Введение к работе
Актуальность проблемы. Пандемия СПИДа охватывает в настоящее время все континенты, поражая людей независимо от пола и возраста и даже детей в неонатальном периоде, требуя на профилактику и лечение огромных средств.
Вместе с тем, разработка специфических средств профилактики и лечения этого заболевания связана с большими трудностями, обусловленными биологическими особенностями возбудителя. Необычайно высокая изменчивость ВИЧ, выявленная не только в популяции людей, но и на уровне индивидуума, позволяет им длительно персистировать, маскируясь от элиминирующих механизмов макроорганизма.
Одним из основных средств ограничения распространения СПИДа в данный период является эффективная диагностика ВИЧ-инфекции. Эффективность диагностики ВИЧ-инфекции в значительной степени зависит от стратегии тестирования, адекватности методов и качества, применяющихся в лабораторной практике препаратов.
С целью выявления ВИЧ-инфекции применяют различные методы обнаружения вируса, его генетического материала, структурных белков , антигенов и антител к ВИЧ. Серологическое исследование, направленное для выявления антител к ВИЧ в крови, либо других биологических жидкостях является основным методом диагностики ВИЧ-инфекции, применяемым в практическом здравоохранении. Наиболее широко используются иммуноферментные тест-системы различных модификаций с последующим подтверждением результатов методом иммунного блота, иммунофлюоресцентного анализа и радиоиммунопреципитации.
Получение препаратов, обладающих высокой диагностической ценностью, обеспечивается разработкой и внедрением в производство современных технологий, применением высококачественного сырья, материалов, оборудования, а также объективным контролем за их качеством на этапах выпуска и применения. Основой совершенствования диагностикумов ВИЧ является биологическая стандартизация, включающая разработку требований ко всем компонентам, используемым для конструирования
препаратов, стандартов и методов их оценки.
К началу выполнения данной работы в нашей стране не было охарактеризованных высокопродуктивных штаммов ВИЧ, пригодных для производственных целей. Вирусный лизат закупался за рубежом. Отсутствовали нормативы, определяющие технологию получения и качество вирусных антигенов, не были разработаны стандарты и критерии оценки основных компонентов, используемых при получении диагностических препаратов для выявления маркеров ВИЧ. Все это не позволяло обеспечить выпуск отечественных эффективных диагаостикумов ВИЧ и осуществлять в полной мере контроль за их производством и применением.
В связи с этим при проведении данных исследований основными объектами стандартизации диагаостикумов ВИЧ являлись производственные штаммы ВИЧ и клеточные субстраты, антигены, полученные различными технологиями, ингредиенты, необходимые для проведения анализа, а также методы учета, интерпретации и регистрации результатов.
Цели и задачи исследования.
Целью работы являлось: научная разработка основных принципої стандартизации средств и методов диагностики ВИЧ-инфекции і совершенствования систем и методов их контроля.
Для выполнения цели исследования были определены основные задачи
-
Изучение, отбор и создание банков охарактеризованных высокопродуктивны; производственных штаммов ВИЧ и клеточных линий, свободных О' контаминирующих агентов.
-
Изучение и стандартизация антигенов ВИЧ, полученных на основе различны: технологий и используемых в производстве диагностических препаратов.
-
Разработка научно-обоснованных требований к основным компонентам используемым для конструирования диагаостикумов ВИЧ.
-
Получение и изучение национальных стандартов, используемых в качеств препаратов сравнения при оценке качества диагаостикумов ВИЧ.
Іравнительное изучение диагностической эффективности препаратов
ественного и импортного производства, применяемых для скрининга и
верждения ВИЧ-инфекции.
зработка и совершенствование системы и методов контроля диагностикумов
[ при выпуске, внедрении и применении.
зучение пригодности клинического материала, полученного различными
ідами для выявления антител к ВИЧ.
Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований Ж им.Л.А.Тарасевича и по Государственным научно-техническим раммам: "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" б.Об ІИД", проект 4 и "Национальные приоритеты в медицине и воохранении".
чпая новизна.
рвые научно обоснованы подходы к стандартизации вирусных и клеточных ммов, пригодных для производства вирусного лизата. Являются эритетными сравнительные данные по изучению и репродукции новых ммов ВИЧ типа I, выделенных на территории СНГ в системах острой и шческой инфекций в пермиссивных клеточных линиях.
Экспериментально-обоснованы и впервые сформулированы критерии эра штаммов ВИЧ, рекомендуемых для получения вирусных лизатов. еделены параметры технологии и требования внутреннего контроля при изводстве вирусных лизатов ВИЧ.
Впервые в России разработаны требования, определены критерии и эды оценки антигенов ВИЧ, получаемых методами рекомбинантной юлогии и химического синтеза.
Впервые разработаны научно-обоснованные требования к банкам фоидных клеток, используемых для производства диагностикумов ВИЧ.
Научные основы получения и формирования панелей сывороток, іаботанньге впервые в России позволили повысить диагностическую ценность
иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления антител к ВИЧ. Доказано, что наиболее надежным методом определения качества диагностических препаратов по основным параметрам чувствительности и специфичности является применение стандартных панелей сывороток с заданной концентрацией антител к ВИЧ, что достигалось при учете теоретического распределения уровня антител поданным оптической плотности и их титра.
Впервые разработаны национальные стандарты (стандартные панели сывороток, содержащие и не содержащие антитела к ВИЧ, и пероксидазные конъюгаты), позволяющие обеспечивать надзор за качеством серийно выпускаемых диагностикумов ВИЧ.
Новый, оригинальный метод оценки чувствительности и специфичности ИФА тест-систем, разработанный на основе экспериментальных данных и контроля коммерческих серий, позволяет более эффективно дифференцировать препараты для диагностики ВИЧ-инфекции по качеству.
Разработанная система апробации новых препаратов для выявления маркеров ВИЧ, дает возможность определять их диагностическую ценность и место в процессе серологической диагностики ВИЧ-инфекции.
Приоритетность исследований защищена 2 патентами Российской Федерации.
Практическая ценность работы. На основе изучения новых штаммов ВИЧ-] отобраны наиболее продуктивные штаммы для получения вирусного антигена Эти штаммы одобрены Ученым Советом ГИСК им.Л.А.Тарасевича і зарегистрированы в качестве производственных для приготовлена диагностикумов ВИЧ.
Аттестация штаммов ВИЧ, создание посевного банка, выбор условиі культивирования в клеточных линиях, определение оптимальных методої накопления, концентрирования и очистки вирусных антигенов послужшп основой для разработки технологии промышленного получения вирусны:
нтигенов. Технология получения антигена ВИЧ типа I на основе отобранного ітамма изложена в экспериментально-производственном регламенте (ЭПР N 74-94) "Антиген ВИЧ, очищенный инактивированный для производства тест-нстем, выявляющих антитела к ВИЧ".
Требования к качеству, методы контроля и критерии оценки оммерческого антигена ВИЧ сформулированы в утвержденных Минздравом 'осени Временных фармакопейных статьях "Антиген вируса иммунодефицита еловека I типа (ВИЧ-І), инактивированный" ВФС 42-423-93 и ВФС 42-433-4. Качество антигенов, полученных по разработанной нами технологии, не ступали зарубежным аналогам по диагностической эффективности.
Применение стандартных панелей сывороток, приготовленных по іазработанной нами технологии ОСО 42-28-212-93 и ОСО 42-28-214-94, несенных в реестр национальных стандартов, позволило повысить лимиты [увствительности и специфичности ИФА тест-систем с 95% до 98%. Эти тандартьг являются в настоящее время основным инструментом контроля :ачества при выпуске ИФА тест-систем и наборов иммуноблота на всех )течественных предприятиях и в ГИСК им.Л.А.Тарасевича, а также іспользуютея в диагностических лабораториях Центров по профилактике и юрьбе со СПИД при приемке наборов, поступающих от учреждений иготовителей. ОСО 42-28-191-91 и ОСО 42-28-192-91 пероксидазных сонъюгатов позволяют оценивать качество иммуносорбентов, используемых различными фирмами для изготовления диагностикумов ВИЧ. Разработаны и утверждены следующие нормативные документы. Методические указания, утвержденные Минздравом СССР: 1."Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства медицинских биологических препаратов " РД 42-28-10-89, 1989 г.; 2. "Требования к стандартизации и аттестации штаммов клеток-продуцентов ВИЧ, предназначенных для производства диагностических препаратов" N 28 б/д, 1988 г.; Методические рекомендации, утвержденные Ученым советом ГИСК
им.Л.А.Тарасевича:
1. "Принципы отбора и аттестации сывороток, предназначенных для
формирования стандартных панелей сывороток, положительных и
отрицательных на антитела к ВИЧ", 1993 г.;
-
"Контроль сорбционной способности планшетов, применяемых в качестве твердой фазы при производстве диагностических иммуноферментных тест-систем", 1993 г.;
-
"Требования к стандартизации и аттестации синтетических пептидов, применяемых при производстве диагностических препаратов для выявления антител к ВИЧ", 1993 г.;
-
"Требования к стандартизации и аттестации синтезируемых клетками E.coli рекомбинантных антигенов, применяемых при производстве препаратов для серодиагностики ВИЧ-инфекции, 1995 г;
Основные положения, выносимые на зашиту.
-
Система и методы стандартизации вирусных и клеточных штаммов, пригодных для производства вирусного лизата.
-
Сравнительная характеристика острой и хронической инфекции четырех новых штаммов ВИЧ типа 1, выделенных на территории СНГ, их репродуктивные, культуральные и антигенные характеристики.
Система аттестации штаммов ВИЧ-1 для производства диагностикумов.
3. Технология получения вирусного антигена для приготовления
иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВИЧ.
4. Перечень требований к рекомбинантным белкам и синтетическим пептидам,
используемым для приготовления диагностических препаратов ВИЧ-инфекции.
5.Критерии и методы оценки основных компонентов, используемых при
конструировании диагностикумов ВИЧ (антигенов, полистироловых планшет,
конъюгатов), а также основных параметров, определяющих качество наборов
ИФА (чувствительности и специфичности).
6. Технология приготовления, а также принципы комплектования и методы оценки стандартных панелей сывороток, используемых для контроля
разрабатываемых и коммерческих препаратов для диагностики ВИЧ-инфекции.
-
Система апробации и внедрения новых диашостических препаратов для выявления маркеров ВИЧ.
-
Применение альтернативного метода забора крови на фильтровальную бумагу для выявления антител к ВИЧ в ИФА тест-системах различных конструкций.
Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и положения
диссертационной работы доложены и обсуждены на:
Всесоюзной научно-практической конференции по СПИД, Ленинград, 1990
г.; Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация
и СПИД " , Ленинград , 1991 г.; УІ Всероссийском съезде ВИОМЭП, Нижний
Новгород 1991 г.; 1 и 2-ой Международных конференциях"СПИД, рак и
ретровирусы человека", Санкт-Петербург, 1992 - 1993 гг.; 1-ой Международной
региональной конференции по ВИЧ инфекции "Балтика против СПИДа",
Санкт-Петербург, 1994 г.; Научной конференции по проблемам "СПИД" по
завершенным проектам ГНТНР "Национальные приоритеты в медицине и
здравоохранении", Москва, РАМН, 1995 и др.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 375 страницах и