Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирусные гепатиты - одна из наиболее сложных и интересных медицинских проблем. Благодаря бурному прогрессу в изучении вирусных гепатитов за последние 30 лет, стало известно, что причиной их возникновения являются по крайней мере 7 различных вирусов вирусов, 2 из которых передаются энтеральным путем - гепатиты А и Е, а 5 - парентеральным - гепатиты В, С, D, G и GB-C (Львов Д.К., 1998; Bnkh J. et al., 1997; Miyakawa Y et al., 1997).
Гепатит А представляет серьезную проблему для здравоохранения, особенно в странах с низким социально-культурным уровнем и вызывает тревогу в связи с массовостью поражения. В Российской Федерации, гепатиту А принадлежит первое место в общей структуре инфекционных гепатитов, хотя и отмечается тенденция к его снижению (Шахгильдян И.В. и др., 1994; Онищенко Г.Г., 1997).
В последние годы существенно поколеблен ряд положений, касающихся вопросов патогенеза, клиники и эпидемиологии гепатита А. На фоне господствующих представлений о том, что ГА почти всегда является доброкачественным, остро протекающим заболеванием без тяжелых осложнений и хронизации имеются данные о существовании затяжных и рецидивирующих форм (Хохлов Д.М. и др., 1988; Куперштейн А.П., 1993; Jacobson I.M. et al., 1985; Sjogren M.H. et al., 1987; Van den Anker J.N. et al., 1987; Flehmig B. et al., 1990), о возможности появления среди детей в отдельные сезоны средне-тяжелых, тяжелых и даже злокачественных форм ГА, с проявлениями острой печеночной энцефалопатии, а также наклонностью к затяжной реконвалесценпн (РеЙзис А.Р., 1997).
Обезьяны являются единственной экспериментальной моделью вирусных гепатитов. Поэтому только на них могут быть изучены эти многие другие неясные вопросы патогенеза и иммуногенеза ГА, такие как, например, прочность и продолжительность иммунитета к ГА, роль в нем клеточных факторов; длительность сохранения ВГА в организме, продолжительность его выделения в окружающую среду, сохранение в иммунном организме, возможность его внепеченочной локализации - важные для понимания как патогенеза, так и эпидемиологии инфекции.
Экспериментальная модель ГА на обезьянах необходима для проверки как уже полученных, так и разрабатываемых вакцин и других противовирусных препаратов. Исследования по проверке вакцин не должны ограничиваются только лишь изучением их нммуно-генности, т.е. антительного ответа. Необходимо также изучение более важных для оценки вакцин протективных свойств, обеспечивающих невосприимчивость организма к повторному заражению патогенным штаммом, а также проверки их безопасности, т.е. остаточной вирулентности.
Существующие модели ГА на шимпанзе, тамаринах и панамских ночных обезьянах (J.L.Deinstag et al.,1975; F.Ddnhardt, 1976; Provost et al., 1977, J.W.Le Due et al., 1983) внесли огромный вклад в изучение этой инфекции. Однако при их использовании исследователи встречаются с большими трудностями экономического и практического плана. Стоимость шимпанзе высока и для их использования в экспериментах требуется специальное разрешение. Игрунки также малодоступны: численность поголовья этих южноамериканских обезьян в природных условиях резко сократилась, а разведение их в питомниках - дело чрезвычайно трудное в связи с большими требованиями к условиям содержания. Наиболее перспективное направление - поиск подходящей модели для воспроизведения ГА на низших обезьянах Старого Света, которые более доступны и экономически выгодны.
К моменту начала наших исследований (1985 г.) попытки экспериментального воспроизведения ГА на более доступных низших обезьянах Старого Света с помощью штамма ВГА человека были безуспешными (F.Deinhardt, 1976; R.H.Purcell, J.L.Dienstag, 1978). Более того, среди ученых сложилось прочное мнение о том, что естественное инфицирование низших обезьян Старого Света ВГА происходит бессимптомно и сопровождается лишь сероконверсией (R.H.Purcell et al., 1975; D.A.Peterson, 1979; J.W.Eichderg, S.S.Kalter, 1988; J.W.Le Due et al., 1981; С.С.Савинская и др., 1983). Описан был лишь один случай спонтанного ГА у макака яванского, спровоцированный действием иммунодепрессантов (А. Г.Анджапаридзе и др., 1985).
Вместе с тем, длительный опыт изучения спонтанной патологии низших обезьян Старого Света, содержащихся в Сухумском питомнике, свидетельствовал о наличии у них поражений печени, весьма сходных по морфологической характеристике с вирусными
гепатитами человека. Частота этих гепатитов значительно возросла к середине 80-х. В 1985 году под руководством академика В.А. Лапина и профессора З.В. Шевцовой в НИИЭПиТ АМН СССР было начато целенаправленное комплексное исследование по изучению спонтанного и экспериментального ГА у нескольких видов низших обезьян Старого Света. Работа проводилась в течение 8 лет (1985-1992 г,г.) на базе лаборатории вирусных инфекций с участием сотрудников других подразделений - лаборатории патанатомни (д.м.н. Р.И. Крылова, вет. врач Е.Г. Белова) н зоотехнического отдела (к.мл. З.Н. Джелнева). На первых этапах выполнение отдельных фрагментов работы осуществлялись в сотрудничестве с Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского (д.м.н. Н.В. Дорошенко, профессор В.А. Ананьев, профессор В.М. Стаханова) и Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (д.м.н. А.Г. Анджапаридзе, завлаб., профессор Балаян М.С.)
Данные, представленные в диссертации по изучению спонтанного и экспериментального ГА на низших обезьянах Старого Света, являются частью многолетнего исследования большого коллектива.
Радикальные успехи в борьбе с гепатитом А невозможны также без создания высокоспецифических средств профилактики и диагностики, основным компонентом для конструирования которых являются культуральные штаммы. За рубежом имеется несколько таких штаммов ВГА человека (CR-326, MS-1, SD11, НМ-175), используемых как для моделирования ГА на мармозетах, так и для производства вакцин и иммунодиагностических препаратов. В России для этих целей используется штамм HAS-15, полученный из-за рубежа (Ю.Ю. Кусов Ю.Ю и др., 1985), кроме того ведутся поиски новых высокопродуктивных отечественных штаммов ВГА (Фарашян В.Р. и соавт., 1989, 1991; Быченко А.Б. и соавт., 1992; Майданюк А.Г. и соавт., 1993, 1995). Одним из существенных недостатков уже используемых штаммов является отсутствие патогенностн для других видов обезьян, помимо мармозет, которые малодоступны и не могут быть использованы для моделирования ГА и испытания вакцин в широких масштабах.
Выделение от обезьян штаммов ВГА, имеющих тесное антигенное родство с ВГА-человека, открывает новые перспективы их практического использования, как в качестве реагентов для иммунодиагностических препаратов, так н штаммов-продуцентов для производства вакцин (Анджапаридзе А.Г. и соавт., 1986; Binn L.N. et al., 1984; Рнгсеїі R.H., 1991). Представляет также интерес изучение вопроса об
использовании низших обезьян Старого Света в качестве доноров для получения анти-ВГА содержащих сывороток с целью приготовления антительных компонентов иммунодиагностикумов.
Цель и задачи исследования.
Целью данного исследования явилось изучение спонтанного и экспериментального ГА низших обезьян Старого Света в сравнительно видовом аспекте с помощью серологических и вирусологических методов, оценка адекватности разработанных биомоделей ГА на павианах гамадрилах и макаках резусах ГА человека и использование их для изучения патогенеза и иммуногенеза. Предметом исследования также явилось выделение и адаптация в культурам клеток ВГА от обезьян и человека, изучение их свойств и возможности практического применения.
В задачи исследования входило:
сероэпизоотологическая характеристика спонтанного ГА низших обезьян Старого Света в сравнительно видовом аспекте;
получение серологических и вирусологических доказательства этиологической роли ВГА при спонтанном гепатите обезьян, привезенных из мест естественного обитания и протекающим с биохимическими и морфологическими признаками;
выделение нативных изолятов ВГА от обезьян со спонтанной инфекцией и изучение их свойств;
адаптация к культурам клеток выделенных от низших обезьян и человека нативных штаммов ВГА, изучение их морфологических, антигенных и молекулярно-биологических свойств, а также патогенносте культуральных вариантов ВГА для обезьян и определение возможностей их практического использования;
разработка экспериментальных моделей ГА на павианах гамадрилах и макаках с помощью штаммов ВГА, выделенных от обезьян, а на павианах - и с помощью штамма ВГА человека, оценка адекватности этих моделей ГА человека;
использование экспериментальных моделей ГА обезьян для изучения характеристики первичной и повторной инфекции (показатели специфического гуморального иммунитета, длительность вирусовьщеления и вероятность существования затяжных и хронических форм).
получение гипериммунных сывороток от инфицированных ГА обезьян и изучение возможности их практического использования.
Научная новизна работы. Впервые получены не только серологические, но и вирусологические доказательства спонтанного ГА у макак резусов и павианов гамадрилов. Эти доказательства внесли ценный вклад в большое комплексное изучение спонтанного ГА обезьян этих видов, показав этиологическую роль ВГА в заболевании, протекающем с биохимическими и морфологическими изменениями, характерными для ГА.
Впервые проведен сравнительный эпнзоотологпческий анализ вспышек ГА у разных видов обезьян Старого Света и установлены общие закономерности.
Экспериментально доказано, что среди указанных видов обезьян имеет место циркуляция штаммов ВГА, которые по своим морфологическим, антигенным и биологическим свойствам сходны как между собой, так и с ВГА человека
Впервые получены экспериментальные модели ГА на павианах гамадрилах с помощью штаммов от обезьян и человека. Проведенный сравнительный анализ показал адекватность этих моделей разработанным ранее на макаках и зеленых мартышках, а также ГА человека.
Впервые показано, что экспериментальные модели ГА павианов гамадрилов можно использовать для изучения вопросов пато-и иммуногенеза ГА. При этом была показана возможность хронизации инфекции и персистенции вируса.
Впервые на модели спонтанного и экспериментального ГА обезьян были изучены специфические факторы гуморального иммунитета при первичной и повторной инфекции. Показана возможность неоднократной экспериментальной реинфекщш ГА у обезьян, имеющих анти-ВГА, приобретенные в результате как естественной, так и экспериментальной инфекции, причем особый интерес представляют данные о том, что при отсутствии морфологических изменений, а в сыворотке -иммуноглобулинов класса М, наблюдается длительное выделение ВГА с фекалиями.
В целом, результаты работы имеют значение для понимания природы возвуднтелей ГА, а также некоторых вопросов пато- и иммуногенеза.
Практическая значимость работы.
1. Разработка моделей ГА на макаках н павианах гамадрилах с помощью полученных от них штаммов расширила спектр
- б -
обезьян, которые могут быть использованы для моделирования этой инфекции. Использование штаммов ВГЛ, полученных от обезьян, предпочтительнее в плане их большей безопасности при работе по сравнению со штаммами ВГА человека.
-
Полученные модели спонтанного и экспериментального ГА павианов гамадрилов предлагаются использовать как для изучения нерешенных вопросов пато- н иммуногенеза инфекции, так и для оценки безопасности и эффективности разрабатываемых средств ее профилактики и лечения.
-
Модели ГА на низших обезьянах Старого Света более доступны и экономически выгодны, чем предшествующие аналоги на шимпанзе, игрунках и ночных обезьянах.
-
Культуральные штаммы ВГА обезьяньего происхождения и гипериммунные сыворотки к ним предлагаются в качестве антигенного и антительного компонентов соответственно при производстве иммуно-диагностических препаратов.
-
Выявленная нерсистенция ВГА с фекалиями при затяжном и хроническом течении процесса на обезьянах, а также длительное вирусовыделение при реинфекпиях (при отсутствии в ряде случаев всех других лабораторных показателей), должны привлечь внимание клиницистов и особенно эпидемиологов в плане дополнительного изучения этого вопроса и, возможно, разработки дополнительных мер диагностики таких случаев ГА у человека.
-
Низшие обезьяны Старого Света могут служить эпизоотологи.-ческой моделью ГА.
В результате проведенной работы были паспортизованы и депонированы в Государственную коллекцию вирусов 4 оригинальных авторских штамма ВГА:
1. Штамм ВГА от макак резусов - ВГА-МР, номер депонента ГКВ
N835 от 28.06.1988 г.;
2. Штамм ВГА от павианов гамадрилов - ВГА-ПГ, номер
депонента ГКВ N2256 от 12.10.90 г.;
-
Штамм ВГА человека - ВГА-ЧЗ, номер депонента ГКВ N833 от 28.06.1988 г.;
-
Штамм ВГА от зеленых мартышек - ВГА-ЗМ, номер депонента ГКВ N834 от 28.06.1988 г.
Штамм ВГА-ЧЗ защищен авторским свидетельством N 1547311 на изобретение "Штамм Virus hepatitis A bominis для моделирования
инфекции на макаках, изучения патогенеза, иммуногенеза и контроля вакцин'' от 1.11.1989
Основные положення, выносимые на защиту.
1.Серологические и вирусологические данные свидетельствуют о том, что этиологическим агентом спонтанного заболевания низших обезьян Старого Света (макак резусов и павианов гамадрилов), протекающего с биохимическими и морфологическими признаками ГА, являются штаммы ВГА, по морфологическим, антигенным и биологическим свойствам сходные с ВГА человека.
-
Анализ вспышек ГА среди макак (резусы, бурые), павианов гамадрилов и зеленых мартышек свидетельствует о наличии общих эпизоотологических закономерностей.
-
Новые экспериментальные модели ГА на павианах гамадрилах и макаках резусах, полученные с помощью штаммов ВГА от обезьян и человека, не менее адекватны .ГА человека, чем имеющиеся аналоги и могут быть использованы для изучения вопросов пато- и иммуногенеза инфекции и проверки эффективности средств профилактики и лечения.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Вопросы медицинской приматологии. Наиболее перспективное использование обезьян в медицине и биологии" (Сухуми, 1987); XY Конгрессе международного приматологического общества (Knta-Bali, Индонезия, 1994.
В завершенном виде диссертационная работа была доложена и обсуждена на заседании ученого Совета Института медицинской приматологии РАМН (Сочи, 30 июня 1998).
По материалам диссертации опубликовано 18 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (б глав), обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 214 отечественных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 27 рисунками.