Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Применение самособирающихся структур на основе нуклеиновых кислот 8
1.1.1. Аптамеры 10
1.1.2. Структуры и материалы 12
1.1.3. Подвижные молекулы 15
1.1.4. Элементы компьютеров 16
1.1.5. Ферменты 18
1.1.6. Молекулярные автоматы 20
1.1.7. «Умные» лекарства 20
1.2. Методы выделения клеточных популяций 23
1.2.1. Механические и гидродинамические методы разделения клеток 23
1.2.2. Электрофоретические методы разделения клеток 25
1.2.3. Микрофлюидные устройства 26
1.2.4. Оптофорез 27
1.2.5. Проточная цитофлуорометрия 28
1.2.6. Магнитная сепарация 30
2. Материалы и методы 33
2.1. Выделение лейкоцитарной фракции клеток крови 33
2.2. Олигонуклеотиды и конъюгация олигонуклеотидов с антителами
2.2.1. Методика получения конъюгатов олигонуклеотид-антитело (на примере получения конъюгата Ритуксан-олигонуклеотид) 34
2.2.2. Определение концентрации олигонуклеотидов 36
2.3. Очистка конъюгатов олигонуклеотид-антитело с помощью гель фильтрации 37
2.4. Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 37
2.5. Последовательности олигонуклеотидов 38
2.6. Методика проведения каскада последовательного замещения олигонуклеотидов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности 41
2.7. Методика проведения каскада последовательного замещения олигонуклеотидов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности в цельной крови 42
2.8. Методика выделения клеточных популяций с помощью «молекулярных автоматов» на примере CD3 Т-лимфоцитов 42
2.9. Проточная цитофлуорометрия и статистический анализ 43
2.10. Иммунофенотипическое окрашивание 44
3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Конструирование «молекулярного автомата» 46
3.1.1. Введение 46
3.1.2. Теоритические основы для создания молекулярных автоматов 48
3.1.3. Апробирование работы молекулярного автомата в растворе 50
3.1.4. Оптимизация нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов, использованных для конструирования молекулярных автоматов 51
3.2. Создание молекулярного автомата для одновременного определения наличия двух маркеров на клеточной поверхности 55
3.2.1. Теоритические основы для создания молекулярных автоматов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности 55
3.2.2. Разработка методики прямого конъюгирования антител с олигонуклеотидами 58
3.2.3. Экспериментальная модель, использованная для изучения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов 59
3.2.4. Функциональное тестирование работы конъюгатов антитело олигонуклеотид 60
3.2.5. Апробация молекулярных автоматов с использованием конъюгатов олигонуклеотид-антитело 62
3.2.6. Апробация использования молекулярного автомата с целью определения отдельной лимфоцитарной субпопуляции 65
3.2.7. Каскады последовательного замещения олигонуклеотидов протекают только при условии наличия на клеточной поверхности всех определяемых маркеров 66
3.2.8. Избыток конъюгатов олигонуклеотид-антитело, находящихся в растворе, не влияет на прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов 75
3.2.9. Прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов не зависит от определенного олигонуклеотида и определенного антитела, составляющих конъюгат
3.3. Создание молекулярного автомата для определения редких популяций клеток 82
3.4. Создание молекулярного автомата для одновременного определения трех маркеров 86
3.5. Апробация работы молекулярного автомата в цельной крови 91
3.6. Использование молекулярных автоматов для выделения индивидуальных клеточных популяций 93
3.6.1. Выделение CD3 Т-лимфоцитов с помощью молекулярного автомата
3.6.2. Выделение наивных CD3 Т-лимфоцитов с помощью молекулярных автоматов 97
3.6.3. Выделение наивных CD4 Т-лимфоцитов с помощью молекулярных автоматов 99
Заключение 101
Выводы 103
Список литературы
- Подвижные молекулы
- Методика получения конъюгатов олигонуклеотид-антитело (на примере получения конъюгата Ритуксан-олигонуклеотид)
- Апробирование работы молекулярного автомата в растворе
- Избыток конъюгатов олигонуклеотид-антитело, находящихся в растворе, не влияет на прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Для исследований и идентификации клеток крови часто используют маркеры, расположенные на клеточной поверхности, известные как кластеры дифференцировки (CD) или мембранные маркеры. У клеток, принадлежащих к различным клеточным популяциям, и, более того, у клеток, проходящих различные стадии дифференцировки, набор таких белков на клеточной поверхности часто является уникальным. Таким образом, во многих случаях, определив набор белков CD на клеточной поверхности, можно сделать вывод о типе интересуемой клетки, а также о стадии ее дифференцировки. В некоторых диагностических системах, созданных для выявления доброкачественных и злокачественных опухолей, используются методы определения наборов белков CD. В последнее время такие не инвазивные или минимально инвазивные методы выявления ранних стадий злокачественных опухолей и предраковых состояний, основанные на определении опухолевых маркеров, в том числе, поверхностных репертуаров CD, стали играть существенную роль в клинической медицине.
Процедуру определения наборов белков CD называют типированием клеток и обычно проводят при помощи антител, специфичных к белкам CD и конъюгированных с флуорофорами. Детекцию при этом осуществляют с использованием проточной ц итофлуориметрии. Для проведения фенотипирования определенной популяции клеток определения наличия лишь одного маркера обычно недостаточно. Поэтому при проведении фенотипирования, как правило, одновременно определяют наличие не менее двух маркеров. Для этого приходится использовать целый набор конъюгатов антител с различными флуорофорами, а также другие дорогостоящие реагенты и приборы. Поэтому особенный интерес могут представлять новые методики, позволяющие с использованием минимального количества флуорофоров быстро и селективно определять, а при необходимости и выделять интересующие субпопуляции клеток.
Цель работы: Создать «молекулярный автомат», состоящий из олигонуклеотидов, которые могут собираться на поверхности клеток крови, с целью идентификации и в ыделения уникальных клеточных популяц ий. Молекулярным автоматом было предложено называть совокупность взаимодействующих между собой молекул, способных в ответ на определенное внешнее воздействие подвергаться направленным структурным изменениям, приводящим к серии последовательных взаимодействий этих молекул.
Основные задачи работы: Подобрать последовательности одноцепочечных фрагментов ДНК, способных в ответ на определенное внешнее воздействие подвергаться направленным структурным изменениям, приводящим к серии последовательных взаимодействий этих молекул. Оптимизировать молекулярные автоматы для определения комбинаций поверхностных
клеточных маркеров. Разработать молекулярные автоматы для выделения индивидуальных популяций жизнеспособных клеток.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В данной работе был сконструирован «молекулярный автомат», собирающийся на поверхности живых клеток, который может быть использован для идентификации и выделения уникальных популяций клеток. Для построения «молекулярного автомата» были использованы свойства комплементарности ДНК. В работе предложены каскады последовательного замещения олигонуклеотидов, часть из которых была связана с клеточными поверхностными маркерами. В результате прохождения таких каскадов за счет более высокой энергии связывания одних олигонуклеотидов с другими происходит их последовательное вытеснение.
Практическая ценность работы обусловлена тем, что молекулярные автоматы на основе ДНК могут использоваться для малоинвазивной медицинской диагностике, в частности, для выделения из крови редких циркулирующих клеток, например, клеток опухолей.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на четырех международных конференциях: 4th International Conference, Smart materials structures systems (Монтекатини Терме, Италия, 2012), 27th Congress of the International Society for Advancement of Cytometry (Лейпциг, Германия, 2012), Drug Discovery & Therapy World Congress (Бостон, США, 2014), 30th Congress of the International Society for Advancement of Cytometry (Глазго, Великобритания, 2015). По материалам диссертации опубликовано две статьи в международных журналах Nature Nanotechnology и Биохимия (оба индексируются в базах данных Scopus и WoS). Подана заявка на патент.
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах работы, а именно: выделение лейкоцитарной фракции клеток крови , конъюгация олигонуклеотидов с антителами, обработка последовательностей олигонуклеотидов, проведение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов, обработка и интерпретация результатов, написание и подготовка к публикации тезисов докладов и статей. Совместно со Стивеном Тэйлором и Миланом Стояновиком был разработан метод конъюгации антител с олигонуклеотидами.
Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы. Работу иллюстрируют 31 рисунок и 3 таблицы. Общий объем диссертации 121 страниц. Библиография включает 170 названий.
Подвижные молекулы
Одно из перспективных прикладных направлений исследований нуклеиновых кислот направлено на применение молекул РНК и ДНК в качестве аптамеров - молекул, способных специфично связываться с молекулой-мишенью, выполняя таким образом функции лигандов или рецепторов [12-14]. Термин аптамер происходит от латинского слова aptus, что означает «подходящий», и греческого слова , что означает «часть». Таким образом, аптамерами стали называть небольшие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, которые способны образовывать сложные трехмерные структуры. Такие пространственные структуры определяют основное свойство аптамеров - проявление высокоспецифичной избирательности при взаимодействии с молекулами-мишенями. Обычно перспективные кандидаты для аптамеров отбираются с помощью методики SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), которая была предложена 1990 оду разу двумя независимыми группами исследователей [15, 16]. Эта методика основана на экспоненциальном обогащении потенциальных лигандов из библиотеки случайных последовательностей синтетической РНК или ДНК. Для отбора оптимальной последовательности аптамера синтетическую смесь олигонуклеотидов (библиотеку) инкубируют совместно с интересуемой молекулярной мишенью. При этом олигонуклеотиды, не способные взаимодействовать с мишенью, отмываются, в то время как олигонуклеотиды, способные к специфичному взаимодействию - амплифицируются. Процедуру повторяют несколько раз, и, в результате, становится возможным получить смесь, содержащую небольшое количество олигонуклеотидов, обладающих высоким сродством к интересуемой мишени. После завершения обогащения библиотеки остается лишь определить нуклеотидные последовательности отобранных олигонуклеотидов синтезировать х количествах необходимых для проведения функциональных тестов [17, 18]. В силу своей природы аптамеры, в первую очередь, нашли свое применение исследованиях взаимодействий белков с нуклеиновыми кислотами [19]. Кроме того, к настоящему времени созданы аптамеры, способные специфично распознавать патогенные для человека бактерии и одноклеточные организмы (Salmonella enteritidis и Trypanosoma cruzi). Такие аптамеры могут быть использованы в качестве сенсоров, с помощью которых можно выявлять чрезвычайно низкие концентрации патогенных клеток [20, 21]. На основе ДНК создан аптамер, связывающий и ингибирующий тромбин, который, таким образом, является перспективным кандидатом для создания нового поколения лекарственных препаратов, обладающих фармакологической активностью антикоагулянтов прямого действия [22]. Были созданы аптамеры на основе ДНК, способные распознавать глюкозу [23]. Такие аптамеры могут найти широкое применение в диагностике и лечении сахарного диабета [24, 25]. Созданы аптамеры, которые способны специфично связываться определенными белками на клеточной поверхности [26, 27]. Было показано, что так называемые би-специфичные аптамеры на основе ДНК, которые способны, с одной стороны, связываться с рецептором CD 16 больших гранулярных цитотоксических лимфоцитов, а также обладающие сродством к c-Met, повышенная экспрессия гена которого часто выявляется о многих идах опухолевых леток, способны стимулировать цитотоксический эффект [28].
В сравнении с иммуноглобулинами, аптамеры, как правило, являются более стабильными молекулами, их небольшой размер обеспечивает лучшее проникновение в органы и ткани [29]. Обычно аптамеры обладают низкой токсичностью и иммуногенностью, что важно при создании новых лекарственных средств на основе аптамеров [29, 30]. Таким образом, аптамеры являются перспективной основой для создания новых диагностических систем, лекарственных препаратов и сенсоров.
Методика SELEX безусловно является мощным экспериментальным инструментом, позволяющим относительно быстро отобрать наиболее перспективные последовательности ДНК и РНК, обладающие необходимыми свойствами. В то же время, интенсивное развитие методов биоинформатики и молекулярного моделирования привело к тому, что в настоящий момент появились возможности направленного теоретического расчета для предсказания последовательностей ДНК или РНК, обладающих заданными структурными и функциональными свойствами [31]. Благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам ДНК может применяться при создании достаточно сложных наноразмерных структур даже наномашин. Используя способность ДНК к формированию двойных спиралей за счет комплементарных взаимодействий, можно на основании расчетов предсказывать способность определенной молекулы ДНК самособираться в сложные пространственные структуры [32, 33]. Одной из первых работ, посвященных построению трехмерных фигур на основе нуклеиновых кислот, стала работа под руководством Надриана Симана, в которой в 1991 году было описано конструирование куба, ребра которого были представлены двойной спиралью ДНК [32]. Такой куб стало возможным олучить процессе самосборки трех комплементарно взаимодействующих между собой дезоксирибоолигонуклеотидов, которые в начале собирались в пространственные структуры, образующие вершины куба, а также части трех граней (Рис. 1.1.A). При этом в таких структурах оставались свободными так называемые «липкие концы», которые на следующем этапе самосборки, взаимодействуя друг с другом, приводили к образованию куба (Рис. 1.1.Б). Для стабилизации куба на финальной стадии использовалась ДНК-лигаза с целью фиксации финальной структуры ковалентными связями. В дальнейшем на основе ДНК были созданы и другие геометрические фигуры, такие как треугольники, октаэдры и др. (Рис. 1.В) [34, 35].
Методика получения конъюгатов олигонуклеотид-антитело (на примере получения конъюгата Ритуксан-олигонуклеотид)
Комплекс, состоящий из конъюгата: антитело CD3 - олигонуклеотид 4, образующего комплементарные взаимодействия с олигонуклеотидом 3: и конъюгата: антитело CD45RA - олигонуклеотид 2, образующего комплементарные взаимодействия с олигонуклеотидом 1 (см. таб. 2.1.) были добавлены конечной концентрации олигонуклеотидов 0,1 мкМ (или 7.5мкг/мл концентрация антитела) к 1,5 млн клеток. Комплекс конъюгатов инкубировали в 100 мкл буфера А (см. выше) на льду в течение 20 минут. Затем смесь промывали 2,5 мл охлажденного буфера А и осаждали центрифугированием при 300 g течение 5 минут при 4 С. Осадок ресуспендировали в 400 мкл буфера А и измеряли изменение интенсивности флуоресценции клеток, используя проточный цитофлуориметр FacsCanto (BD Bioscience, США). Через 5 минут добавляли дуплекс олигонуклеотидов 5 и 6 конечной концентрации 0,5 мкМ. Еще через 5 минут последовательность реакций замещения олигонуклеотидов запускали помощью добавления олигонуклеотида 0 (в конечной концентрации 0,5 мкМ). Изменение флуоресценции при прохождении последовательных реакций замещения олигонуклеотидов регистрировали с помощью проточного цитофлуориметра FacsCanto (BD Bioscience, США), используя длины волн 488 нм и 633 нм для возбуждения флуорофоров 6-FAMTM и Су5ТМ, соответственно.
Для «молекулярного автомата» с одновременным определением трех маркеров использовали методику, приведённую выше, за исключением того, что одновременно добавлялись все три комплекса антитело-олигонуклеотид. Комплекс, состоящий из конъюгата: антитело CD8 - олигонуклеотид 5, образующего комплементарные взаимодействия с олигонуклеотидом 6; антитело CD3 - олигонуклеотид 4, образующего комплементарные взаимодействия с олигонуклеотидом 3; и конъюгата: антитело CD45 олигонуклеотид 2, образующего комплементарные взаимодействия с олигонуклеотидом 1.
Методика проведения каскада последовательного замещения олигонуклеотидов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности в цельной крови Комплекс, состоящий из конъюгата антитело CD8 - олигонуклеотид 4, образующего комплементарные взаимодействия с олигонуклеотидом 3—и конъюгата антитело CD3 - олигонуклеотид 2, образующего комплементарные взаимодействия с олигонуклеотидом 1 (см. таб. 2.1.) были добавлены в конечной концентрации антител 1,5 мкг/мл к 300 мкл цельной крови. Комплекс конъюгатов инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем к смеси добавляли дуплекс олигонуклеотидов 5 и 6 в конечной концентрации 0,5 мкМ. Через 15 минут последовательность реакций замещения олигонуклеотидов запускали с помощью добавления олигонуклеотида 0 (в конечной концентрации 1 мкМ). Перед добавлением дуплекса олигонуклеотидов 5 - олигонуклеотид 6 и триггера реакции (олигонуклеотида 0), брали аликвоты смеси и измеряли изменение флуоресценции при прохождении последовательных реакций замещения олигонуклеотидов с помощью проточного цитофлуориметра FacsCanto (BD Bioscience, США), используя длины волн 488 нм и 633 нм для возбуждения флуорофоров 6-FAMTM и Су5ТМ, соответственно.
Методика выделения клеточных популяций с помощью «молекулярных автоматов» на примере CD3 Т-лимфоцитов г\6 Клеточную суспензию (3х10 клеток) в 300 мкл буфера А помещали в 5 мл пробирки (Falcon, BD Bioscience). Затем добавляли конъюгаты олигонуклеотидов с антителами CD3 и CD45RA (конечная концентрация 0,1 мкМ), клетки перемешивали и инкубировали на льду в течение 20 минут. После этого клетки дважды промывали 3 мл охлажденного буфера А, после чего центрифугировали в течение 5 минут при 300 g при 4 С Осадок ресуспендировали в 400 мкл буфера А и добавляли дуплекс
олигонуклеотидов 5 и 6 в конечной концентрации 1,25 мкМ. Смесь перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем добавляли олигонуклеотид 0 (конечная концентрация 2,5 мкМ) и продолжали инкубировать в течении 30-50 минут, после чего клетки промывали, используя 15 мл 0,01 мМ натрий-фосфатного буфера pH7,4, не содержащего MgCl2 (Буфер Б). Дальнейшую обработку проводили в соответствии с протоколом коммерческого реактива Human Biotin Selection Kit (StemCell, Канада) для выделения популяций клеток на магнитных шариках. Осадок ресуспендировали в 500 мкл буфера Б, добавляли анти-биотиновый коммерческий коктейль (50 мкл) соответственно протоколу Biotin Selection Kit и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого в раствор добавляли магнитные частицы (30 мкл) и продолжали инкубировать еще 10 минут. После инкубирования пробирка с образцом помещалась в магнит (EasySep magnet, StemCell, Канада), где клетки интересуемой популяции, связанные с магнитными частицами, оказывались прикрепленными к стенкам пробирки, а супернатант удаляется. Выделенные клетки ресуспендировали в буфере А и анализировали с помощью проточной цитофлуорометрии.
Измерения проводили с использованием прибора FacsCanto (Becton Dickinson, США), оснащенного лазерами с длинами волн для возбуждения флуорофоров: 405 нм, 488 нм и 633 нм. Инструментальные настройки прибора проводили с помощью стандартизированных флуоресцентных шариков. Компенсация проводилась, используя компенсационные шарики (BD CompBeads, BD Biosciences, США). В к аждом образце для анализа данных накапливали не менее 106 клеток. Данные обрабатывали в программе FlowJo версия 9.4.11.
Апробирование работы молекулярного автомата в растворе
Для исследований и идентификации клеток крови часто используют маркеры, расположенные на клеточной поверхности, известные как кластеры дифференцировки (CD) или мембранные маркеры. У клеток, принадлежащих к различным клеточным популяциям, и, более того, у клеток, проходящих различные стадии дифференцировки, набор таких белков на клеточной поверхности часто является уникальным [146]. Таким образом, во многих случаях, определив набор белков CD на клеточной поверхности, можно сделать вывод о типе интересуемой клетки, также стадии е дифференцировки [147]. В некоторых диагностических системах, созданных для выявления доброкачественных и злокачественных ухолей, используются методы определения наборов белков CD [148]. В последнее время такие не инвазивные или минимально инвазивные методы выявления ранних стадий злокачественных опухолей и предраковых состояний, основанные на определении опухолевых маркеров, том числе, поверхностных репертуаров CD, стали играть существенную роль клинической медицине [149-151].
Процедуру определения наборов белков CD называют типированием клеток и обычно проводят при помощи антител, специфичных к белкам CD и конъюгированных с флуорофорами. Детекцию при этом осуществляют с использованием проточной цитофлуориметрии [136]. Как было отмечено выше, для проведения фенотипирования определенной популяции клеток определения наличия лишь одного маркера обычно недостаточно. Поэтому при проведении фенотипирования, как правило, одновременно определяют наличие не менее, чем двух маркеров. Для этого приходится использовать целый набор конъюгатов антител с различными флуорофорами, а также другие дорогостоящие реагенты и приборы [152, 153]. Поэтому особенный интерес могут представлять новые методики, позволяющие с использованием минимального количества флуорофоров быстро и селективно определять, а при необходимости и выделять интересующие субпопуляции клеток [154, 155].
Целью данной работы явилось создание «молекулярного автомата», способного при помощи двух флуорофоров, идентифицировать уникальные субпопуляции клеток. Молекулярным автоматом было предложено называть совокупность взаимодействующих между собой молекул, способных в ответ на определенное внешнее воздействие подвергаться направленным структурным изменениям, приводящим к серии последовательных взаимодействий этих молекул [156, 157]. В нашей работе для создания молекулярных автоматов были использованы структуры, образованные олигонуклеотидами по принципу комплементарности ДНК. При этом величина энергии связывания олигонуклеотидов определялась разницей в длине комплементарных участков олигонуклеотидов. При активации работы сконструированного нами молекулярного автомата в результате более высокой энергии связывания одних олигонуклеотидов с другими происходило последовательное вытеснение олигонуклеотидов, приводящее к каскаду последовательного замещения олигонуклеотидов. Визуализация этих процессов становилась возможной при использовании флуорофоров совместно с гасителями флуоресценции. Сшитые с олигонуклеотидами, участвующими в каскадах последовательного замещения олигонуклеотидов, флуорофоры и гасители флуоресценции при проведении каскадов оказывались сближенными, или наоборот разделенными. В результате, появлялась возможность флуориметрической детекции соответствующих снижений или усилений флуоресцентных сигналов. 3.1.2. Теоритические основы для создания молекулярных автоматов
Для проведения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов было предложено использовать дуплексы олигонуклеотидов, частично комплементарных друг другу, а для запуска работы молекулярного автомата предполагалось добавлять олигонуклеотид, инициирующий реакцию последовательного замещения олигонуклеотидов, который было предложено назвать «триггером». Нами был разработан, следующий механизм работы молекулярного автомата. После смешивания олигонуклеотида 0 (триггера) дуплекса олигонуклеотидов 5 6 дуплексами олигонуклеотидов 1 и 2 и олигонуклеотидов 3 и 4 должны произойти следующие процессы (Рис. 3.1):
1. Триггер, присутствующий избытке растворе, свяжется со свободным «липким концом» олигонуклеотида 1 и за счет большей энергии связывания олигонуклеотидов 0 и 1 по сравнению с энергией связывания олигонуклеотидов 1 и 2 вытеснит олигонуклеотид 2. Образование дуплекса, состоящего из олигонуклеотидов 0 и 1 приведет к тому, что флуоресцентный сигнал цианина, ковалентно сшитого с олигонуклеотидом 1, будет погашен гасителем флуоресценции Iowa BlackRQ, содержащимся труктуре олигонуклеотида 0. Это должно приводить к снижению детектируемого методом проточной цитофлурометрии флуоресцентного сигнала цианина (Рис. 3.1.А).
2. Высвободившийся олигонуклеотид 2, свяжется с «липким концом» олигонуклеотида 3, и, итоге, за счет большей энергии связывания олигонуклеотидов 2 3 о сравнению с энергией связывания олигонуклеотидов 3 4 сформируют дуплекс, состоящий из олигонуклеотидов 2 и 3.
Избыток конъюгатов олигонуклеотид-антитело, находящихся в растворе, не влияет на прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов
С целью выявления возможного влияния не связавшихся с поверхностными антигенами конъюгатов антитело-олигонуклеотид на прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов были специально проведены два дополнительных каскада последовательного замещения олигонуклеотидов. Эти каскады последовательного замещения олигонуклеотидов можно описать с помощью формул: 0 + l»2aCD3 + 3»4aCD20 + 5»6 - 0»1 + aCD32»3 + aCD2 )4»5 + 6 и 0 + l»2aCD3 + 3»4aCD8 + 5«6 " 0»1 + аСБз2»3 + aCD84»5 + 6. Для проведения первого из них лимфоцитарные клетки инкубировали с молекулярным автоматом, компонентами которого являлись конъюгаты олигонуклеотидов с антителами к CD3 и к CD20, в то время как для торого лимфоцитарные клетки инкубировали с молекулярным автоматом, компонентами которого являлись конъюгаты олигонуклеотидов с антителами к CD3 и к CD8. После инкубаций смеси разделяли пополам. Далее часть пробы отмывали от непрореагировавших конъюгатов, после чего добавляли дуплекс, олигонуклеотида 5, сшитого с флуоресцеином, и 6, содержащего гаситель флуоресценции флуоресцеина Iowa BlackFQ, а также -олигонуклеотид 0, запускающий каскад последовательного взаимодействия между этими элементами молекулярного автомата (Рис. 3.15.А и Б). Другую часть пробы не отмывали от непрореагировавших конъюгатов, а сразу к ней добавляли дуплекс, состоящий из олигонуклеотидов 5 и 6, и олигонуклеотид 0 (Рис. 3.15.В и Г). В первом случае в пробах как отмытых от антител, так и не отмытых от антител в результате проведения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов, направленных на одновременное определение CD20 и CD3, регистрировали снижение флуоресцентного сигнала цианина, в то время к усиление флуоресцентного сигнала флуоресцеина не регистрировалось (Рис. 3.15. А и В). Отсутствие регистрируемого флуоресцентного сигнала флуоресцеина, позволяет предположить, что каскады последовательного замещения олигонуклеотидов не проходили, что соответствует результатам экспериментов, проведенных ранее (см. п. 3.2.7). Во втором случае, в пробах, отмытых и не отмытых от антител, в результате проведения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов направленных на одновременное определение CD8 и CD3, регистрировалось снижение флуоресцентного сигнала цианина и усиление сигнала флуоресцеина (Рис. 3.15. Б ). Такие изменения интенсивности регистрируемых сигналов можно объяснить взаимодействием олигонуклеотида 0 с лигонуклеотидом 1, приводящее к вытеснению олигонуклеотида 2. В результате, образованный дуплекс олигонуклеотидов 0 и 1 переходил с поверхности клетки в раствор. Вместе с олигонуклеотидом 1 с поверхности клетки в раствор переходил и цианин, флуоресценция которого в значительной степени гасилась при помощи Iowa BlackRQ. Кроме того, олигонуклеотид 2 комплементарно взаимодействовал с олигонуклеотидом 3, образуя дуплекс олигонуклеотидов 2 и 3, так как имел большее родство олигонуклеотиду 3, чем олигонуклеотид 4.
Олигонуклеотид 4 связывался со свободным «липким концом» олигонуклеотида 5 дуплекса, состоящего из олигонуклеотидов 5 и 6, заменяя собой олигонуклеотид 6. Это приводило разделению флуоресцеина, сшитого олигонуклеотидом 5, и гасителя флуоресценции, сшитого олигонуклеотидом 6, что детектировалось как усиление регистрируемого сигнала флуоресцеина. Из этого следует, что каскад последовательного замещения олигонуклеотидов происходил.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что не связавшиеся с клетками конъюгаты антител с олигонуклеотидами не влияют на прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов.
Гистограммы распределения клеток, иллюстрирующие отсутствие влияния избыточного количества конъюгатов олигонуклеотид-антитело. А. Б. Гистограммы распределения клеток (%), отмытые от непрореагировавших конъюгатов. В. Г. Гистограммы распределения клеток (%), не отмытые от непрореагировавших конъюгатов. Красная кривая – гистограмма распределения клеток по интенсивности аутофлуоресценции. Синяя кривая – гистограмма распределения клеток по интенсивности флуоресценции флуоресцеина от лимфоцитов, инкубированных с конъюгатами олигонуклеотидов с антителами. Зеленая кривая - гистограмма распределения клеток по интенсивности флуоресценции флуоресцеина от лимфоцитов, инкубированных с конъюгатами олигонуклеотидов с антителами, и дуплекса олигонуклеотидов 5 и 6. Черная кривая - гистограмма распределения клеток по интенсивности флуоресценции флуоресцеина после прохождения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов.
Прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов не зависит т определенного олигонуклеотида и определенного антитела, составляющих конъюгат В экспериментах, описанных выше (п. 3.2.5.), антитела к CD45 конъюгировали олигонуклеотидом 2, разующим дуплекс олигонуклеотидом 1, в то время как для подтверждения гипотезы, что работа молекулярного автомата не зависит от сочетания определенного олигонуклеотида и определенного антитела, антитела к CD45 конъюгировали с олигонуклеотидом 4, образующим дуплекс олигонуклеотидом 3. Антитела к CD20 в экспериментах, описанных в п. 3.2.5 (Рис. 3.9.А и Б) были конъюгированы с олигонуклеотидом 4, образующим дуплекс с олигонуклеотидом 3, в то время как для проведения данного эксперимента эти антитела конъюгировали с олигонуклеотидом 2, образующим дуплекс с олигонуклеотидом 1. После инкубации клеточной суспензии с конъюгатами, к полученной суспензии добавляли дуплекс олигонуклеотидов 5 и 6 и триггер реакции олигонуклеотид 0. В результате, и прохождении каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов, происходило снижение флуоресцентного сигнала цианина и увеличение флуоресцентного сигнала флуоресцеина (Рис. 3.16), из чего можно сделать вывод о том, что после добавления олигонуклеотида 0, происходило его взаимодействие олигонуклеотидом 1 и вытеснение олигонуклеотида 2 за счет большей энергии связывания олигонуклеотидов 0 и 1 по сравнению с энергией связывания олигонуклеотидов 1 и 2. Образованный дуплекс олигонуклеотидов 0 и 1 перешел с поверхности клетки в раствор. Вместе с олигонуклеотидом 1 с поверхности клетки в раствор перешел и цианин, флуоресценция которого в значительной степени была погашена Iowa BlackRQ. Также, олигонуклеотид 2 комплементарно взаимодействовал с олигонуклеотидом 3, образуя дуплекс олигонуклеотидов 2 и 3, так как имел большее сродство к олигонуклеотиду 3, чем олигонуклеотид 4. Олигонуклеотид 4 связался с олигонуклеотидом 5 дуплекса, состоящего из олигонуклеотидов 5 и 6, заменил собой олигонуклеотид 6 с образованием более стабильного дуплекса, состоящего из олигонуклеотидов 4 и 5 в комплексе с рецептором CD45, что привело к разделению флуоресцеина и гасителя флуоресценции, и детектировалось как увеличение флуоресцентного сигнала флуоресцеина (Рис. 3.16).
Таким образом, в результате проведения каскадов последовательного замещения с измененными дуплексами олигонуклеотидов были получены результаты идентичные первоначальным комбинациям дуплексов олигонуклеотидов с антителами (Рис. 3.9). Из этого следует, что прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов не зависит от сочетания определенного олигонуклеотида и определенного антитела, составляющих канючат, используемый в качестве компонента молекулярного автомата.