Классические иммунохимические методы детекции вирусных заболеваний (капельная агглютинация, преципитация, иммунодиффуэионные тесты) из-за низкой чувствительности в настоящее время уступили место современным, высокочувствительным и специфичным - радиоиммунологическому, иммуноферментному, иммунолюминесцентному анализам и иммунной электронной микроскопии, позволяющим за короткое время с высокой точностью определять антигены и антитела в минимальных количествах .
Общеизвестен большой экономический ущерб, наносимый фитопато-генными вирусами сельскому хозяйству. В частности, ежегодные потери картофеля от вирусных заболеваний в нашей стране составляют от 25 до 30% (Атабеков, 1984; Атабеков, Тальянский, 1987), сои - 15-70% (Рейфман и др., 1971), лука - 30-50% (Косова, Хайсин, 1970). Поэтому, наряду с селекцией вирусоустойчивых сортов, различными агротехническими мероприятиями и другими методами защиты сельскохозяйственных растений от вирозов, большое значение имеет семеноводство на оздоровленной от вирусов основе, которое невозможно без широкого применения иммунодиагностики. В связи с этим актуальной задачей является усовершенствование иммунохимических методов, позволяющих проводить массовую экспресс-диагностику фитовирусов.
Среди таксономических групп фитовирусов самая многочисленная группа потивирусов. Она включает около 180 вирусов, или 3 6 всех известных (Ward, Shukla, 1991). Вирусы этой группы поражают 1112 видов растений 369 родов 53 семейств. На Дальнем Востоке в настоящее время идентифицировано 10 потивирусов: У- и А-картофеля (УВК, АВК) , желтой мозаики фасоли (ВЖМФ), обыкновенной мозаики фасоли (ВОМФ), мозаики сои (ВМС), мозаики турнепса (ВМТ), желтой карликовости лука (ВЖКЛ), мозаики гиппеаструма (ВМГ), мозаики клевера горного (ВМКГ) и вирус традесканции белоцветковой (ВТБ). Они снижают урожайность и качество важнейших сельскохозяйственных куль-
тур (картофель, соя, овощные, зерновые и декоративные).
Антигенные свойства дальневосточных изолятов потивирусов ранее были изучены слабо, а недавно идентифицированные новые патогены ВЖКЛ, ВМГ, ВМТ (изолят из лобы), ВТБ, ВЖИФ (иэолят из гладиолуса) не исследовались совсем. Поэтому, вопрос изучения антигенных и им-муногенных свойств капсидных белков дальневосточных изолятов потивирусов, а также выявление группоспецифичных эпитопов современными методами иммуноанализа и повышение специфичности и чувствительности диагностических систем актуален и является составной частью фундаментальных исследований фитовирусологии.
Цель и основные задачи исследований. Целью настоящей работы является сравнительное изучение антигенных свойств капсидных белков дальневосточных изолятов потивирусов, ранее не изученных: ВТБ, ВМГ, ВМТ (изолят из лобы), ВЖКЛ, ВЖМФ (изолят из гладиолуса) и известных, но недостаточно исследованных (УВК, АВК и ВМС) для подтверждения принадлежности новых дальневосточных изолятов к группе потивирусов, а также для разработки современных высокочувствительных иммунохимических методов детекции этих вирусов.
При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
-
Усовершенствовать известные и подобрать оптимальные методики получения очищенных вирусных препаратов исследуемых потивирусов.
-
Получить кроличьи, мышиные поликлональные антитела и куриные иммуноглобулины на основе разработанных для потивирусов схем иммунизации .
-
Провести сравнительную характеристику антигенного родства изучаемых вирусов с помощью иммунохимических методов с целью выявления вирус- и группоспецифичных эпитопов капсидных белков для подтверждения принадлежности новых патогенов к группе потивирусов.
-
Разработать иммунодиагностикумы для детекции исследуемых вирусов различными вариантами иммуноферментного анализа (непрямой, "сэндвич"-метод, конкурентный вариант, двойной ангительный "сэнд-вич"-метод) и усовершенствовать методы экспресс-имкунодиагиостики для использования их в практической работе.
Научная новизна работы. Впервые получены специфические кроличьи и мышиные поликлональные антисыворотки к новым, ранее не изученным потивирусам желтой мозаики фасоли (изолят из гладиолуса), желтой карликовости лука, вирусу традесканции белоцветковой и мозаики турнепса (изолят из лобы), на основе которых были разработаны иммунодиагностикумы для непрямого, "сэндвич" и двойного анти-
тельного "сэндвич"-методов иммуноферменгного анализа (ИФА), позволившие выявлять до 1-3 нг /мл вируса в вирусном препарате и в соке зараженных растений в разведениях 10~"3-10~5.
Впервые выделены мышиные, куриные иммуноглобулины и F(ab')2-фрагменгы кроличьих иммуноглобулинов в качестве первичных антител для двойного антительного "сэндвич"-метода ИФА.
Впервые применен двойной антительный "сэндвич"-метод ИФА (ДАСМ) для изучаемых потивирусов, позволивший повысить чувствительность и специфичность ИФА.
Разработан вариант конкурентного ИФА для выявления группоспеци-фичных эпитопов с целью определения антигенного родства потивирусов.
Практическая значимость работы. Показана высокая надежность им-мунодиагностикумов, разработанных на основе ИФА к вирусу мозаики сои для выбраковки зараженных растений сои (апробированы на сортах Венера и Приморская 494 на опытных полях Приморского НИИСХ).
Рекомендованы иммунодиагностикумы к вирусу желтой карликовости лука для отбора безвирусного посадочного материала (апробированы на опытных полях Института растениеводства и селекции со РАСХН).
Материалы исследований включены в методические рекомендации "Иммунодиагностика вируса мозаики сои в растениях и семенах сои" (1990) в помощь селекционерам и семеноводам.
Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на 9-ом совещании чехословацких фитовирусологов (Прага, 1989), конференции немецких фитовирусологов (Эберсвальд, 1989), Всесоюзном координационном совещании по генетике, семеноводству и технологии возделывания сои (Благовещенск, 1989), Всесоюзной конференции "Микробиологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1990), Всесоюзном совещании "Иммунитет сельскохозяйственных культур к болезням и вредителям" (Минск, 1991), Всесоюзном совещании "Биология клеток в культуре" (С.-Петербург, 1992), а также на рабочих совещаниях по проекту ГНТП "Беэвирусное растениеводство" (Москва, МГУ, 1987-1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 печатных работы.
Объем и структура диссертации Работа изложена на страницах, содержит 5 таблиц, иллюстрирована 29 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), экспериментальной части (глава 3), обсуждения ре-
зультатов (глава 4), выводов и списка литературы, включающих
наименований, в том числе работ иностранных авторов.