Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика одноцепочечных антител 13
1.1.1. Структура одноцепочечных антител 13
1.1.2. Практическое применение одноцепочечных антител 16
1.1.3. Разработка VHH антител для терапии опухолей 18
1.2. Рецептор CD47 и его место в развитии раковых заболеваний 22
1.2.1. Структура CD47 24
1.2.2. Взаимодействие CD47 с лигандами
1.2.2.1. Взаимодействие CD47 с SIRPa 26
1.2.2.2. Взаимодействие CD47 с TSP-1 30
1.2.2.3. Взаимодействие CD47 с интегринами
1.2.3. Роль CD47 на эритроцитах 32
1.2.4. CD47 и апоптоз 33
1.2.5. Терапевтические возможности блокирования CD47 38
1.3. Методы получения рекомбинантных антител 42
1.3.1. Особенности метода фагового дисплея 46
1.3.2. Особенности технологии рибосомного дисплея 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы 52
2.1. Основные реактивы и ферментные препараты 52
2.2. Используемые клеточные линии и антитела з
2.3. Используемые буферные растворы и среды 55
2.4. Буферы для выделения плазмид 56
2.5. Иммунизация животного 57
2.6. Выделение PBMC из крови методом экстракции в градиенте фиколла 58
2.7. Методы работы с РНК 2.7.1. Выделение РНК из PBMC методом тризольной экстракции 58
2.7.2. Синтез кДНК 59
2.8. Методы работы с ДНК 60
2.8.1. ПЦР с праймерами, специфичными к VH-VL и VHH участкам 60
2.8.2. Гнездовая ПЦР для наработки препаративного количества фрагмента 61
2.8.3. Электорофоретическое разделение фрагментов ДНК 62
2.8.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 63
2.8.5. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 63
2.8.6. Лигирование последовательностей антител в фагмидный вектор63
2.8.7. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 64
2.8.8. Секвенирование плазмид 66
2.9. Методы работы с бактериями E.coli 66
2.9.1. Получение компетентных клеток 66
2.9.2. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК 2.10. Рестрикционный анализ отобранных VHH 68
2.11. Методы работы с фагами
2.11.1. Подготовка клеток и бактериофага 68
2.11.2. Приготовление фаговой библиотеки 69
2.11.3. Паннинг 71
2.11.4. Наращивание фага для следующего раунда паннинга 73
2.12. Методы работы с белками 74
2.12.1. Экспрессия рекомбининтных VHH в аналитическом и препаративном вариантах 74
2.12.2. Лизис клеток и очистка белка 74
2.12.3. Электрофоретический анализ белков 75
2.12.4. Вестерн-блот анализ белков 75
2.12.5. Измерение концентрации белков
2.13. Иммуноферментный анализ 76
2.14. Методы работы с эукариотическими клетками
2.14.1. Культуры клеток, использованные в работе 76
2.14.2. Замораживание клеток 77
2.14.3. Размораживание клеток 77
2.14.4. Ведение культуры прикрепленных клеток 78
2.14.5. Ведение суспензионных клеточных культур 78
2.14.6. Ведение гибридомы для наработки моноклонального антитела B6H12.2 79
2.14.7. Оценка жизнеспособности клеток
2.15. Тестирование на апоптоз 79
2.16. Тестирование на фагоцитоз 80
2.16.1. Выделение моноцитарной фракции из PBMC 80
2.17. Тест на мышиной модели ксенографта опухоли 81
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 82
3.1. Получение фаг-дисплейной библиотеки вариабельных фрагментов тяжелой цепи иммуноглобулина альпаки 82
3.2. Дизайн праймеров 82
3.3. Модификация фагмиды pHEN2 patent для клонирования последовательностей VHH 87 3.4. Отбор из полученной библиотеки фрагментов высокоаффинных вариантов VHH к рецептору CD47 и получение рекомбинантных форм этих антител в чистом виде 90
3.5. Препаративное получение VHH антител к CD47 96
3.6. Оценка блокирующей способности антител в конкурентном замещении лиганда SIRPa 98
3.7. Получение биотинилированных VHH антител 99
3.8. Экспрессия и очистка биотинилированных VHH антител 102
3.9. Измерение констант диссоциации VHH методом поверхностного плазмонного резонанса 107
3.10. Тестирование функциональной активности VHH к рецептору CD47 108
3.10.1. Индукция апоптоза 108
3.10.2.Фагоцитоз опухолевых клеток 114
3.11. Исследование влияния антител на мышиной модели ксенографта линии U937 117
Заключение 122
Выводы 123
Благодарности 124
Список литературы
- Разработка VHH антител для терапии опухолей
- Используемые буферные растворы и среды
- Наращивание фага для следующего раунда паннинга
- Оценка блокирующей способности антител в конкурентном замещении лиганда SIRPa
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В середине 90-х годов у млекопитающих семейства Camelidae (верблюды, ламы, альпаки), наряду с традиционными антителами типа IgG, были обнаружены антитела, антигенсвязывающий карман которых представлен вариабельным участком тяжелой цепи и отсутствием как таковой легкой. Такие антитела были обозначены как VHH. Главное их отличие от классических антител состоит в том, что они обладают одним антиген-распознающим участком, гомологичным CDR в IgG Vh домена и представленным структурой из - слоев и трех петель. Длина петли CDR3 у VHH может превышать 20 аминокислотных остатков, что существенно больше типичной длины вариабельных участков обычных антител (мышиных – 9 и человеческих – 12). В целом длина петель CDR3, как и способ их связывания, может сильно варьировать, благодаря чему молекула VHH способна связывать скрытые и не вызывающие иммуногенности для обычных антител эпитопы.
VHH антитела имеют ряд преимуществ по сравнению с одноцепочечными антителами, полученными из обычных молекул IgG. Они заключаются в простоте генетических манипуляций, лучшей экспрессии в различных системах, хорошей растворимости и более высокой стабильности в широком диапазоне условий. К слову, вариабельные домены VHH антител достаточно миниатюрны, для того чтобы проникать в большинство тканей, и настолько стабильны, что в некоторых случаях могут даже эффективно усваиваться из кишечника. Фрагменты VHH антител могут быть легко экспрессированы в бактериальных клетках-продуцентах, что позволяет существенно снизить стоимость производства терапевтического препарата на их основе.
Уникальные свойства VHH антител определяют удобство их использования в конструировании и применении иммунных фаговых библиотек. Их особенности открывают большие возможности для высокоточной инженерии а нтител. Вариабельные домены VHH антител могут быть использованы в качестве каркаса при дизайне синтетических библиотек, поскольку у VHH антител только три CDR-фрагмента необходимы для высокоаффинного связывания.
С открытия одноцепочечных антител и до сегодняшнего момента активно селектируются и производятся рекомбинантные формы фрагментов VHH к различным мишеням. VHH в качестве биотерапевтических препаратов находят применение для терапии широкого ряда заболеваний, включая гематологические, воспалительные, онкологические и легочные. Такие терапевтические VHH антитела представляют собой технологию следующего поколения, семь препаратов из их числа в настоящий момент проходят клинические испытания, а для лечения ревматоидного артрита уже существует доказавший эффективность своего действия препарат на основе VHH (ozoralizumab), состоящий из двух молекул VHH антител к TNFa (ozoralizumab) и альбуминсвязывающего домена, доказавший эффективность своего действия. VHH очень схож со структурой участка VH иммуноглобулина человека, результаты первой фазы испытаний препаратов указывают на низкий уровень иммуногенности VHH.
Однодоменная природа VHH антитела существенно упрощает их селекцию при помощи фагового дисплея, благодаря чему можно быстро получить в ысокоспецифичное антитело к любому интересующему белку. В контексте противоопухолевой терапии VHH могут использоваться для нацеливания терапевтических препаратов на раковые клетки и/или сосудистую систему опухоли за счет связывания со специфическими мишенями. Поскольку одноцепочечные антитела не способны непосредственно связываться с мембраной клетки,
обычно мишенями являются внеклеточные молекулы – опухолевые неоантигены либо рецепторные лиганды или трансмембранные белки, гиперэкспрессируемые по сравнению с нормальными клетками.
Высокоспецифичные агенты на основе VHH антител имеют потенциал в ближайшие годы стать одним из основных классов терапевтических противоопухолевых средств, в том числе предотвращающих рецидив опухоли за счет их специфичной нацеленности на раковые стволовые клетки (РСК). Медицинское применение таких препаратов в сочетании с традиционными терапевтическими подходами позволит существенно улучшить средний прогноз пяти- и десятилетней выживаемости пациентов, перенесших в частности рак молочной железы, и другие распространенные виды рака.
В рамках такой нацеленной иммунотерапии, изучение вовлеченных в патогенез новых рецепторов на поверхности клетки также становится одной из важных задач современных исследований, поскольку именно поверхностные рецепторы выступают в роли ключевых молекул, участвующих в передаче сигналов, коммуникации между клетками и межклеточным пространством, поддержке гомеостаза организма. В то же время количество «истинных» опухолевых антигенов - неоантигенов, не встречающихся или чрезвычайно редких для нормальных клеток, относительно невелико. Для каждого из таких антигенов уже создано или находится в процессе создания одно или несколько терапевтических антител.
Одним из активно исследуемых опухоль-ассоциированных рецепторов является белок CD47, экспрессирующийся на поверхности многих клеток организма. В нормальном состоянии CD47 на клетке выполняет роль ее защиты от фагоцитоза клетками иммунной системы, в ходе старения клетки количество CD47 на ее поверхности снижается, тем самым в организме происходит удаление устаревших клеток. Эту систему защиты используют в своих целях и раковые клетки, в том числе стволовые, гиперэкспрессируя CD47 на своей поверхности. Таким о бразом злокачественные опухоли «уходят» от воздействия иммунной системы. Развернув такой механизм действия CD47 в обратную сторону, можно добиться элиминации опухоли и улучшения прогнозов выживаемости в ходе терапии. Поиск высокоспецифичного блокирующего агента, направленного CD47 все еще остается актуальным, поскольку существующие мышиные моноклональные антитела к CD47 не в полной мере соответствуют клиническим требованиям.
Цели и задачи исследования
Целью работы являлось получение одноцепочечных VHH антител, обладающих высокой аффинностью к рецептору CD47, и тестирование их в экспериментах in vitro и in vivo на способность блокировать этот рецептор с целью их дальнейшего использования в качестве терапевтических агентов. Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Получить фаг-дисплейную библиотеку вариабельных фрагментов тяжелой цепи
иммуноглобулина альпаки из материала иммунизированного животного.
-
Отобрать из полученной библиотеки фрагментов высокоаффинные варианты к рецептору CD47 и получить рекомбинантные формы этих антител в растворимом виде.
-
Провести оценку констант связывания антител.
-
Провести оценку способности отобранных фрагментов антител блокировать взаимодействие между CD47 и SIRPa в опытах in vitro.
-
Провести тесты на функциональную активность антител в отношении раковых клеток, гиперэкспрессирующих маркер CD47.
-
Оценить действие антител на мышиных моделях ксенографтов опухолей.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
В настоящей работе впервые была создана библиотека вариабельных фрагментов VHH из материала лимфоузлов и клеток крови иммунизированного против CD47 животного альпаки. Был получен ряд VHH фрагментов антител к рецептору CD47, определена их аминокислотная последовательность и константы связывания. Впервые показано апоптотическое действие полученных вариантов VHH антител в отношении моноцитарной лимфомной линии клеток U937. В экспериментах на фагоцитоз впервые показано увеличение показателя фагоцитированных клеток линии рака молочной железы MCF7 при блокировании CD47 VHH антителом в сравнении с контрольными культурами, а также моноклональным антителом B6H12.2. Впервые показано опухолесупрессивное действие VHH антител на мышиной модели ксенографта U937. Впервые создана четырехвалентная молекула стрептабоди для удлинения периода действия блокирующего VHH антитела в организме при интраперитонеальном введении.
Апробация результатов работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на юбилейном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ и Европейской молекулярно-биологической организации FEBS-EMBO (Париж, 2014 г.) и 2-ой конференции молодых ученых «Наука будущего» (Казань, 2016 г.) и совместном коллоквиуме Группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки и Лаборатории пролиферации клеток в Институте Молекулярной Биологии имени В. А. Энгельгардта (май 2017). По р езультатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 4 тезиса международных конференций.
Структура и объем диссертации
Разработка VHH антител для терапии опухолей
Существующие терапевтические средства на основе VHH подразделяются на несколько видов: в качестве антагонистов рецепторов либо компонентов, нацеленных на эффекторный домен или в качестве узнающей части, нагруженной на препарат наночастиц.
В сравнении с размером молекулы моноклонального антитела (мАТ), который составляет порядка 150 кДа с разрешением 14.2 8.5 3.8 нм вследствие чего антитело обладает низкой проницаемостью в опухоль и медленным распространением, VHH - вариабельный участок HcAb, ответственный за связывание с антигеном - в настоящее время является самым маленьким природным антиген связывающим фрагментом, полностью сохраняющим функциональную активность.
Как уже было отмечено выше, VHH изучены достаточно хорошо в отношении их молекулярного строения, и неоспоримыми преимуществами таких молекул при разработке агентов для терапии опухоли являются размер, стабильность, растворимость, легкая продукция в бактериях, дрожжах или эукариотах, что создает условия для производства с минимальными затратами. Помимо этого, VHH очень схож со структурой участка VH иммуноглобулина человека, результаты первой фазы испытаний препаратов указывают на низкий уровень иммуногенности VHH.
При поиске антитела VHH к новому рецептору необходимо учитывать несколько фактов. В первую очередь это касается аффинности. Наиболее целесообразно получать высокоаффинные молекулы, чтобы избежать низкого сродства из-за небольшой поверхности взаимодействия паратопа и эпитопа антигена. Кроме того следует учитывать эффект сопряжения случайных остатков лизина, так как это может повлиять на связывающие свойства антитела, однако эта проблема решается с помощью сайт направленного слияния с С-концевым цистеином.
Однодоменная природа VHH антитела существенно упрощает их селекцию при помощи фагового дисплея, благодаря чему можно быстро получить высокоспецифичное антитело к любому интересующему белку. В контексте противоопухолевой терапии VHH могут использоваться для нацеливания раковых клеток и/или сосудистой системы опухоли за счет связывания со специфическими мишенями. Поскольку одноцепочечные антитела не способны непосредственно связываться с мембраной клетки, обычно мишенями являются внеклеточные молекулы - опухолевые неоантигены либо рецепторные лиганды или трансмембранные белки, гиперэкспрессируемые или экспрессируемые в единственном числе по сравнению с нормальными клетками. Поэтому изначально при отборе из библиотеки фрагментов, кодирующих VHH, используют либо рекомбинантную форму белка, иммобилизованного на твердой поверхности, либо очищенные компартменты клетки, экспрессирующие нужный антиген, либо непосредственно клетки, на поверхности которых представлена мишень.
С помощью отбора по технологии фагового дисплея были получены VHH к рецепторам тирозиновых киназ EGFR, HER2 и c-Met. Такие молекулы рассматриваются как антагонисты, предотвращающие связывание лиганда и соответственно активацию сигнальных путей, происходящей вследствие конформационных изменений при взаимодействии рецептора и агониста. Что касается in vivo исследований, то ингибирование роста опухоли было продемонстрировано на примере тривалентного бипаратопного конструкта anti EGFR 7D12-9G8-Alb, где третьей составляющей является VHH, связывающийся с альбумином. Такая молекула способна продержаться в кровотоке в течение 2-3 дней вместо 1-2 часов. Полного уничтожения опухоли не наблюдалось несмотря на то, что использовали различные комбинации VHH - либо биваленты, либо бипаратопы, что может быть в первую очередь связано с тем, что у препарата с VHH антителами отсутствует Fc домен, ответственный за АЗКЦ и за КЗЦ [19].
Есть примеры антител, которые служат аллостерическими ингибиторами, способными модулировать ферментативную активность белка мишени (CAIX) [20]. В случае когда один лиганд ответственен за активацию соответствующего рецептора, могут использоваться VHH, непосредственно связывающиеся с лигандом. Примером этого является VHH, направленный на ингибирование тирозинкиназного рецептора c-Met за счет связывания с его лигандом HGF - фактором роста гепатоцитов. Такой альтернативный путь воздействия VHH затрагивает внеклеточные мишени - хемокины, функционирующие внутри опухоли [21]. Хемокины играют большую роль в иммунном ответе, воспалительных процессах и вовлечены в развитие рака. Таким образом, терапевтический эффект VHH зависит от мишени и модели опухоли.
Используемые буферные растворы и среды
Особенностью фагового дисплея является то, что он более ограничен в размере используемой библиотеки аффинных фрагментов, при этом, являясь технически менее сложным, и позволяя в широких пределах модулировать аффинность отбираемого агента. Суть применения фагового дисплея для отбора аффинных фрагментов состоит в том, что фрагменты ДНК или РНК, кодирующие аффинные участки, вводятся в состав фагового генома, с экспонированием вариабельной части на поверхности фага, и содержанием соответствующего генома в самом фаге. Отбор аффинных реагентов происходит путем их взаимодействия с субстратом, покрытым целевыми молекулами – белковыми мишенями, с последующим воздействием (отмывками) различной степени интенсивности, призванными удалить с поверхности субстрата слабо связанные полипептиды. После удаления ненужной фракции, остается пул вариантов аффинных фрагментов и их геномов, обогащенный высокоспецифичными молекулами. Он подвергается повторной экспансии путем инфекции бактериальных клеток-хозяев фага, после экспансии процесс паннинга и селекции повторяется до достижения требуемых уровней обогащения библиотеки аффинными фрагментами. После достижения требуемых значений, оставшиеся последовательности секвенируются, определяются участки вариабельных фрагментов, ответственные за формирование связи с антигеном, на основании которых затем создается собственно терапевтический агент. Использование в работе метода фагового дисплея имеет свои особенности: 1. Последовательности антител заключены в фагмиду в виде единого комплекса и совокупно они образуют библиотеку, из которой и происходит селекция наиболее специфично связывающихся молекул VHH. 2. Отбор наиболее аффинных фрагментов происходит в результате последовательных раундов селекции, вследствие чего происходит постепенное обогащение тестируемой библиотеки белковых молекул фрагментами, имеющими более предпочтительные качества (например, сродство к молекуле-мишени), нежели прочие молекулы пула. 3. Обогащение более ценными с точки зрения результатов селекции белковыми молекулами приводит к одновременному обогащению связанными с ними молекулами, кодирующими их нуклеотидную последовательность, что, в свою очередь, приводит к возникновению эффекта положительной обратной связи – такое обогащение приводит к появлению в начале следующего раунда селекции пула, имеющего исходно более высокое содержание предпочтительных молекул. В итоге, после нескольких раундов селекции, образуется пул из одной или нескольких молекул, имеющих наилучшие с точки зрения селекции свойства (например, наибольшую аффинность к молекуле мишени).
Таким образом, находящиеся в смеси фаги экспонируют на своей поверхности VHH, принадлежащие к общему набору возможных вариантов, при этом их нуклеотидная последовательность содержится в самом фаге. Селектируя такую фаговую смесь на сорбенте, покрытом молекулами, против которых проводится отбор, либо альтернативно в смеси с клетками, либо частицами, несущими молекулы-мишени, возможно добиться обогащения исходной гетерологичной фаговой популяции клонами, несущими наиболее аффинные молекулы. Далее отобранный пул фагов с аффинными антителами размножается до определенного количества, достаточного для проведения следующего раунда селекции. Подобный метод может быть описан как направленная эволюция, при которой прилагаемое селективное давление приводит к преобладанию наиболее приспособленных жизненных форм. В зависимости от сложности исходной библиотеки обогащение происходит в 3 – 5 стадий отбора.
Используя технологию рибосомального дисплея, возможно проводить отбор из библиотек, обладающих гораздо более высокой сложностью. При этом, сам метод более чувствителен к возможным техническим ошибкам и условиям применения, и малопригоден для проведения модулирования аффинности полученных фрагментов. Фаговый дисплей, напротив, более ограничен в размере используемой библиотеки аффинных фрагментов, при этом, являясь менее технически сложным, и позволяя в широких пределах модулировать аффинность отбираемого агента. Таким образом, применительно к данной работе, планируется использование фагового дисплея как основного инструмента поиска и отбора аффинных реагентов. Как уже было сказано выше, суть применения фагового и рибосомального дисплеев для отбора аффинных фрагментов состоит в том, что фрагменты ДНК или РНК, кодирующие аффинные участки, вводятся либо в состав фагового генома, с экспонированием вариабельной части на поверхности фага, и содержанием соответствующего генома в самом фаге, либо, в случае РНК и рибосомального дисплея, подвергаются частичной трансляции в аффинный полипептид, с сохранением соединения между мРНК и пептидной цепью за счет неотделения транслирующей рибосомы от матрицы. В обоих случаях, отбор аффинных реагентов происходит путем их взаимодействия с субстратом, покрытым целевыми молекулами – белковыми мишенями, с последующим воздействием (отмывками) различной степени интенсивности, призванными удалить с поверхности субстрата слабо связанные полипептиды. После удаления ненужной фракции остается пул вариантов аффинных фрагментов и их геномов, обогащенный высокоспецифичными молекулами. Он подвергается повторной экспансии, либо путем ревертирования и ПЦР, либо путем инфекции бактериальных клеток-хозяев фага, после экспансии процесс паннинга и селекции повторяется до достижения требуемых уровней обогащения библиотеки аффинными фрагментами. После достижения требуемых значений, оставшиеся последовательности секвенируются, определяются участки вариабельных фрагментов, ответственные за формирование связи с антигеном, на основании которых затем создается собственно терапевтический агент.
Основным препятствием на пути применения этих методов в получении молекул scFv лежит наличие в составе традиционных антител двух антигенсвязывающих доменов в составе раздельных молекул. Для конструирования аффинной библиотеки, в таком случае необходимо провести конъюгирование двух участков кДНК тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, однако это невозможно сделать прицельно -результирующая библиотека в любом случае состоит из случайно скомбинированных фрагментов Vh и VI цепей антител, а не тех пар фрагментов, которые были в эндогенных антителах исходно. В связи с этим в составе такой библиотеки присутствует большое количество VhVl-пар, обладающих исходно низким потенциалом и непригодных для создания терапевтических агентов. При этом максимальная сложность получаемой библиотеки объективно лимитирована используемыми молекулярно-биологическими методами клонирования. В результате эффективная выборка, из которой происходит отбор требуемого соединения, отличается в меньшую сторону от общей сложности библиотеки. Все вышеперечисленные препятствия можно избежать в случае использования библиотеки вариабельных фрагментов VHH.
Наращивание фага для следующего раунда паннинга
Суть применения фагового дисплея для отбора аффинных фрагментов состоит в том, что фрагменты ДНК или РНК, кодирующие аффинные участки, вводятся в состав фагового генома с экспонированием вариабельной части на поверхности фага и содержанием соответствующего генома в самом фаге. Отбор аффинных реагентов происходит путем их взаимодействия с субстратом, покрытым целевыми молекулами – белковыми мишенями, с последующим воздействием (отмывками) различной степени интенсивности, призванными удалить с поверхности субстрата слабо связанные полипептиды. После удаления ненужной фракции остается пул вариантов аффинных фрагментов и их геномов, обогащенный высокоспецифичными молекулами. Он подвергается повторной экспансии путем инфекции бактериальных клеток-хозяев фага, после экспансии процесс паннинга и селекции повторяется до достижения требуемых уровней обогащения библиотеки аффинными фрагментами. После достижения требуемых значений оставшиеся последовательности секвенируются, определяются участки вариабельных фрагментов, ответственные за формирование связи с антигеном, на основании которых затем создается собственно терапевтический агент.
Использование в настоящей работе метода фагового дисплея имеет свои особенности:
1. Последовательности антител заключены в фагмиду в виде единого комплекса и совокупно они образуют библиотеку, из которой и происходит селекция наиболее специфично связывающихся молекул VHH.
2. Отбор наиболее аффинных фрагментов происходит в результате последовательных раундов селекции, вследствие чего происходит постепенное обогащение тестируемой библиотеки белковых молекул фрагментами, имеющими более предпочтительные качества (например, сродство к молекуле-мишени), нежели прочие молекулы пула.
3. Обогащение более ценными с точки зрения результатов селекции белковыми молекулами приводит к одновременному обогащению связанными с ними молекулами, кодирующими их нуклеотидную последовательность, что, в свою очередь, приводит к возникновению эффекта положительной обратной связи – такое обогащение приводит к появлению в начале следующего раунда селекции пула, имеющего исходно более высокое содержание предпочтительных молекул. В итоге после нескольких раундов селекции образуется пул из одной или нескольких молекул, имеющих наилучшие с точки зрения селекции свойства (например, наибольшую аффинность к молекуле мишени).
Таким образом, находящиеся в смеси фаги экспонируют на своей поверхности VHH, принадлежащие к общему набору возможных вариантов, при этом их нуклеотидная последовательность содержится в самом фаге. Селектируя такую фаговую смесь на сорбенте, покрытом молекулами, против которых проводится отбор, либо альтернативно в смеси с клетками, либо частицами, несущими молекулы-мишени, возможно добиться обогащения исходной гетерологичной фаговой популяции клонами, несущими наиболее аффинные молекулы. Далее отобранный пул фагов с аффинными антителами размножается до определенного количества, достаточного для проведения следующего раунда селекции. Подобный метод может быть описан как направленная эволюция, при которой прилагаемое селективное давление приводит к преобладанию наиболее приспособленных жизненных форм. В зависимости от сложности исходной библиотеки обогащение происходит в 3 – 5 стадий отбора. В настоящем случае для заметного обогащения было достаточно 3 стадий селекции.
Для селекции методом фагового дисплея полученная фагмидная библиотека последовательностей в виде трансформированных клеток штамма TG-1 была переведена в формат фаговых частиц бактериофага М13 путем инфекции этих клеток фагом-помощником. Выделяемые фаговые частицы экспрессируют на себе поверхностный белок pIII, слитый с фрагментами VHH. Отбор вариантов антител был произведен в ходе трех раундов паннинга на полученном ранее в лаборатории рекомбинантном варианте внеклеточного домена рецептора CD47, иммобилизованного на полистириловом 96-ти луночном планшете. Данные по сложности библиотеки представлены в Таблице 2.
Раунд Выход после паннинга Титр стока Сложность исходной библиотеки 2,2 108 колоний 1.92 1013 ф/мл 1 раунд паннинга 4.7 103 колоний 1.56 1013 ф/мл. 2 раунд паннинга 8.4 105 колоний 6.2 1013 ф/мл 3 раунд паннинга 9.6 107 колоний 5.4 1013 ф/мл Анализируя полученные данные можно сделать вывод, что в ходе первого раунда паннинга большая часть фагов с неспецифичными антителами была смыта, на втором и третьем раундах происходило обогащение фагов, несущих на себе специфичные варианты VHH-фрагментов.
После третьего раунда паннинга была проведена работа по отбору отдельных фагов, несущих высокоспецифичные VHH на своей поверхности. Для этого первоначально были выращены отдельные клоны фагов и проанализированы методом ИФА на связывание с иммобилизованным CD47. В качестве отрицательного контроля использовали лунку с блокирующим белком БСА. Связавшиеся фаги определяли овечьими антителами к фагу М13 и вторичными антивидовыми антителами с пероксидазой хрена. В результате наиболее сильно связывающиеся фаги были выявляли по оценке оптической плотности поглощения при длине волны 450 нм. Из девяноста клонов на планшете были выбраны девять наиболее сильных и переведены в формат фагмид для амплификации нуклеотидной последовательности антител и оценки их размера и разнообразия. Соответствующие правильному размеру ПЦР-фрагменты VHH подвергались обработке рестриктазой HaeIII, после чего похожие по профилю рестрикции клоны были сгруппированы. Из каждой группы было отобрано по одному варианту клона для последующего анализа.
Оценка блокирующей способности антител в конкурентном замещении лиганда SIRPa
Мышиная модель ксенографтов опухоли остается на сегодняшний день одной из главных моделей для исследований in vivo. Для изучения действия блокирующих агентов к CD47 используются различные клеточные линии лимфом, карцином, глиом. В нашем случае наиболее удобной моделью была опухоль, вызываемая моноцитарной лимфомной линией U937. Данная линия проявляет высокий уровень приживаемости, легка в ведении и как уже было сказано выше, уходит в состояние апоптоза при взаимодействии с иммобилизованными анти-CD47 антителами.
Для исследования были взяты мыши линии BALB/c nude, являющиеся носителями аутосомно-рецессивной мутации, которая в гомозиготном состоянии приводит к отсутствию внутриутробной закладки тимуса и волосяных луковиц, в результате чего мыши становятся дефицитными по Т-лимфоцитам и лишены шерстного покрова. Для эксперимента было взято три группы мышей-самцов по шесть-девять особей в каждой. Возраст мышей составлял 6 недель, вес варьировал в пределах 18–22 г. Эффективность испытания в животном в первую очередь зависит от системы распределения препарата в организме и степени его доставки к опухолевой ткани. Доставка терапевтических агентов может осуществляться несколькими путями: орально, внутривенно, интраперитонеально или непосредственно в саму опухоль. Технология использования VHH антител может испытываться всеми вышеуказанными способами, однако, более предпочтительными являются первые три варианта. Каждый из этих путей имеет свои требования к препарату. Например, в случае орального или интраперитонеального введения антитела должны быть устойчивыми к экстремальным условиям (протеазы, кислый pH). Фрагменты антител можно защитить от воздействия протеаз путем адаптации последовательности или добавлением дополнительных дисульфидных связей с целью повысить устойчивость к ферментам пепсину и химотрипсину. При введении препарата внутривенно важно учитывать сохранение его стабильности в сыворотке крови. Стабильность препарата фрагментов антител можно повысить за счет комбинации с эффекторным доменом или наночастицами, однако, эти системы могут сильно различаться между собой. Нестабильность препаратов фрагментов антител может быть причиной преждевременного действия вещества, за счет чего опухоли он может не достигнуть. Такое явление приводит к серьезным побочным эффектам и, в целом, снижает терапевтическую ценность. Препараты фрагментов антител обычно достаточно стабильны при введении внутривенно, поэтому чаще всего на сегодняшний день в исследовании in vivo используют именно этот метод. Тем не менее, для исследования терапевтических свойств полученных фрагментов был выбран метод интраперитонеального введения. Это связано с тем, что препараты антител не подвергались модификациям, описанным выше и за счет которых они удлинили бы время жизни в кровотоке. Соответственно, данный способ введения позволит исключить потерю препарата во время циркуляции по кровеносной системе организма, а также защитит от прохождения через почечный барьер. Последний фактор имеет, как известно, огромное значение, так как, приемлемый размер молекулы, способной задержаться составляет порядка 60 кДа, что существенно больше фрагментов VHH антител. С другой стороны выбранный метод увеличит риск развития побочных эффектов, но в данном случае специфичность препарата именно к опухолевым клеткам довольно высокая, поэтому этим фактором в данном эксперименте можно было пренебречь.
В результате эксперимента было выявлено, что характер роста опухоли был агрессивным и неравномерным, как видно на графиках ниже (Рисунок 35). Самый быстрый рост ксенографта был зафиксирован у контрольной группы мышей, при терапии антителами B6H12.2 развитие ксенографта несколько замедлялось, а при введении VHH19 замедление роста опухоли было еще более заметным. Что касается последних двух постановок, то очевидную разницу в эффективности действия препаратов заметить сложно, однако стоит отметить, что VHH19 оказался более экономичным в использовании. Элиминацию опухолей в ходе эксперимента достичь не удалось ни в одной группе мышей, что говорит о необходимости тщательного подбора дозировок, частоты введения и, возможно, комбинирования с химиотерапевтическим агентом. Результаты тестирования на животной модели подтверждают высокую биологическую активность и специфичность действия полученного VHH фрагмента антитела в отношении опухолевого рецептора CD47, а также свидетельствуют о его высоком терапевтическом потенциале.