Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Нуклеозидные и нуклеотидные аналоги в антивирусной терапии 10
2.2. Нуклеозидные аналоги в терапии ВИЧ-инфекции 13
2.3. Ациклические нуклеозидные и нуклеотидные аналоги с противовирусной активностью 22
2.4. Ациклические нуклеозидные и нуклеотидные аналоги, содержащие ненасыщенные фрагменты в цепи 32
2.5. Оптимизация фармакокинетических свойств нуклеозидных и нуклеотидных аналогов. Пролекарства и депо-формы 36
2.6. Депо-формы 3 -азидо-3 -дезокситимидина 37
2.7. Типы пролекарств нуклеотидных аналогов на основе сложноэфирных производных 49
2.8. Заключение 54
3. Обсуждение результатов 56
3.1. Моно- и бис-нуклеозидные фосфонатные производные 56
3.2. Карбаматные производные 3 -азидо-3 -дезокситимидина 64
3.3. Ациклические нуклеозид-фосфонатные производные, содержащие оксимный фрагмент в цепи 67
4. Экспериментальная часть 79
4.1. Материалы и методы 79
4.2. Общая методика синтеза анионных фосфонатных производных (1c-e). 84
4.3. Общая методика синтеза бис-нуклеозид фосфонатных производных (2, 3) 85
4.4. Общая методика синтеза карбаматных производных (4). 89
4.5. Общая методика синтеза 9-(2,2-диэтоксиэтил)пуринов (6). 93
4.6. Общая методика деблокирования фосфонатных эфиров (9). 5. Выводы 102
6. Список литературы 103
- Ациклические нуклеозидные и нуклеотидные аналоги, содержащие ненасыщенные фрагменты в цепи
- Типы пролекарств нуклеотидных аналогов на основе сложноэфирных производных
- Карбаматные производные 3 -азидо-3 -дезокситимидина
- Общая методика синтеза карбаматных производных (4).
Введение к работе
Актуальность проблемы. Аналоги нуклеозидов/нуклеотидов широко
используются в клинике для лечения социально значимых заболеваний, вызванных такими опасными вирусами, как вирус иммунодефицита человека, вирусы герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловирус, и другие. Нуклеозидные и нуклеотидные аналоги – это синтетические химически модифицированные соединения, миметики природных нуклеозидов, которые в результате структурных биотрансформаций в клетке встраиваются в ДНК или РНК и ингибируют вирусную репликацию или клеточное деление. Помимо встраивания в нуклеиновые кислоты, они могут взаимодействовать и ингибировать важные ферменты метаболизма нуклеиновых кислот, такие как нуклеотидполимеразы вирусов и человека, киназы, рибонуклеотидредуктазы, ДНК-метилтрансферазы, пуриновые или пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы и другие.
Для более эффективного подавления многих вирусных заболеваний, в частности, ВИЧ-инфекции, применяется комбинированная терапия – одновременное использование нескольких типов препаратов, направленных на разные вирусные мишени. ВИЧ-инфицированные больные часто ко-инфицированы другими вирусами, например, более 80% из них страдают от сопутствующего вируса герпеса. Проводятся поиски соединений, одновременно подавляющих несколько типов вирусов, возможностей улучшения свойств уже применяемых лекарств: снижения их токсичности для неинфицированных клеток и уменьшения кратности приёма, а также изучение эффектов аддитивности и синергизма препаратов. За последние десятилетия были созданы эффективные антивирусные препараты на основе аналогов нуклеозидов, ставшие основой высокоактивной антиретровирусной терапии. В организме они проходят каскад фосфорилирования клеточными киназами до трифосфатов, которые являются субстратами обратной транскриптазы ВИЧ, встраиваются в растущую цепь ДНК и терминируют репликацию вируса. Биологическая активность таких соединений зависит в значительной степени от структуры и конформации сахарного фрагмента. Против некоторых типов вирусов получили распространение ациклические производные нуклеозидов и нуклеотидов с измененными фрагментами рибозного цикла, которые, в основном, имеют схожий с рибозосодержащими нуклеозидами механизм действия на полимеразы вирусов. Обладая отличными от природных конформаций диэдральными углами и степенями свободы, ациклические нуклеозидные аналоги могут проявить бльший спектр
4 активности против нескольких типов вирусов, а введение фосфонатного остатка позволяет имитировать фосфат нуклеотида и не нуждаться в первой (обычно лимитирующей) стадии фосфорилирования, оставаясь стабильным в биологических средах.
Тем не менее, многим из применяемых препаратов присущи недостатки, такие как плохая растворимость, токсические побочные эффекты при длительном использовании препаратов, а также неизбежное возникновение резистентных к ним штаммов вируса, что приводит к значительному снижению эффективности имеющихся лекарственных средств. Одним из способов решения этих проблем является синтез биодеградируемой депо-формы лекарственных препаратов. В качестве удачных примеров можно назвать анти-ВИЧ препарат тенофовир дизопроксил фумарат (Viread), являющийся депо-формой ациклического аналога аденозина, а также 5’-H-фосфонат 3’-азидо-3’-дезокситимидина – фосфазид (Никавир) – первый отечественный анти-ВИЧ препарат, созданный в нашей лаборатории. Их применение позволило снизить побочные эффекты исходных нуклеозидов, продлить время нахождения в организме и уменьшить кратность приёма в сутки. Таким образом, синтез новых ациклических фосфонатных производных нуклеозидов и создание различных депо форм ингибиторов репликации вирусов считается перспективным направлением развития антивирусной терапии.
Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научно-
исследовательских работ ИМБ РАН по поиску прототипов лекарственных средств с антивирусной активностью (программа «Молекулярная и клеточная биология») и при финансовой поддержке грантов РФФИ (12-04-00581-а и 14-04-31163-мол_а).
Целью работы было создание ингибиторов репликации ВИЧ и других сопутствующих ему вирусов на основе ациклических фосфонатных нуклеозидов и депо-форм нуклеозидных аналогов.
Задачами работы являлись 1) синтез новых карбаматных и фосфонатных депо-форм известных анти-ВИЧ препаратов зидовудина (3’-азидо-3’-дезокситимидина, AZT) и ламивудина (L-2’,3’-дидезокси-3’-тиацитидина, 3ТС) и изучение их антивирусной активности и токсичности на клетках, а также отдельных соединений на животных моделях; 2) разработка схем синтеза и получение новых ациклических фосфонатных производных аденина и гуанина, содержащих оксимный фрагмент в цепи, изучение их антивирусной активности в культурах клеток, инфицированных
5 ВИЧ, вирусами герпеса и гепатита С, определение токсичности соединений на неинфицированной культуре клеток.
Научная новизна. Предложены методы синтеза новых карбаматных и бис-нуклеозидфосфонатных производных и осуществлен их синтез. При этом впервые получен смешанный бис-нуклеозидфосфонат AZT и 3TC, содержащий при одном фосфонатном остатке два различных нуклеозидных аналога с анти-ВИЧ активностью. Разработана методика получения фосфонатных ациклических аналогов нуклеотидов с оксимным фрагментом в цепи, предложены оптимизация синтеза, детекция и очистка соединений для повышения выхода целевых продуктов.
Практическая ценность. Данная диссертационная работа расширяет опыт
синтеза пролекарственных препаратов на основе нуклеозидных аналогов и даёт
достаточно полное представление о фармакокинетических характеристиках новых
фосфонатных и карбаматных производных известных анти-ВИЧ препаратов. Синтез
ациклических нуклеотидных аналогов обычно индивидуален для каждого отдельного
типа структуры, однако предложенный в работе подход обладает универсальностью и
позволяет не только в дальнейшим расширять ряд оксимных производных, измененяя
заместители боковой цепи, но и использовать ключевой интермедиат для
функционализации фосфонатным остатком любого карбонил-содержащего
производного через “click”-реакцию синтеза оксимов. Выход интермедиата удалось повысить вдвое по сравнению с описанными методиками его синтеза, а также выявить новые способы детекции О-замещенных гидроксиламинов.
Степень достоверности и апробация работы. Строение и чистота полученных соединений подтверждены данными 1H, 13C, 31P и 15N ЯМР спектроскопии, в том числе с использованием методов 2D (COSY, HSQC и HMBC) ЯМР, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения
Основные положения диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: 2nd Russian Conference on Medicinal Chemistry «MedChem-2015» (г. Новосибирск, 2015), 28th International Conference on Antiviral Research «ICAR-2015» (Италия, г. Рим, 2015), Innovative Approaches for Identification of Antiviral Agents Summer School «2nd IAAASS» (Италия, Санта Маргерита ди Пула, 2014), 15th Tetrahedron Symposium – Challenges in Bioorganic & Organic Medicinal Chemistry (Великобритания, г. Лондон, 2014), Первая Российская конференция по медицинской химии «MedChem Russia» с международным участием (г. Москва,
6 2014), Congress of the Federation of European Biochemical Societies – Mechanisms in Biology «38th FEBS» (г. Санкт-Петербург, 2013), Весенний и осенний финалы по программе «У.М.Н.И.К.» РАН (г. Москва, 2012), IV Всероссийский научно-практический семинар молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах, 9 тезисов в материалах отечественных и зарубежных конференций и получен один патент Российской Федерации.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из 8 частей: Введения, Литературного обзора (посвященного методам синтеза нуклеозидных/нуклеотидных аналогов и их производных, а также основным механизмам воздействия на вирусы), Обсуждения результатов, Выводов, Экспериментальной части, Списка литературы, Благодарностей и Приложения. Список цитируемой литературы состоит из 258 наименований.
Ациклические нуклеозидные и нуклеотидные аналоги, содержащие ненасыщенные фрагменты в цепи
В это же время появились первые данные о механизмах действия нуклеозидных аналогов, и поиск действенных модификаций для терапии вирусных инфекций и рака стал развиваться в разных направлениях. С точки зрения узнавания ферментами модификация нуклеозида может касаться практически любой части молекулы, но для эффективного встраивания в нуклеиновые кислоты гетероциклическое основание должно не слишком сильно отличаться от природных Ade, Thy, Gua, Cyt, Ura или Hyp. Большинство противовирусных препаратов в своей структуре имеют природные нуклеиновые основания, а основные изменения, блокирующие рост вирусной ДНК, внесены в рибозную часть.
Применяемые в терапии нуклеозидные и нуклеотидные аналоги используют те же метаболические пути, что и эндогенные нуклеозиды и нуклеотиды. Они проникают в клетку через специальные нуклеозидные транспортеры, и внутри клетки последовательно фосфорилируются нуклеозид-, нуклеозидмонофосфат- и нуклеозиддифосфаткиназами. В случае нуклеотидных аналогов, где первый фосфат или его аналог уже присутствуют в молекуле, в каскаде трансформаций участвуют два последних фермента. При этом обычно первая стадия фосфорилирования оказывается лимитирующей как для нуклеозидных, так и для нуклеотидных аналогов, а финальная - образование соответствующего трифосфата или его аналога - происходит легче всего и может катализироваться сразу несколькими ферментами, например, дополнительно креатинкиназой или фосфоглицераткиназой [4].
В клетках, инфицированных ДНК-вирусами (например, семейства герпес-вирусов), первое и второе фосфорилирование тимидина происходит с помощью вирус-кодируемой тимидинкиназы (Рис. 2) [4]. Этот фермент имеет большое значение в виду его более широкой, чем у клеток млекопитающих, субстратной специфичности к другим нуклеозидам - он может фосфорилировать и уридиновые и цитидиновые нуклеозиды, а также тесно взаимосвязан с циклом Кребса в инфицированной клетке и метаболизмом жирных кислот [5]. Кодируя лишь тимидинкиназу из числа других нуклеозидкиназ, вирус герпеса может поднять общий пул и остальных трифосфатов 2 -дезоксинуклеозидов в клетке, необходимых для собственной репликации. Эти свойства тимидинкиназы определяют выбор тех или иных нуклеозидных/нуклеотидных аналогов в качестве антигерпетических препаратов [6]. Клеточная монофосфат киназа рас УГ % ТДА " Матрица ДНК вируса простого герпеса Рис. 2. Механизм действия нуклеозидных аналогов (ингибиторов ДНК-полимеразы) в клетке, инфицированной вирусом простого герпеса, на примере ацикловира. Моно-, ди- и трифосфорилированные нуклеозидные аналоги являются активными формами препаратов – конкурентными субстратами для клеточных и вирусных ферментов, таких как нуклеотидполимеразы; кроме того, посредством ферментов трифосфатные аналоги встраиваются в растущие цепи ДНК и РНК. Отсутствие 3 -гидроксигруппы в углеводном фрагменте нуклеозидного/нуклеотидного аналога препятствует образованию 3 -5 фосфодиэфирных связей между аналогом и новым встраиваемым нуклеозид 5 -трифосфатом, приводя к терминации синтеза растущей цепи вирусной ДНК или РНК. В качестве основных мишеней таких соединений могут выступать: обратная транскриптаза ВИЧ (выполняет функции РНК-зависимой и ДНК-зависимой ДНК-полимеразы), репликаза гепатита B (выполняет функции РНК-зависимой и ДНК-зависимой ДНК-полимеразы), РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гепатита С, герпесвирусная тимидин-киназа и герпесвирусная ДНК-зависимая ДНК-полимераза [7-10]. Вирусные полимеразы часто имеют более слабую субстратную специфичность к нуклеотидам и поэтому более склонны к встраиванию аналогов, чем клеточные полимеразы, что и является основой противовирусной терапии [11].
С момента регистрации первых пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита в 1982 г. потребовалось полтора года исследований для открытия и характеризации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) Люком Монтанье и его коллегами [12]. История анти-ВИЧ терапии началась с 3 -азидо-3 -дезокситимидина (Зидовудин, AZT) – изначально синтезированного в 60-х гг. в рамках скрининга антираковых соедиений, но впоследствии одобренного FDA в качестве анти-ВИЧ препарата (1985 г.), когда была показана его активность [13]. С этого момента он стал первым в ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors – NRTIs). Исследования по замещению в природных нуклеозидах 3 -позиции на азидогруппу показали, что тимидиновый аналог наиболее эффективно подавляет обратную транскрипцию [14]. В течение многих лет AZT оставался единственным лекарственным препаратом, ограничивающим ВИЧ-инфекцию и увеличивающим продолжительность жизни больных СПИДом, его использование задерживает развитие ВИЧ и улучшает выживаемость пациентов с различными сопутствующими инфекциями. Фармакокинетика, фармакодинамика и терапевтическая эффективность AZT описана в ряде обзоров [15]; AZT уменьшает вероятность передачи ВИЧ-1 от матери к ребенку [16], у взрослых пациентов с ВИЧ-инфекцией снижаются неврологические дисфункции, улучшаются память, внимание, моторные функции и когнитивные возможности [17]. Тем не менее, монотерапия AZT оказалась недостаточной для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов ввиду достаточно высокой токсичности для печени и ЦНС и быстрого появления резистентных штаммов вируса вследствие множественных мутаций (в аминокислотных остатках M41L, D67N, K70R, T215Y/F и K219Q/E) в обратной транскриптазе вируса, кодируемой pol-геном [18-19]. Хотя AZT эффективно подавляет репликацию ВИЧ, он не останавливает выработку вируса хронически инфицированными клетками или передачу инфекции незараженным клеткам через ранее образовавшиеся синцитии (сливание нескольких клеток, с образованием общей цитоплазмы и нескольких ядер) [20]. AZT является одним из наиболее липофильных анти-ВИЧ соединений (log P = 0,08 в смеси н-октанол : фосфатный буфер pH 7,4), использующихся в клинике, и он свободно проникает в спинномозговую жидкость, благодаря пассивной диффузии или активному транспорту [21]. Однако прохождение в мозговые ткани из спинномозговой жидкости недостаточно для обеспечения терапевтической концентрации, которая подавляет репликацию вируса в мозге [22]. Анти-ВИЧ агенты должны иметь возможность прохождения через гематоэнцефалический барьер в эффективной для терапии концентрации без увеличения токсичности ввиду того, что зараженные клетки мозга служат своего рода убежищем для ВИЧ, из которого происходит повторное заражение всех остальных органов. AZT используется в составе комбинированной терапии при лечении ВИЧ-инфицированных, несмотря на 30-летний опыт применения и наличие более 25 других разрешенных лекарств против ВИЧ-инфекции.
В период 1991-1994 гг. к списку лекарств добавились другие NRTI – 2 ,3 -дидезоксиинозин (ddI), 2 ,3 -дидезоксицитидин (ddC) и 2 ,3 -дидегидро-3 -дезокситимидин (d4T). В 1995 г. для терапии был одобрен L-2 ,3 -дидезокси-3 -тиацитидин (3TC) – впервые L-энантиомер, обратный природной конфигурации, оказался эффективным ингибитором обратной транскриптазы и менее цитотоксичным, чем его D-аналог [23]. 3TC имеет особенности, которые не встречаются у других нуклеозидных аналогов, например, основная часть препарата не метаболизируется и выводится неизменной с мочой [24], что позволяет ему накапливаться в гениталиях больше, чем любому другому из ингибиторов обратной транскриптазы или протеазы ВИЧ и препятствовать передаче инфекции между людьми и от беременной матери ребёнку [25]. 3TC и родственный ему аналог FTC не подвергаются дезаминированию цитидиндезаминазой, в отличие от цитозин-содержащих D-нуклеозидов [26].
В данный момент восемь NRTI одобрены для терапии ВИЧ (Рис. 3): 3 -азидо-3 -дезокситимидин (AZT, Зидовудин, Тимазид, Retrovir), 2 ,3 -дидезоксиинозин (ddI, Диданозин, Videx), L-2 ,3 -дидезокси-3 -тиацитидин (3TC, Ламивудин, Epivir), 2 ,3 -дидезоксицитидин (ddC, Зальцитабин, Hivid), 2 ,3 -дидегидро-3 -дезокситимидин (d4T, Ставудин, Zerit), 2-амино-9-[(4-гидроксиметил)циклопент-2-ен-1-ил]-6-циклопропиламино-пурин (ABC, Абакавир, Ziagen), (R)-9-[2-(фосфонометокси)-пропил]аденин бис(изопропил-оксикарбонилоксиметил) фумарат (TDF, bis-POC-PMPA fumarate, Тенофовир дипивоксил фумарат, Viread) и L-5-фтор-2 ,3 -дидезокси-3 -тиацитидин (FTC, Эмтрицитабин, Emtriva) [27].
Типы пролекарств нуклеотидных аналогов на основе сложноэфирных производных
Открытие (S)-HPMPA укрепило новую концепцию сочетания нуклеозида с фосфонатным остатком [81]. Новое вещество имело заметную активность против практически всех ДНК-вирусов, включая те, которые не индуцируют тимидинкиназу, отвечающую за фосфорилирование нуклеозида, например, штаммы вируса герпеса, которые стали резистентными к ацикловиру из-за недостатка тимидинкиназы (штаммы ВПГ TK–). Так, EC50 против репликации таких вирусов как ВПГ-1 TK+ и TK–, ВПГ-2 и ЦМВ составляет от 0,33 до 0,66 мкМ, а для вируса Варицелла-Зостер эта концентрация составляет 0,033-0,17 мкМ. НРМРА показал активность против семейства вирусов оспы и относительно низкую токсичность (CCso 300 мкМ). В клетках Vero и LCC-MK2, инфицированных различными штаммами вирусов оспы, его IС50 составляла от 15 до 42 мкМ; в отношении клеток, инфицированных вирусом коровьей оспы - 26 мкМ; в клетках, инфицированных вирусом обезьяньей оспы - 32 мкМ [82]. Кроме того, НРМРА подавляет репликацию ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в инфицированных клетках при ЕС50 = 66 мкМ [83].
И хотя в дальнейшем НРМРА не был одобрен в качестве противовирусного лекарства, он стал прототипом цитидинового аналога (S)-HPMPC (Вистид, цидофовир), поступившего в продажу в 1996 году для терапии ренита, вызываемого цитомегаловирусом человека.
Коммерчески успешным ациклическим фосфонатным аналогом нуклеотидов стал 9-(2-фосфонометоксиэтил)аденин (адефовир, РМЕА), полученный в то же время, что и НРМРА [81]. Для его синтеза использовали два подхода (Рис. 18).
В первом случае 9-(2-гидроксиэтил)-М6-бензоиладенин [84] (возможен упрощенный синтез и без блокированного бензоилом по -позиции основания) алкилировали диметил тозилоксиметилфосфонатом, с последующим деблокированием метильных и бензоильной групп под действием щелочи и триметилиодсилана. Метод не позволяет получить высокий выход. Среди диэфиров тозилоксиметилфосфоната в синтезе ациклических фосфонатных аналогов отдаётся предпочтение диэтиловым и диизопропиловым, т.к. они более стабильны в присутствии щелочей [85]. Второй способ синтеза заключался в алкилировании аденина фосфонометоксиэтил-производными с последующим деблокированием эфиров под действием TMS-Br; выходы РМЕА в этом случае достигают 47% [86].
РМЕА показал антивирусную активность против вирусов различных семейств, таких как ретровирусы, герпесвирусы и гепаднавирусы. Он проявил значительную активность против ВИЧ [87], вируса лейкоза мышей (R-MuLV) [88], простого герпеса, цитомегаловируса у мышей (MCMV) [89], вируса иммунодефицита обезьян (SIV) [90] и кошек (FIV) [91]. Дополнительно было обнаружено, что основной метаболит – дифосфат PMEA – блокирует активность токсина из Bacillus anthracis, и потенциально может применяться в терапии сибирской язвы и других инфекций, вызванных бактериями, продуцирующими аденилатциклазу [92]. PMEA обладает значительной биодоступностью при внутримышечном, внутривенном и внутрибрюшинном введении, в то время как при пероральном применении его биодоступность очень мала – меньше 1% у обезьян и 11% у мышей [90]. В 2000 году FDA дала отказ на применение PMEA (под торговым названием Preveon) в качестве анти-ВИЧ препарата из-за заметной токсичности для печени. Для снижения токсичности были изучены депо-формы этого аналога; оптимальным показали себя пивалоилоксиметильные эфиры фосфоната, деградирующие в организме до целевого ациклического аналога. Bis-POM PMEA (адефовир дипивоксил) с 2002 г. применяется для лечения инфекций, вызванных вирусом гепатита В под торговым названием Hepsera.
Аналог PMEA с «укороченной цепью», 9-(фосфонометоксиметил)аденин не показал активности в клетках, инфицированных ВИЧ и герпес-вирусами. Были исследованы различные ациклические аналоги (Рис. 19), обладающие схожей с PMEA и HPMPA ациклической частью, варьировались заместители и длина цепи в 9-(фосфонометоксиалкил)аденинах [93, 94].
Однако ни одно из перечисленных (Рис. 19) соединений не проявило антивирусной активности в тестах на инфицированных клетках. Вероятно, стерическая загруженность заместителями при ациклическом фрагменте не позволяет веществам эффективно связываться в активном центре, а ферментам вируса – узнавать эти молекулы. Большое значение имеет длина ациклического фрагмента, а именно, расстояния между фосфором фосфонатного остатка и N9 атомом азота основания, и его гибкость [95]. В ходе вариаций по нуклеиновому основанию в ряду PMEA также были синтезированы производные: урацила, гуанина, цитозина, 5-метилцитозина, 5-фторурацила, 2,6 диаминопурина, 2-метиладенина, 2-метилтиоаденина, N6-диметиладенина, 6-гидразинопурина, 6-гидроксиламинопурина, 6-метилтиопурина, гипоксантина, 2-аминопурина, изогуанина, 1,6-этенаденина, и другие – среди которых высокие активности против ДНК-вирусов показали лишь производные 2,6-диаминопурина (DAP) и гуанина (Gua) [87, 96, 97]. PMEDAP и PMEG синтезировали аналогично PMEA, с общими выходами 56% и 37%, соответственно. Продукты показали высокую активность против герпес-вирусов, сравнимую с PMEA, и незначительную активность против ВИЧ-1 в клетках МТ-4, в то же время, эти соединения показали возросшую токсичность in vitro.
В настоящее время наиболее успешным ациклическим аналогом в комбинированной
терапии ВИЧ инфекции стал препарат Виреад – тенофовир (9-[(R)-(2 фосфонометокси)пропил]аденин, (R)-PMPA) диизопроксил фумарат – производное
нуклеозидфосфоната с родственной адефовиру структурой. Тенофовир отличается от PMEA наличием метильной группы во втором положении цепи, что вносит в структуру хиральный центр. Синтез (R)-PMPA во многом повторяет синтез PMEA, но дополнительную сложность представляет получение конкретного стереоизомера с высокой противовирусной активностью. Впервые (R)-PMPA получен и выделен из рацемической смеси (Рис 20a) [93, 98]. Позже этот синтез был проведён стереоконтролируемо для (R)- и (S)-изомеров исходя из D- и L-изобутиллактата, соответственно. Аналогично из тех же лактатов был опробован и второй путь синтеза, в котором весь ациклический фрагмент синтезировался за 7 стадий и далее был вовлечён в реакцию алкилирования аденина (Рис. 20б) [99].
Карбаматные производные 3 -азидо-3 -дезокситимидина
Последние годы большое внимание уделяется снижению токсичности нуклеозидных аналогов. В случае AZT цитотоксичность обусловлена не только самим нуклеозидом, но и его основными метаболитами – быстро образующимся 5 -монофосфатом и продуктом восстановления 3 -аминотимидином. Блокирование эфиром 5 -OH группы помогает решить проблему быстрого накопления AZT при пероральном приёме и позволяет получить более оптимальный интервал изменения концентраций in vivo за счет постепенного высвобождения целевого нуклеозида.
Среди изученных ранее 5 -нуклеозидных фосфонатных эфиров наиболее перспективным оказался H-фосфонат 3 -азидо-3 -дезокситимидина (фосфазид), который с 1999-го года применяется в терапии заболеваний, вызванных ВИЧ-инфекцией, и зарегистрирован как препарат Никавир в России. В результате исследований фармакокинетики препарата было выявлено, что фосфазид является депо-формой AZT и его активность обусловлена гидролизом фосфонатного фрагмента с высвобождением AZT. Преимуществом фосфазида перед AZT является пониженная токсичность по сравнению с исходным препаратом AZT и более продолжительное время жизни в организме
Кроме фосфазида ранее были изучены H-фосфонаты FLT, ddI и d4T, которые не показали таких преимуществ перед исходными нуклеозидами [155]. Так как одним из основных нуклеозидов в комбинированной терапии ВИЧ является 3TC, мы решили исследовать его H-фосфонат на предмет улучшения фармакокинетики нуклеозида. Синтез проводился по аналогии с ранее изученными фосфонатными производными нуклеозидов – реакцией с фосфористой кислотой под действием дициклогексилкарбодиимида [211] (Рис. 46) Продукт выделяли хроматографией на анионообменной смоле и последующей очисткой на обращенно-фазовом силикагеле.
Совместно с ФГБУ Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ была исследована анти-ВИЧ активность и цитотоксичность 1а в культуре клеткок МТ-4. Как видно из Таблицы 4, H-фосфонат 3ТС значительно менее токсичен, чем нуклеозид, и, как результат, его индекс селективности был выше на порядок, чем у 3TC. (Таблица 4). H-Фосфонат 3TC оказался химически стабильным – время гидролиза половинного количества в буферных растворах (pH 5,5-8,5) было значительно больше 24 ч Изучение фармакокинетики 1а на животных было проведено совместно с фармацевтической фирмой «Ассоциация АЗТ» (фармакокинетические кривые приведены в Приложении, Рис. 59). T1/2 соединения 1a в цельной крови собаки составило 5 ч. Примечательно, что, несмотря на высокую стабильность к гидролизу в цельной крови, фосфонат 1a быстро претерпевал гидролиз после внутрибрюшинного введения кроликам, и в качестве единственного метаболита по данным ВЭЖХ был детектирован лишь 3TC. Максимальная концентрация 3TC в крови кролика была в три раза ниже, чем при введении самого 3TC, в то время как время достижения максимальной концентрации в плазме крови было в три раза большим, а среднее время нахождения в крови – в полтора раза меньшим. Похожий эксперимент проводился и после перорального приема 1a и 3TC собаками. В результате пиковая концентрация 3TC из 1a была в два раза ниже таковой при приёме 3TC, а время достижения максимальной концентрации стало в два раза выше.
Таким образом, полученные данные фармакокинетики на кроликах и собаках имеют общие закономерности с ранее описанными данными по фосфазиду [212] (фармакокинетическая кривая приведена в Приложении, Рис. 60), а именно: более пролонгированное время достижения максимальной концентрации вещества по сравнению с таковой для исходного нуклеозида. Эти результаты показывают, что 1а является первой успешной фосфонатной депо-формой 3TC.
Ранее был исследован ряд фосфонатов AZT, содержащих различные заместители, но все они показали более низкую активность и высокую токсичность, чем H-фосфонат AZT. В то же время, полностью этерифицированный бис-AZT H-фосфонат тоже не показал заметного увеличения активности – второй остаток AZT в молекуле претерпевал быстрый гидролиз и этим объясняется более высокая, чем у фосфазида, цитотоксичность [213]. Бис-AZT производные фосфоновых кислот с другими заместителями практически не изучены, в связи с чем нами были разработаны и синтезированы несколько производных AZT.
Анионные фосфонатные производные 1b-e были получены по известной методике [211], конденсацией AZT с соответствующими фосфоновыми кислотами под действием 1,3-дициклогексилкарбодиимида (Рис. 47). Для потенциального расширения ряда таких производных нами была предложена методика синтеза эфиров фосфонатов через конденсацию нуклеозида с п-толуилсульфонилоксиметилфосфоновой кислотой в присутствии DCC, что позволяет провести дальнейшее замещение тозильной группы в 1b на любой подходящий нуклеофил. Было проведено ранее не описанное в синтезе фосфонатных депо-форм. замещение тозилата в 1b на иодид или азид с образованием 1c и 1d, что можно рассматривать как их альтернативный способ синтеза.
Общая методика синтеза карбаматных производных (4).
В реакциях использовали коммерчески доступные реагенты фирм Aldrich, Acros и Fluka. Растворители очищали в соответствии со стандартными методиками [250]. Необходимые исходные фосфоновые соединения были синтезированы согласно ранее описанным методикам синтеза: иодметилфосфоновая кислота [251], фторметилфосфоновая кислота [252], феноксиметилфосфоновая кислота [253], дихлорид метоксиметилфосфоновой кислоты [254]. 3 -Азидо-3 -дезокситимидин и1-2 ,3 -дидезокси-3 -тиацитидин были предоставлены ЗАО «Ассоциация АЗТ». Ход реакций оценивали по данным тонкослойной хроматографии на пластинках Kieselgel 60F254 (Merck, Германия). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле (Kieselgel 60, 40-63мкм; Merck, Германия), обращеннофазовую хроматографию проводили с использованием LiChroprep RP-8 и LiChroprep RP-18 (25-40 мкм, Merck, Германия); ионообменную колоночную хроматографию - на DEAEoypearl (НСОз ) 650 М (Tosoh, Япония). Элюаты упаривали от растворителей на роторном испарителе и анализировали методом ЯМР-спектроскопии, целевые фракции лиофилизовали.
Спектры ЯМР (5, м.д.; J, Гц) регистрировали на спектрометре Bruker AMX III -400 с рабочей частотой 400 МГц для Н-ЯМР, 162 МГц для 31Р-ЯМР (с подавлением фосфор-протонного спин-спинового взаимодействия) и 100,6 МГц для 13С-ЯМР (с подавлением углерод-протонного спин-спинового взаимодействия), а также 15№ЯМР (40,5 МГц с подавлением азот-протонного спин-спинового взаимодействия). Химические сдвиги измеряли с точностью до 0,01 м.д. для протонных и фосфорных спектров, до 0,1 м.д. для углеродных и азотных спектров, КССВ с точностью до 0,1 Гц. Для отнесения сигналов протонов и углеродов использовали гомоядерные Ъ- н COSY и гетероядерные -"C COSY, HMBC (через 2 и 3 связи: VH-C-C, Н-С-С-С) спектры, для отнесения сигналов азотов использовали INEPT (через 1 и 2 связи с азотом: VNH, VNH). Спектры поглощения измерены на спектрофотометре UV-2401PC (Shimadzu, Япония) в метаноле при рН 7,0 в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Масс-спектры регистрировались в лаборатории механизмов реакций ИНЭОС РАН, Москва, на приборе LCMS-2020 (Shimadzu, Япония), методом электрораспылительной ионизации. Измерения выполнены на положительных (напряжение на капилляре 4800 V) ионах, скорость потока 200 мкл/мин, напряжение 4,5 кВ, температура обогреваемого капилляра 350С. Измерения масс-спектров высокого разрешения выполнены в Отделе структурных исследований ИОХ РАН, Москва. Спектры высокого разрешения зарегистрировали на приборе Bruker maXis методом электрораспылительной ионизации (ESI). Измерения выполнены на положительных (напряжение на капилляре 4500 V) ионах. Диапазон сканирования масс m/z 50-3000 Да, калибровка внешняя (Electrospray Calibrant Solution, Fluka, Швейцария). Использовался шприцевой ввод вещества для растворов в ацетонитриле, скорость потока 3 мкл/мин. Газ-распылитель азот (4 л/мин), температура интерфейса 180C.
Стабильность в плазме крови человека тестируемых соединений 2 исследовалась при 37С в концентрациях 0,5 мкМ. Стабильность соединений 1e-g в крови собаки тестировали при инкубации 10-20 мкг соединений в 1 мл крови с гепарином при 37С. Во всех случаях спустя выбранные интервалы времени (15 мин интервал между 0 и 2 ч инкубации и 1 ч интервал между 2 и 12 ч инкубации) отбирали аликвоту из образца, и терминировали гидролиз добавлением охлажденного метанола до 66 % (об.). Образующийся осадок центрифугировали в течение 15 мин при 20000 g на приборе Eppendorf 5415 (Eppendorf AG, Германия). Супернатант был упарен на автоматическом центрифужном концентраторе SpeedVac AS260 (Savant, США), осадок растворяли в 5 мМ водном фосфатном буфере (pH 5,2), продукты гидролиза анализировали ВЭЖХ, в качестве контрольных использовали исходные соединения и AZT.
ВЭЖХ проводилась на хроматографе (Gilson, США) с цифровым контроллером GSIOC 506 и УФ-детектором Gilson-315 с переменной длиной волны и на хроматографе Gynkotek (Optimize Technologies Inc., США) с аналогичными характеристиками. Соединения детектировали при 267 нм, для соединений 1, 2, 3 и 8 использовали колонки Nucleosil 100 C-18 (5 мкм, 4 150 мм) с предколонками картриджного типа C-18 (10 мкм, 4 8 мм); для соединений 4 использовали колонки Ultrasphere ODC (5 мкм, 4,6 250 мм Beckman Coulter, США) с предколонками картриджного типа C-18 (10 мкм, 4,6 25 мм). В качестве мобильной фазы для анализа соединений 2 и 3 использовали 80% водный раствор этанола (A) в 5 mM водном фосфатном буфере (pH 5,20); в качестве мобильной фазы для анализа соединений 1 использовали 80% водный раствор этанола (A) и 0,1% гептафторбутановой кислоты (pH 3,0,), качестве мобильной фазы для анализа соединений 8 использовали 80% водный раствор этанола (A) в воде (B). Параметры градиента концентраций для 1e: 0% A в течение 5 мин.; 0%7% A в течение 7 мин.; 7%20% A в течение 28 мин.; 20%100% A в течение 5 мин.; 100%0% A в течение 5 мин; скорость потока 0,5 мл/мин; времена удерживания: 3TC – 27,4 мин; 1e – 15,9 мин. Параметры градиента концентраций для 1g: 0% A в течение 5 мин.; 0%30% A в течение 30 мин.; 30%100% A в течение 5 мин.; 100%0% A в течение 5 мин; скорость потока 0,5 мл/мин; времена удерживания: 3TC – 23,3 мин; 1g – 7,4 мин. Параметры градиента концентраций для соединений типа 2 и 3: 0% A в течение 5 мин.; 0%15% A в течение 5 мин.; 15%30% A в течение 10 мин.; 30%70% A в течение 20 мин.; 70%100% A в течение 5 мин; 100%0% A в течение 5 мин; 0% A в течение 5 мин; скорость потока 0,5 мл/мин; времена удерживания: AZT – 19,8 мин, 3TC – 15,3 мин, 2a – 36,7 мин, 2b – 29,0 мин, 2d – 29,7 мин, 2e – 34,0 мин, 2f – 32,0 мин, 3 – 32,0 мин, Ph-P(O)(OH)(AZT) – 23,8 мин, CH3OCH2-P(O)(OH)(AZT) – 16,3 мин, PhOCH2-P(O)(OH)(AZT) – 25,7 мин, PhOCH2-P(O)(OH)(3TC) – 20,6 мин, FCH2-P(O)(OH)(AZT) – 16,7 мин, ICH2-P(O)(OH)(AZT) – 20,3 мин, N3CH2-P(O)(OH)(AZT) – 17,8 мин. Параметры градиента концентраций для соединений типа 4: 0% A в течение 5 мин; 0%20% A в течение 13 мин; 20%50% A в течение 12 мин; 50%100% A в течение 15 мин; 100%0% A в течение 5 мин; 0% A в течение 5 мин; скорость потока 0,5 мл/мин; времена удерживания: AZT – 23,7 мин, 4a = 27,1 мин, 4b – 29,3 мин, 4c – 30,0 мин, 4d – 25,1 мин, 4e – 24,8 мин. Параметры градиента концентраций для разделения изомеров 8a совпадают с параметрами для 2 и 3, скорость потока 0,5 мл/мин, времена удерживания: син-8а – 27,8 мин, анти-8а – 28,4 мин.
Антивирусная активность и цитотоксичность всех полученных соединений определена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Определение цитотоксичности и анти-ВИЧ активности анионных фосфонатов 1 проводилось в лимфоидных клетках линии МТ-4. Для определения анти-ВИЧ активности клетки МТ-4, инфицированные ВИЧ-1, штамм ГКВ-4046, в концентрации 2 106 в мл и жизнеспособностью свыше 90%, выращивали в присутствии изучаемых соединений в различных дозах (0,001-100 мг/л) в 96-луночном планшете в течение 3 суток. Множественность заражения составляла 0,2-0,5 ед. на клетку, клетки культивировали в среде RPMI-1640, активность соединений определяли иммуноферментным методом путем измерения количества антигена p24 [255]. Строили график доза-активность, по которому рассчитывали количественные характеристики ингибирования репликации ВИЧ-1. Для определения цитотоксичности соединений 1 клетки МТ-4 выращивали в присутствии изучаемых соединений в различных дозах (0,001-100 мг/л) в трех параллелях в течение 3 суток. Концентрации и выживаемость клеток измеряли колориметрическим методом, используя МТТ-тест [256].
Определение цитотоксичности и анти-ВИЧ активности бис-(3 -азидо-3 дезокситимидин-5 -ил)фосфонатов 2 и смешанного AZT-3TC фосфоната 3 проводилось в культуре клеток CEM-SS, инфицированных лабораторным штаммом ВИЧ-1BRU. Для определения анти-ВИЧ активности клетки 2 106 шт в мл и жизнеспособностью свыше 90%, выращивали в присутствии изучаемых соединений в различных дозах (0,01-100 мг/л) в 96 луночном планшете в течение 4 суток. Активность соединения определялась иммуноферментным методом путем измерения количества антигена p24. Концентрации и выживаемость клеток измеряли колориметрическим методом.