Введение к работе
Актуальность проблемы. Совершенствование средств и методов диагностики вирусных ОРЗ приобретает в последние годы всё большую практическую и теоретическую значимость в связи с разработкой новых средств этиотропной терапии, химиопрофилактики и необходимостью осуществления эпиднадзора за гриппом. Точный анализ эпидемического процесса невозможен без расшифровки природы и структуры вирусных ОРЗ.
К наиболее важнейшим, эпидемически значимым возбудителям ОРЗ, как известно, принадлежат вирусы гриппа [Жданов,1958, А.А.Смородинцев, 1984], респираторно-сянцитиальный вирус (РСВ) [Chanock К., 1957, Дрейзин Р.С.,1968, Zhdanov V.M.,1974] и аденовирус (АВ) [Дрейзин Р.С, 1962, Дяченко НС,1988]. Успех специфической терапии этих инфекций с применением химиопрепаратов или иммуноглобулинов направленного действия, прежде всего, зависит от правильной и быстрой идентификации возбудителя вирусного заболевания. Наиболее чувствительными и специфичными иммунологическими тестами обнаружения вирусных антигенов в настоящее время являются иммуноферментный (ИФА), иммунофлуоресцентный (ИФЛ), радиоиммунный анализы (РИА), в меньшей степени иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Наибольшее практическое распространение получили простые и доступные практике методы ИФЛ и ИФА. ИФЛ выгодно отличается от других методов быстротой анализа (1-2 часа с момента поступления материалов), тогда как достоинством ИФА является возможность одновременного исследования большого числа клинических образцов. ИФА позволяет, кроме того, проводить количественное определение вирусных антигенов, что удобно для проведения мониторинга инфекционного процесса. Материалы, подлежащие анализу, могут достаточно долго сохраняться в замороженном состоянии.
Поликлональные иммуноглобулины, ранее используемые при постановке этих реакций, характеризуются гетерогенностью состава сывороточных антител, что таит в себе эпасность перекрестной неспецифической реактивности с хозяйскими антигенами. Получаемые в результате иммунизации животных препараты антител трудно поддаются стандартизации в силу отличий составляющих популяцию антител по аффинитету и эпитопной направленности.
Многие из этих проблем успешно решаются при использовании в диагностике ;шмунореагентики моноклонального типа. Моноклональные антитела (МКА), впервые разработанные Келлером и Мильштейном в 1975 г., в отличие от поликлональных антител 'ПКА), характеризуются высокой степенью гомогенности как по изотипам антител, так и шитопной направленности, аффинитету, специфичности, что особенно важно при использовании высокочувствительных тестов [АМ.Егоров, 1991]. Гибридомная технология эткрывает возможности препаративного накопления больших количеств МКА при юкращении затрат на их изготовление.
Подготовка панели МКА с охарактеризованной эпитопной направленностью не только существенно расширяет возможности диагностических реакций, для которых, как іравило, отбираются антитела с широким спектром реактивности [Walls Н.Н., 1986], но эткрывает новые перспективы для углубленной характеристики антигенной структуры зирусных изолятов и изучения путей эволюции возбудителя [Webster R.G., 1981; Lu B.L., 1982].
Известно, что МКА способны распознавать одиночные аминокислотные замены в ;оставе отдельных вирусных детерминант, что, естественно, невозможно при использовании толиклональной иммунной сыворотки [Arbiza J. ].
Высокая специфичность МКА исключительно ценна для создания усовершенствованных диагностических препаратов, повышения чувствительности и точности методов идентификации вирусов. Существуют возможности получения антител к отдельным эпитопам, характерным для данного штамма вируса. Использование МКА открывает новые, еще мало исследованные возможности и в понимании механизмов^ и мишени действия новых антивирусных соединений.
Цель и задачи исследования. Главная цель исследования заключалась в разработке новых и совершенствовании существующих средств и методов диагностики вирусных ОРЗ, для чего потребовалось решить следующие основные задачи.
-
Разработать новые и изучить свойства полученных ранее моноклональных антител к наиболее значимым возбудителям вирусных ОРЗ (грипп А, грипп В, респираторно-синцитиальный вирус и аденовирус).
-
Разработать и провести сравнительные исследования различных методов ранней диагностики вирусных ОРЗ (ИФЛ, ИФА в планшетном и дот - мембранном исполнении).
3. Оценить эффективность теста микропланшетного культивирования вирусов с
оценкой уровня их репродукции в ИФА (ММК-ИФА), возможности его использования для
первичной индикации возбудителей ОРЗ, а также для оценки ингибирующего воздействия
противовирусных субстанций (специфических антител, химиопрепаратов).
Основные положения, выносимые на защиту
Новые препараты МКА к вирусам гриппа типа В, респираторно-синцитиальному вирусу и аденовирусу, впервые разработанные в России, являются перспективными иммунореагентами, которые могут быть использованы в различных иммунотестах детекции вирусных антигенов.
Применение разработанных в ходе исследования МКА открывает новые возможности в повышении чувствительности и специфичности диагностических тестов, включая новый вариант микропланшетного культивирования вирусов с ИФА оценкой уровня их репродукции.
Разработка метода ИФЛ на основе МКА обеспечивает повышение стандартизации иммунореагентики и надежности диагностики за счет отчетливой локализации специфического свечения, облегчающей интерпретацию результатов.
Использование определенных типов МКА в иммунофермёнтных реакциях полностью устраняет развитие неспецифических реакций взаимодействия с host-компонентами при повышении уровня специфического сигнала, что обеспечивает высокую чувствительность и специфичность тестов.
Использование моноклональных антител 4Н7, обладающих вируснейтрализующей активностью и направленных к субъединице ГА2 молекулы гемагглютинина вируса гриппа В показало, что в составе вирусов гриппа В имеется эпитоп, характерный для эволюционной ветви вирусов, берущей свое начало от эталона В/Ямагата/1б/88.
Научная новизна работы
Впервые в России получены панели моноклональных антител к наиболее значимым возбудителям вирусных ОРЗ - вирусам гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу и аденовирусам.
Впервые дана характеристика эпитопной направленности, биологических и диагностических свойств полученных МКА.
Впервые определено, что моноклональные антитела 4Н7 к молекуле гемагглютинина вируса гриппа В, 9С5 к F-протеину респираторно-синцитиального вируса, 7F1 и 1EII к гексонному антигену аденовирусов, 1С6 и F8 к нуклеопротеину вируса гриппа А являются
перспективными реагентами для использования в диагностических иммунофлуоресцентных и иммуноферментньгх реакциях.
Впервые экспериментально установлено, что моноклональные антитела 4Н7 (к вирусу гриппа В), а также моноклональные антитела 8С5 и 8В10 (к PC-вирусу) обладают вируснейтрализующей активностью, что представляет интерес для разработки новых средств антивирусной терапии, а также структурной детерминации доменов, ответственных за индукцию вируснейтрализующих антител.
Впервые показано, что параллельное использование моноклональных антител 1С6 к консервативной детерминанте нуклеопротеина вируса гриппа типа А и моноклональных антител 33F11 к молекуле гемагглютинина вируса гриппа типа A (H3N2), реагирующих в пределах субтипа, позволяют осуществлять типовую и субтиповую идентификацию изолятов вирусов гриппа типа А в микропланшетном варианте ИФА.
Практическая значимость работы. Изучение набора МКА по признакам, существенно важным для диагностических целей (специфическая активность, стабильность свойств при реклонированин и рекультивировании, при лиофилизации и хранении, возможность конъюгации с флуоресцеин-изотиоцианатом - ФИТЦ и пероксидазой хрена) показало, что в наибольшей мере этим требованиям отвечают моноклональные антитела 4Н7 - для диагностики гриппа типа В, 1С6 - гриппа типа А, 9С5 - респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и моноклональные антитела 7F1 и 1Е11 - для распознавания заболеваний аденовирусной этиологии (в реакциях ИФЛ и ИФА). Результаты клинической апробации свидетельствуют о том, что МКА 33F11 могут быть использованы для субтиповой диагностики гриппа А методом микропланшетного культивирования (ММК-ИФА); моноклональные антитела 4Н7 оказались эффективным иммунореагентом для ранней диагностики гриппа типа В прямым иммунофлуоресцентным методом. Моноклональные антитела 9С5 к респираторно-синцитиальному вирусу, меченые ФИТЦ, давали наиболее высокие результаты при ранней диагностике РСВ-инфекции прямым иммунофлуоресцентным методом. Использование ММК-ИФА с применением моноклональных антител к вышеперечисленным возбудителям позволяет проводить первичный скрининг противовирусных препаратов.
Моноклональные антитела 4Н7 целесообразно использовать в изучении антигенного дрейфа вирусов гриппа типа В, показывая независимый путь эволюции вирусов ямагатской ветви от викторианской линии. При исследовании вирусов гриппа 55-летнего периода циркуляции установлено, что эпитоп, к которому направлены МКА 4Н7, впервые обнаруженный в составе вируса В/Ямагата/16/88, сохраняется у большинства изолятов последних лет выделения.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции "Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов" (Санкт-Петербург, 1994), на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов (1996 г.), а также представлены на международных конференциях "Progress in clinical virology" (Прага, 1995) и Xth International Congress of Virology (Иерусалим, 1996).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья в отечественном журнале и тезисы в трудах симпозиумов и двух международных конгрессов.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на :$?.