Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 18
1.1. Классификация и номенклатура Hsps 18
1.2. Функции Hsps
1.2.1. Внутриклеточные функции основных групп Hsps 22
1.2.2. Происхождение и функции экзогенных Hsps 42
1.2.3. Механизмы развития болезни Альцгеймера и участие в них Hsp70 и Hsp90 48
1.3. Регуляция экспрессии генов ТШ 58
1.4. Роль Hsps в адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды 79
1.4.1. Общие аспекты адаптации к неблагоприятным условиям среды на уровне клетки и организма 79
1.4.2. Роль Hsps в адаптации к гипертермии на примере Drosophila 84
1.4.3. Исследования роли Hsp70 в термальной адаптации у немодельных видов 93
1.4.4. Закономерности синтеза Hsps у видов, обитающих в контрастных температурных условиях 107
1.5. Структура и эволюция генов ТШ 107
2. Материалы и методы 121
2.1. Линии D. melanogaster 121
2.2. Штаммы E. coli 121
2.3. Ферменты рестрикции 121
2.4. Векторы 121
2.5. Антитела 122
2.6. Лабораторные животные 122
2.7. Сбор видов Diptera в естественных условиях обитания 122
2.8. Сбор видов Amphipoda 125
2.9. Получение образцов ткани верблюда Camelus dromedarius 125
2.10. Выделение лейкоцитарных фракций крови 125
2.11. Линии эукариотических клеток, условия культивирования 125
2.12. Условия теплового шока и определение термоустойчивости 126
2.13. Выделение тотальной РНК 126
2.14. Получение библиотек кДНК, ПЦР с обратной транскрипцией и RACE-анализ 126
2.15. Электрофорез РНК 127
2.16. Нозерн-гибридизация 127
2.17. Включение 35S-метионина в белки 127
2.18. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли) и окрашивание гелей Кумасси G-250 128
2.19. Двумерный электрофорез белков по О Фарреллу 128
2.20. Иммуноблоттинг 128
2.21. Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга 129
2.22. Выделение геномной ДНК 129
2.23. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 130
2.24. Получение геномных фаговых и космидных библиотек 130
2.25. Скрининг геномных фаговых и космидных библиотек 130
2.26. Выделение ДНК бактериофага 131
2.27. Электрофорез ДНК 131
2.28. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов 131
2.29. Включение радиоактивной метки в ДНК 132
2.30. Перенос и гибридизация по Саузерну 132
2.31. Выделение фрагментов ДНК из геля 132
2.32. Субклонирование фрагментов ДНК 132
2.33. Трансформация компетентных клеток 133
2.34. Выделение плазмидной ДНК 133
2.35. Секвенирование ДНК 133
2.36. Анализ последовательностей in silico 133
2.37. ПЦР и ОТ-ПЦР с анализом по конечной точке и в реальном времени 134
2.38. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка GAF D.
melanogaster 134 2.39. Получение белковых экстрактов из ядер клеток личинок D. melanogaster и S. singularior, культур клеток S2 и HEK293 135
2.40. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами теплового шока (EMSA) 135
2.41. Получение репортерных конструкций на основе вектора pGL4.10 1 2.42. Трансфекция и измерение интенсивности люминесценции 136
2.43. Получение плазмид для трансформации D. melanogaster 136
2.44. Р-элемент-зависимая трансформация D. melanogaster 137
2.45. Иммунопреципитация хроматина (ChIP-анализ) 137
2.46. Экспрессия рекомбинантных Hsp70 в клетках E. coli
2.47. Экспрессия рекомбинантного Hsp70 в культуре клеток Spodoptera frugiperda 138
2.48. Очистка рекомбинантного Hsp70 из молока трансгенных мышей 139
2.49. Мечение очищенного рекомбинантного Hsp70 флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 647) и изотопом 125I 139
2.50. Определение субстрат-связывающей активности рекомбинантного Hsp70 139
2.51. Определение шаперонной активности рекомбинантного человеческого Hsp70 139
2.52. Действие рекомбинантного Hsp70 на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами 140
2.53. Введение рекомбинантного Hsp70 подопытным крысам и индукция эндотоксинового шока 140
2.54. Определение основных биохимических характеристик плазмы крови при введении рекомбинантного Hsp70 и ЛПС 140
2.55. Бульбэктомия мышей линии NMRI 140
2.56. Введение рекомбинантного Hsp70 подопытным мышам
2.57. Биопсия и гистологическое исследование тканей головного мозга 141
2.58. Измерение уровня синаптофизина и липофусцина в тканях головного мозга 141
2.59. Определение уровня -амилоида и эндогенного Hsp70 в мозгу бульбэктомированных мышей 141
2.60. Статистическая обработка результатов 142
3. Результаты 143
3.1. Термоустойчивость исследуемых видов Diptera и Amphipoda 143
3.2. Транскрипция генов ТШ у личинок исследуемых видов Diptera при нормальных условиях и гипертермии 148
3.3. ДНК-связывающая активность HSF при нормальных условиях и TШ у видов семейства Stratiomyidae 151
3.4. Синтез Hsp70 у различных видов Diptera при нормальной температуре и ТШ 152
3.5. Уровень мРНК и белка Hsp70 у байкальских амфипод при нормальной температуре и после ТШ 162
3.6. Структура генов hsp70 и hsp83 у видов семейства Stratiomyidae 163
3.6.1. Получение и анализ кДНК генов hsp70 видов Stratiomys 163
3.6.2. Структура кластера генов hsp70 S. singularior 163
3.6.3. Структура кластера генов hsp70 O. pardalina 168
3.6.4. Характеристики белков Hsp70 S. singularior и O. pardalina 172
3.7. Структура генов hsp70 байкальских видов Amphipoda 173
3.8. Структура генов hsp83 S. singularior и O. pardalina 175
3.9. Клонирование и анализ структуры кластера генов группы HspA1 верблюда Camelus dromedarius 181
3.10. Анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных областей генов hsp70 и hsp83 in silico 187
3.10.1. Структура промоторных областей генов hsp70
S. singularior и O. pardalina 187
3.10.2. Структура промоторов генов hsp83 Diptera 189
3.10.3. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов группы hspA1 верблюда и других видов млекопитающих 190
3.11. Функциональный анализ активности промоторов генов ТШ разных видов двукрылых и млекопитающих 192
3.11.1. Сравнение активности промоторов hsp70 и hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider 2 192
3.11.2. Анализ связывания факторов транскрипции с промоторными областями генов hsp70 и hsp83 S. singularior in
vitro 194
3.11.3. Влияние вставки GAGA-сайтов на активность промотора гена hsp70S3 в клетках S2 197
3.11.4. Определение активности различных вариантов промоторов hsp70 S. singularior в клетках D. melanogaster in vivo 198
3.11.5. Анализ взаимодействия GAF с промоторными областями генов hsp70Aa и hsp70S3 у трансгенных линий in vivo 202
3.11.6. Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и H. sapiens в культурах клеток человека 203
3.12. Изменения стабильности Hsp70 S. singularior при экспрессии в клетках D. melanogaster 208
3.13. Изучение потенциала применения рекомбинантного Hsp70 в качестве иммуномодулятора и нейропротектора 210
3.13.1. Выделение и анализ активности различных форм рекомбинантного Hsp70 210
3.13.2. Влияние экзогенного рекомбинантного Hsp70 на выживаемость лабораторных животных в эксперименте по моделированию эндотоксинового шока 214
3.13.3. Влияние экзогенного Hsp70 на значения биохимических показателей крови при моделировании эндотоксиного шока 217
3.13.4. Изменения уровней эндогенного Hsp70, -амилоида и пространственной памяти у бульбэктомированных мышей 217
3.13.5. Регистрация флуоресцентно и радиоактивно меченого экзогенного Hsp70 в мозгу после интраназального введения 219
3.13.6. Экзогенный Hsp70 при интраназальном введении снижает аккумуляцию A в мозгу бульбэктомированных и трансгенных (5XFAD) мышей 221
3.13.7. Интраназальное введение рекомбинантного Hsp70 приводит к нормализации уровня синаптофизина и липофусцина в мозгу старых животных 221
4. Обсуждение результатов 224
4.1. Характер экспрессии генов hsp70 у видов, относящихся к различным семействам отряда Diptera, обитающих в контрастныхтемпературных условиях 224
4.2. Эволюция кластера генов hsp70 и hsp83 233
4.3. Структурно-функциональная специфичность промоторов генов hsp70 и hsp83 разных видов Diptera и млекопитающих 238
4.4. Иммуномодулирующее действие экзогенного Hsp70 244
4.5. Экзогенный Hsp70 как нейропротектор 247
5. Выводы 251
Благодарности 253
Список цитируемой литературы
- Общие аспекты адаптации к неблагоприятным условиям среды на уровне клетки и организма
- Сбор видов Diptera в естественных условиях обитания
- Мечение очищенного рекомбинантного Hsp70 флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 647) и изотопом 125I
- Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и H. sapiens в культурах клеток человека
Общие аспекты адаптации к неблагоприятным условиям среды на уровне клетки и организма
В особую группу выделяют так называемые шаперонины, образующие два семейства белков. К первому из них относятся бактериальные белки GroEL (Hsp60) и GroES (Hsp10), а также их эукариотические гомологи, функционирующие в матриксе митохондрий (но кодируемые ядерным геномом). У человека охарактеризованы два гена: HSPD, кодирующий гомолог GroEL, и HSPE (гомолог GroES). Ко второй группе относят белки семейства CCT (chaperonins containing t-complex polypeptide 1), функционирующие в цитозоле эукариот и архей. Белки, относящиеся к семейству CCT, формируют олигомеры из 8-и субъединиц, каждая из которых у млекопитающих кодируется собственным геном (CCT1 – 8) (Kampinga et al. 2009). На уровне аминокислотной последовательности они имеют 30% гомологию друг с другом и 15 – 20% гомологию с GroEL, что говорит об их общем эволюционном происхождении (Brackley, Grantham 2009). В ходе секвенирования и аннотации генома D. melanogaster были охарактеризованы четыре гена шаперонинов, обозначенные как Hsp60A, Hsp60B, Hsp60C и Hsp60D (Sarkar and Lakhotia 2005).
Hsp70 (DnaK у бактерий) являются наиболее полно охарактеризованным семейством. В геноме человека найдено 13 генов, кодирующих белки этой группы, обозначаемые как HSPA. Наиболее выраженная индукция при ТШ была показана для белков HSPA1A, HSPA1B и HSPA6, их продукты локализуются в цитозоле и при ТШ транспортируются в ядро. HSPA1L и HSPA2 являются тканеспецифичными белками, конститутивно синтезирующимися на высоком уровне в семенниках и некоторых других тканях. HSPA5 локализуется в эндоплазматической сети (ранее обозначался как GRP78 или BiP – Binding Immunoglobulin Protein) и необходим для фолдинга практически всех белков, поступающих в эндоплазматическую сеть, в т.ч. иммуноглобулинов. HSPA7 долгое время считался псевдогеном, но последние данные свидетельствуют о том, что это полноценный ген, обладающий высокой гомологией с геном HSPA6 (Kampinga et al. 2009). HSPA8, ранее обозначавшийся как HSC70 или HSP73, является основным «house-keeping» белком семейства Hsp70, локализуется в цитозоле и задействован в фолдинге белков, происходящем параллельно с процессом трансляции, и их транспорте через внутриклеточные мембраны. HSPA9 является митохондриальным белком, который ранее обозначался как морталин (mtHSP70 или GRP75). У мыши обнаружены две высокогомологичных формы морталина – mot-1 и mot-2 (Kaul et al. 2007). HSPA13 (или Stch) локализуется в микросомах. HSP12A, HSP12B и HSP14 – эволюционно более отдаленные представители семейства Hsp70, о функциях которых на сегодня нет достоверной информации. Гены HSPA1A, HSPA1B и HSPA1L образуют в геноме человека и др. млекопитающих тесный кластер, остальные гены этой группы рассеяны по геному (Milner, Campbell 1990; Milner, Campbell 1992).
В геноме D. melanogaster имеются 5 или 6 высокогомологичных генов (их продукты отличаются всего лишь по семи аминокислотным остаткам), кодирующих стресс-индуцибельный Hsp70, расположенных в виде двух кластеров в локусах 87A и 87В, один ген белка Hsp68 в локусе 95D, также имеющий индуцируемый характер экспрессии, и 7 генов, кодирующих конститутивные Hsp70 (Hsc70), экспрессирующихся при нормальных условиях: hsc70-1, hsc70-2, hsc70-3, hsc70-4, hsc70-5, hsc70-6 и hsc70Cb (хотя последний следует относить скорее к группе Hsp110, см. ниже). Белковые продукты некоторых из них были подробно охарактеризованы. Hsc70-1 и hsc70-4 кодируют цитоплазматические белки массой 70 кДа, на 82% гомологичные друг другу. Hsc70-3 кодирует белок массой 72 кДа, локализующийся в эндоплазматической сети. Hsc70-5 кодирует белок массой 74 кДа, содержащий сигнальную последовательность для транспорта в митохондрии. Данный белок на 64% гомологичен дрожжевому митохондриальному Hsp70, и только на 50% гомологичен остальным Hsc70 D. melanogaster (Rubin et al. 1993). Вообще, для разных генов Hsp70 характерна более высокая гомология с соответствующими генами-ортологами из разных организмов, чем с другими генами группы Hsp70 того же самого организма. Это свидетельствует об их ранней амплификации в ходе эволюции (Rubin et al. 1993).
Hsp110, имеющие 30% гомологию и сходную с Hsp70 третичную структуру, очевидно дивергировали от последних на ранних этапах эволюции (Lee-Yoon et al. 1995). У человека обнаружены четыре гена данного семейства, обозначаемые как HSPH1 – 4. Белки, кодируемые генами HSPH1 – 3, локализуются в цитозоле, а HSPH4 (GRP170) – в эндоплазматической сети (Kampinga et al. 2009). У D. melanogaster были найдены два гена, относящиеся к этой группе, Hsp70Cb и CG2918 (Easton et al. 2009). Судя по аминокислотной последовательности кодируемых ими белков, Hsp70Cb является гомологом человеческого цитозольного белка HSPH1, тогда как CG2918 имеет высокую гомологию с человеческим эндоплазматическим белком HSPH4 (GRP170).
Семейство Hsp90 человека представлено пятью генами, обозначаемыми как HSPC1 – 5. Гены HSPC1, HSPC2 и HSPC3 кодируют цитозольные белки, белок HSPC4 (ранее обозначавшийся как GRP94) локализуется в эндоплазматической сети, и наконец HSPC5 (TRAP1, HSP90L) помимо цитозоля обнаруживается в митохондриях (Kampinga et al. 2009). В геноме D. melanogaster обнаружен единственный ген для цитозольного белка, продукт которого имеет молекулярную массу 83 кДа и обозначается как Hsp83, а также по одному гену для эндоплазматического и митохондриального гомологов Hsp90 (Sorger, Pelham 1987; Felts et al. 2000). У бактерий Hsp90 представлен группой белков, обозначаемых как HtpG (Chen et al. 2006).
Часть перечисленных Hsps можно выделить в отдельную группу так называемых глюкозо-регулируемых белков (GRP). К ним относятся представители групп Hsp70, Hsp90 и Hsp100. Из них GRP78, GRP94 и GRP170 (по новейшей номенклатуре HSPA5, HSPC4 и HSPH4) локализуются в эндоплазматической сети, GRP75 (HSPA9) функционирует в митохондриях. Общим свойством глюкозо-регулируемых белков является их индукция по регуляторному пути, получившему название unfolded protein response (UPR), активация которого происходит вследствии нарушения фолдинга белков в эндоплазматической сети и митохондриях. Помимо недостатка глюкозы индукция GRP может вызываться действием ингибиторов N-гликозилирования, ионами тяжелых металлов, кальций-хелатирующими агентами и др. (Chen, Brandizzi 2013).
Несколько особняком находится группа Hsps, относящаяся к семейству ААА+ (ATPases associated with a wide variety of cellular activities). Это очень многочисленная гетерогенная группа белков с молекулярными массами порядка 100 кДа, участвующих в рефолдинге белковых агрегатов и деградации белков, в т. ч. по убиквитин-зависимому пути (Mayer 2010; Ciechanover, Stanhill 2013). Обобщение современной классификации белков теплового шока дано в таблице 1.
Следует отметить, что при стрессовых воздействиях помимо стандартного набора Hsps в клетке происходит индукция достаточно большого количества других белков. В отличие от «классических» Hsps, мРНК большинства из которых способны транслироваться в условиях повышенной температуры, повышение уровня синтеза ряда белков происходит после восстановления нормальных условий. К стресс-индуцируемым белкам относятся оксигеназа гема, коллагеназа, ферменты гликолиза, многие регуляторные белки (например, eIF-2a). Самым примечательным из так называемых «нестандартных» Hsps является убиквитин. При повышении температуры количество мРНК убиквитина возрастает в клетках в 4 - 5 раз, поскольку для восстановления нормальной работы клеточных механизмов требуется утилизация большого количества необратимо поврежденных стрессом белков (по убиквитин-зависисмому пути). Промоторная область гена убиквитина содержит HSE-последовательность, являющуюся регуляторным цис-элементом генов ТШ (Fornace et al. 1989). Подробнее данные по изменениям транскриптома и протеома клетки после стрессовых воздействий приводятся в разделе 1.4.
Сбор видов Diptera в естественных условиях обитания
Секреция Hsps клетками стимулируется действием различных стрессовых факторов, вызывающих индукцию генов ТШ. Повышение уровня секреции Hsp70 происходит после теплового шока (Hightower, Guidon 1989; Clayton et al. 2005), а также при действии неспецифичных бактериальных антигенов (таких как GroEL) и липополисахарида (ЛПС, основной эндотоксин Грам-негативных бактерий) как in vitro, так и in vivo. Введение очищенного GroEL и ЛПС в культуральную среду вызывает увеличение уровня секреции Hsp70 культивируемыми моноцитами в 10 и 3 раза соответственно (Davies et al. 2006). Внутривенное введение ЛПС приводит к повышению уровня Hsp70 в сыворотке крови крыс (Tsai et al. 2015). В качестве еще одного индуктора секреции Hsp70 может выступать повышение уровня внеклеточного АТФ (Mambula, Calderwood 2006). Те же стимулы (внеклеточный АТФ и ЛПС) приводят к повышению секреции макрофагами IL-1, высвобождающегося по тому же механизму, что и Hsp70 (Calderwood et al. 2007). Таким образом, секреция Hsp70 индуцируется неспецифическими маркерами, свидетельствующими об инфекционном процессе или массовой гибели клеток. Кроме того, уровень экзогенного Hsp70 может повышаться при некрозе непосредственно за счет выхода белка из разрушающихся клеток.
Внеклеточные Hsps, в частности Hsp70, не способны выполнять шаперонные функции в отсутствие высокой концентрации АТФ (составляющей 2мМ в цитоплазме клеток) и набора белков-кофакторов. Тем не менее было показано, что внеклеточные Hsps, в частности Hsp70 и Hsp60, узнаются рядом так называемых паттерн-распознающих рецепторов (pattern recognition receptors – PRR), являющихся важнейшим звеном врожденного иммунитета. PRR отвечают за распознавание широкого спектра консервативных молекулярных структур, не имеющих аналогов в организме, но присущих возбудителям большинства бактериальных, грибковых и вирусных инфекций (липополисахариды, формилпептиды, тейхоевые и липотейхоевые кислоты, зимозан, двуспиральные РНК и др., названные патоген-ассоциированными молекулярными структурами – pathogen-associated molecular patterns, РАМР). В первую очередь Hsp70 и Hsp60 узнаются рецепторами TLR2 и TLR4, относящимися к группе toll-подобных рецепторов, а также рецепторами LOX-1, SREC-1 и CLEVER-1 (группа Scavanger receptors, SR). Кроме того, по некоторым данным, в распознавании экзогенных Hsps могут участвовать рецепторы CD40 (семейство рецепторов TNF), CD91 (рецептор липопротеинов низкой плотности) и CCR5 (хемокиновый рецептор) (Basu et al. 2001; Calderwood et al. 2007). Показано, что некоторые рецепторы могут узнавать как собственные внеклеточные Hsps, так и Hsps бактериального происхождения (например, CD40 способен распознавать Hsp70 микобактерий) (Wang et al. 2001).
Экзогенный Hsp70 способен, взаимодействуя с рядом рецепторов на клеточной поверхности, подвергаться интернализации клетками-мишенями. По-видимому, за фагоцитоз экзогенного Hsp70 отвечают рецепторы TLR2/4, CD91 и SR (Srivastava 2002; Calderwood et al. 2007).
Иммунная система может по-разному реагировать на экзогенные Hsps, в частности Hsp70. Характер реакции может зависеть от воздействий других иммуногенных сигналов, а также от концентрации внеклеточного Hsp70. В ряде пионерских работ на эту тему было постулировано, что повышение уровня внеклеточного Hsp70 вызывает продукцию провоспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IL-6) и оксида азота NO макрофагами и нейтрофилами посредством активации рецепторов TLR2 и 4; экзогенный Hsp70 при этом является неспецифическим маркером различных патологических процессов и стимулирует иммунный ответ (Asea et al. 2000; Fleshner, Johnson 2005). Известно, что аналогичный эффект оказывают эндотоксины Грам-отрицательных бактерий (липополисахариды) посредством активации той же группы toll-подобных рецепторов, TLR2/4. В связи с этим было высказано предположение, что описанные эффекты объясняются контаминацией рекомбинантного Hsp70, использовавшегося в данных работах и экспрессируемого в культуре E. coli, липополисахаридом, способным индуцировать реакцию макрофагов и нейтрофилов даже в следовых количествах (Bausinger et al. 2002). Впоследствии с использованием Hsp70, выделенного из эукариотических экспрессионных систем (например, бакуловирусной системы) и свободного от загрязнений ЛПС и бактериальными белками, были получены данные о том, что экзогенный Hsp70 обладает скорее иммуносупрессорным эффектом. Так, Hsp70, очищенный от примесей эндотоксинов, подавляет воспаление дыхательных путей аллергической этиологии у мышей (Шевченко и др. 2016). На модели культивируемых моноцитов экзогенный Hsp70 вызывал толерантность к ЛПС (Aneja et al. 2006). Было показано, что действие экзогенного Hsp70 in vitro и in vivo подавляет внутриядерную транслокацию транскрипционного фактора NF-B (р65), индуцируемую действием ЛПС, и активность протеинкиназ MAPK/JNK, а также продукцию активных форм кислорода (АФК) (Borges et al. 2013; Hsu et al. 2014; Ghosh et al. 2015; Троянова и др. 2015). Таким образом, экзогенный Hsp70 является скорее антагонистом ЛПС, блокирующим активацию TLR2 и 4. По данным, полученным на клеточных культурах и на лабораторных животных, введение экзогенного Hsp70, свободного от примесей ЛПС, подавляет продукцию провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода нейтрофилами и макрофагами, а также способствует апоптозу нейтрофилов (Rozhkova et al. 2010). Кроме того, внутривенное введение Hsp70 предотвращало развитие симптомов септического шока при инъекции ЛПС и липотейхоевой кислоты у лабораторных животных (Kustanova et al. 2006; Rozhkova et al. 2010; Vinokurov et al. 2012). Интересно, что внутриклеточный Hsp70 также выступает в качестве ингибитора сигнальных каскадов, индуцируемых активацией TLR4, опосредуя убиквитинилирование TLR4 убиквитинлигазой CHIP (см. раздел 1.2.1) (Afrazi et al. 2012). С другой стороны, показано, что Hsp110, имеющий структуру, близкую к Hsp70 (см. разделы 1.1 и 1.2.1), полученный в бакуловирусной экспрессионной системе (таким образом, свободный от примесей ЛПС), вызывает активацию антигенпрезентирующих клеток, продукцию ими провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-12 и TNF), а также экспрессию MHCII, CD40 и СD86 (Manjili et al. 2005). Есть данные в пользу того, что экзогенный Hsp70 в различных ситуациях может оказывать как иммуностимулирующее, так и иммуносупрессорное действие. Предполагается, что быстрое увеличение концентрации экзогенного Hsp70 (например, при массированной гибели клеток в результате травм, высвобождения бактериальных Hsp70 при инфекционных процессах или введения высоких концентраций рекомбинантного Hsp70) приводит к активации иммунного ответа и развитию воспалительной реакции путем активации рецепторов CD40 и CCR5. С другой стороны, постепенное поступление Hsp70 в кровоток при хронических воспалительных процессах может оказывать противовоспалительный эффект за счет ингибирования toll-подобных рецепторов и связанных с ними сигнальных каскадов (Calderwood et al. 2007; Mambula et al. 2007). Следует учитывать, что Hsp70 и другие шапероны (в т.ч. рекомбинантные, используемые в экспериментах по иммуномодуляции) могут выделяться из клеток в разных формах: в комплексе с АТФ или АДФ, а также с пептидами-мишенями. Разные формы Hsps могут узнаваться разными рецепторами и оказывать различные эффекты на активность клеток иммунной системы.
Помимо модуляции реакций со стороны системы врожденного иммунитета, экзогенные Hsps способны участвовать в развитии адаптивного иммунного ответа. Показано, что Hsp70 и Hsp90, выделенные из злокачественных опухолей, способны индуцировать иммунный ответ путем активации антигенпрезентирующих клеток и цитотоксических (CD8+ и CD4+) T-лимфоцитов (Srivastava 2002). Было показано, что Hsp70 и Hsp90 выделяются из опухолей в комплексе с олигопептидами, способными выступать в качестве антигенов – инициаторов иммунного ответа (Srivastava 2002; Nishikawa et al. 2008; Stauss et al. 2003). Далее происходит фагоцитоз комплексов Hsps-пептид антигенпрезентирующими макрофагами посредством узнавания Hsps рецепторами CD91. После этого опухолеспецифичные антигенные пептиды презентируются с участием как MHCI, так и MHCII с участием TAP1-зависимого и эндосомального пути (Srivastava 2002; Nishikawa et al. 2008). В результате происходит активация Т-эффекторов, распознающих и атакующих опухолевые клетки. Соответственно, Hsp70 и Hsp90 в комплексе с антигенными пептидами, очищаемые из опухолей пациентов, могут рассматриваться как персонализированные вакцины, для применения в комплексе со стандартными методами лечения.
Мечение очищенного рекомбинантного Hsp70 флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 647) и изотопом 125I
Сходные результаты были получены при сравнении лабораторной линии D. melanogaster Oregon R (OR), характеризующейся низким уровнем термоустойчивости, и природной линии, отловленной в Центральной Африке (Республика Чад). Мухи линии OR, как и большинство других линий/), melanogaster, становятся стерильными при температуре выше 29С. Африканская линия, названная Termotolerance (Т) остается фертильной при постоянной температуре до 32С, и переносит более высокую температуру при кратковременном ТШ. При этом у термочувствительной линии OR при 37С наблюдается в 2 раза более высокий уровень накопления Hsp70, чем у линии Т (рис. 11). При более высоких температурах (39С) синтез Hsp70 у линии Т сохраняется, тогда как у OR прекращается полностью (по данным включения в белки радиоактивной метки и Вестерн-блоттинга). Индукция мРНК hsp70 у исследуемых линий сохранялась при 39С; при этом синтез белка Hsp70 полностью подавляется у OR, но сохраняется у линии Т. Это говорит о том, что у термочувствительной линии OR при температурах, близких к критическим, происходит полная инактивация аппарата трансляции, тогда как у более термоустойчивой линии Т трансляция Hsp70 продолжается при том же значении температуры (Zatsepina et al. 2001).
Было показано, что снижение уровня Hsp70 у линии Т по крайней мере частично обусловливается встраиванием в промоторную область гена hsp70Ba мобильного элемента Jockey. Вставка была локализована в области между вторым и третьим HSE. Таким образом, она приводит к увеличению расстояния между HSE3/HSE4 и ТАТА-боксом и, в результате, к нарушению взаимодействия связывающихся с ними молекул HSF с аппаратом транскрипции (Zatsepina et al. 2001). В последующих работах у ряда линий D. melanogaster, полученных из природных популяций, обитающих в зонах с теплым климатом, в промоторах ряда генов hsp70 были обнаружены интеграции Р-элемента (Lerman et al. 2003; Walser et al. 2006; Haney, Feder 2009). В некоторых случаях встраивание мобильных элементов в промоторы hsp70 приводит к увеличению фертильности в условиях существования при повышенной температуре (Michalak et al. 2001; Lerman et al. 2003; Lerman and Feder 2005; Shilova et al. 2006; Chen et al. 2007; Chen et al. 2008). Полученные данные свидетельствуют о том, что встраивание мобильных элементов в промоторные области генов ТШ, приводящее к снижению синтеза Hsp70, оказывается выгодным в условиях жаркого климата и закрепляется отбором. Интересно, что гены hsp70, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» для транспозиции мобильных элементов благодаря конститутивно деконденсированному состоянию хроматина. Подробно вопрос об избирательном встраивании мобильных элементов в промоторные области генов ТШ рассматривается в разделе 1.5.
В дальнейшем работы по изучению роли Hsp70 в адаптации к высокой температуре у Drosophila были продолжены на видах, относящихся к филогенетическим группам virilis и repleta. Группа virilis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяло изучить возможные этапы эволюции генов hsp70 путм их секвенирования и сравнения со структурой генов более поздних видов, относящихся к группе melanogaster. В работах (Krebs 1999; Гарбуз и др. 2002; Garbuz et al. 2003; Evgenev et al. 2004) были использованы виды и внутривидовые линии Drosophila, значительно отличающиеся по географическому распространению и температурному режиму среды обитания. D. virilis характеризуется тропическим и субтропическим распространением. D. lummei, относящаяся к той же группе видов virilis, обитает преимущественно в северных районах, доходя до Полярного круга в Финляндии. Были охарактеризованы несколько географических линий обоих видов, полученные из разных регионов. D. novamexicana распространена в жарких аридных областях Северной Америки (южные штаты США). D. texana распространена также в южных штатах (Техас), но в областях с более мягким климатом. В качестве наиболее термоустойчивого был выбран вид D. mojavensis (Мексика), относящийся к группе repleta. Время дивергенции видов D. virilis - D. lummei составляет 4 млн. лет (Patterson, Stone 1952). Это дает основание предположить, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у данных видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены случайными изменениями в ходе эволюционной дивергенции. В опытах по определению критической температуры (тепловой шок, при котором выживает менее 1% особей) все линии D. lummei и D. texana характеризовались меньшей термоустойчивостью, чем линии D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis. Кроме того, оказалось, что у D. lummei полностью отсутствует индуцируемая термотолерантность. D. virilis и D. mojavensis при постоянной температуре, равной 32С, сохраняют фертильность, тогда как D. lummei, как и D. melanogaster, неспособна к размножению при этой температуре. Наибольшей термоустойчивостью среди всех описанных видов Drosophila характеризовалась D. mojavensis, для которой критическая температура составляла 43.5С (Гарбуз и др. 2002; Garbuz et al. 2003). Рисунок 11. Уровни Hsp70 у разных видов и линий Drosophila после ТШ. Видно, что термочувствительные виды D. lummei и D. texana накапливают минимальные количества Hsp70 по сравнению с термоадаптированными видами D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis. D. melanogaster является исключением: у термоустойчивых линий этого вида происходит отбор на понижение уровня экспрессии Hsp70. Схема дана по (Krebs 1999; Гарбуз и др. 2002; Garbuz et al. 2003).
Были проведены исследования межвидовых и внутривидовых различий уровня накопления Hsp70 после теплового шока разной интенсивности. Все исследованные виды Drosophila так же, как и D. melanogaster, не имеют заметного базального уровня Hsp70 (Garbuz et al. 2003). Оказалось, что в пределах филады virilis в отличие от D. melanogaster наблюдается положительная корреляция между содержанием Hsp70 и терморезистентностью. Холодолюбивые виды D. lummei и D. texana накапливают Hsp70 в существенно меньших количествах, чем теплолюбивые D. virilis и D. novamexicana, а также D. mojavensis. При этом линия OR D. melanogaster, характеризующаяся наименьшим уровнем термоустойчивости из всех изученных видов и линий Drosophila, при температуре 36 - 37С вырабатывает максимальные количества Hsp70. Линия Т по уровню накопления Hsp70 и термоустойчивости оказывается промежуточной между Oregon R и D. virilis. Однако при более высоких температурах (выше 38С) большинство термоадаптированных видов накапливают Hsp70 в количествах, многократно превышающих уровни Hsp70 у термочувствительных видов (при тех же температурах) (см. рис. 11) (Krebs 1999; Garbuz et al. 2003). Это подтверждает данные, полученные на линиях с делециями генов hsp70, о ведущей роли Hsp70 именно в адаптации к тяжелому тепловому шоку, когда происходит значительное повреждение клеточных белков.
Данные Нозерн-гибридизации тотальной РНК с меченым зондом к hsp70 показывают, что у D. lummei транскрипция генов hsp70 полностью прекращается при 40С и восстанавливается только через час после ТШ. В то же время ДНК-связывающая активность HSF у D. lummei сохраняется даже при 41С. При 39С у термочувствительных разновидностей происходит подавление трансляции, хотя транскрипция генов hsp70 еще сохраняется. Таким образом, при 40С нарушаются функции основных компонентов аппарата транскрипции - РНК-полимеразы II или других факторов (см. раздел 1.3). У D. virilis синтез мРНК и белка Hsp70 сохраняется как при 40С, так и при 41С. Таким образом, характерной особенностью термоадаптированных разновидностей Drosophila является повышенная устойчивость компонентов аппарата транскрипции и трансляции к температурам, близким к критическим. Подобная устойчивость может достигаться в ходе отбора белков, более стабильных при высокой температуре за счет аминокислотных замен, приводящих к образованию дополнительных внутримолекулярных взаимодействий и повышению стабильности третичной структуры белка (Fields 2001). У видов с низким уровнем адаптации высокие температуры вызывают быструю инактивацию систем транскрипции и трансляции, что приводит к отсутствию накопления Hsp70 и гибели. Еще одной важной особенностью термоустойчивых линий и видов Drosophila является более высокая температура, при которой происходит активация HSF и синтез Hsps (Zatsepina et al. 2001; Garbuz et al. 2003). Эти данные коррелируют с результатами, полученными на других таксонах (см. ниже).
Положительная корреляция между уровнем Hsp70 и термоустойчивостью соблюдается для видов и внутривидовых линий групп virilis и repleta, но отсутствует у термоустойчивых и термочувствительных линий D. melanogaster. По-видимому, адаптация путем увеличения количества Hsp70 у Drosophila возможна только до определенного предела, после превышения которого начинают сказываться негативные эффекты избыточных количеств Hsp70 на процессы пролиферации клеток при развитии (Krebs, Feder 1997).
Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и H. sapiens в культурах клеток человека
Различия в уровне накопления Hsp70 у термоадаптированных и холодолюбивых видов Stratiomyidae могут объясняться разной структурой промоторных областей генов hsp70, либо строением кластера генов hsp70 в целом. На первом этапе в целях изучения структуры генов hsp70 видов Stratiomyidae была получена библиотека кДНК из подвергнутых ТШ личинок S. singularior. Для скрининга библиотеки использовался зонд к гену hsp70Aa D. melanogaster (см. раздел 2.14). Была выделена и секвенирована полноразмерная кДНК одного из генов hsp70 S. singularior (последовательность депонирована в NCBI GenBank под номером EU523048). Она гомологична гену hsp70Aa D. melanogaster на 73% в области рамки считывания, только на 53% в области 5-UTR и на 55% в области 3-UTR. 5-UTR имеет длину 231 нуклеотид, что сравнимо с длиной 5-UTR генов hsp70 D. melanogaster (256 нуклеотидов), и так же, как 5-UTR hsp70 D. melanogaster, состоит преимущественно из пуринов. Показано, что такая структура у D. melanogaster необходима для эффективной трансляции в условиях ТШ (Hernndez et al. 2004). На основе полученной нуклеотидной последовательности был синтезирован набор праймеров для 5-и 3-RACE-анализа (Приложение 1). 3-RACE-анализ показал наличие минимум пяти генов группы hsp70, значительно различающихся по структуре 3-UTR. Помимо кДНК гена hsp70 S. singularior, методом ПЦР с праймерами к консервативным участкам генов hsp70 был клонирован фрагмент CDS одного из генов hsp70 S. japonica длиной 1135 п.о. (депонирован в NCBI GenBank под номером JN627863), гомологичный соответствующему фрагменту гена hsp70 S. singularior на 95%.
Для изучения организации кластера генов hsp70 S. singularior и O. pardalina были получены геномные библиотеки из ДНК обоих видов на основе фага DASH. Для скрининга библиотек использовался EcoRI-фрагмент кДНК гена hsp70 S. singularior. При скрининге библиотеки, полученной из S. singularior, были выделены девять частично перекрывающихся рекомбинантных фагов, обозначенных как 5, 8, 10, 17, 33, 51, 52, 63 и 164 (рис. 30). Фаги были проанализированы методом рестрикционного и Саузерн-анализа. Были построены подробные рестриктные карты отобранных фагов по рестриктазам HindIII, PstI, EcoRI, SalI и XbaI (см. рис. 30). Для каждого из фагов путем обработки различными рестриктазами и их комбинациями с последующим переклонированием фрагментов рестрикции в фагемиду pBluscriptSK+ был получен набор перекрывающихся субклонов. На основании рестриктных карт и определения нуклеотидной последовательности субклонированных фрагментов были сделаны выводы о перекрывании фагов, взаимной ориентации генов hsp70 и расстояниях между ними.
Полный вариант кластера генов hsp70 S. singularior состоит из 5-и копий, обозначенных как hsp70S1, hsp70S2, hsp70S3, hsp70S4 и hsp70S5. Два гена (hsp70S1 и hsp70S2) расположены в виде инвертированного повтора на расстоянии 1.2 т.п.о. друг от друга, остальные – в тандемной ориентации к гену hsp70S2 на разных расстояниях друг от друга (рис. 30 и 31). Все пять генов имеют характерные отличия в строении 3-UTR, позволяющие идентифицировать гены в составе разных клонов и подтверждающие результаты 3-RACE-анализа (см. выше). Гены hsp70 S. singularior, как и гены hsp70 большинства организмов, не имеют интронов. CDS каждого гена имеет длину 1917 п.о. Было показано, что нуклеотидные последовательности, фланкирующие соседние гены, расположенные в тандемной ориентации, не имеют между собой сколько-нибудь существенной гомологии. Это достаточно неожиданный результат, учитывая высокое сходство интергенных участков ДНК в кластерах генов hsp70 у всех изученных в этом плане видов Drosophila (Evgenev et al. 2004; Tian et al. 2010).
Секвенирование рекомбинантных фагов показало высокий полиморфизм кластера генов hsp70 S. singularior в изучавшейся нами популяции. Показано несколько масштабных перестроек и, по сути, существование трех основных вариантов организации кластера генов hsp70, а также несколько небольших изменений в области фланкирующих последовательностей тех или иных генов hsp70. Так, в случае фага 52 показана делеция гена hsp70S2 вместе с протяженной частью 3-фланкирующей последовательности, а в фагах 51 и 33 – независимые делеции гена hsp70S4. Кроме того, показаны делеции небольших фрагментов в составе интергенных участков между копиями hsp70S2 и hsp70S3, а также hsp70S4 и hsp70S5 (фаги 71 и 8 соответственно, см. рис. 30, 31). При этом в случае фага 71 делеция захватывает значительную часть промоторной области вместе с 5-UTR гена hsp70S3, включая последовательность, содержащую необходимые для индуцируемой транскрипции элементы HSE, что, по-видимому, лишает данный аллель способности к индукции при ТШ. Максимальное значение для расстояний между тандемно ориентированными копиями составляет 5.9 т.п.о. – между hsp70S2 и hsp70S3, 4.7 т.п.о. –
. Строение рекомбинантных фагов, содержащих участки кластера генов hsp70 S. singularior. Отдельные копии hsp70 показаны горизонтальными стрелками. Вертикальные стрелки – границы делеций той или иной копии. Серый прямоугольник – фрагмент мобильного элемента Mariner. Слева указаны номера фагов. Пунктиром показаны отсеквенированные участки; даны номера двух последовательностей, депонированных в GenBank. Сайты эндонуклеаз рестрикции: H – HindIII, P – PstI, R1 – EcoRI, S – SalI, X – XbaI. между hsp70S3 и hsp70S4, и 5.3 т.п.о. – между генами hsp70S4 и hsp70S5. В составе участка, расположенного между генами hsp70S2 и hsp70S3, обнаружен фрагмент мобильного элемента Mariner. Интеграции транспозонов – частое и, по всей видимости, системное явление в эволюции кластера генов hsp70 двукрылых, например, многочисленные встраивания Р-элемента в промоторные области генов hsp70 и экспансия -элементов в кластере hsp70B D. melanogaster, а также SGM и Galileo, фланкирующие 3-концы тандемно ориентированных генов hsp70 D. virilis, D. lummei и D. mojavensis (Shilova et al. 2006; Maside et al. 2002; Evgenev et al. 2004). Тем не менее, в случае S. singularior наличие . фрагмента Mariner в кластере генов hsp70, скорее всего, является следствием случайного события, произошедшего на ранних этапах эволюции. Об этом свидетельствует единичный характер инсерции, небольшая длина (314 п.о.) фрагмента и низкая степень гомологии (70%) с функциональным элементом Mariner.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют либо о постоянных перестройках структуры кластера генов hsp70 S. singularior путем внутрилокусных рекомбинаций, либо о существовании в области сбора материала для исследования (оз. Кояшское и Киркояшское) нескольких субпопуляций, частично изолированных друг от друга. Саузерн-анализ геномной ДНК S. singularior с зондами к 5- и 3-фрагментам кодирующей области гена hsp70S3 подтверждает высокую вариабельность кластера генов hsp70 у S. singularior и существование нескольких вариантов строения кластера, выявленных при секвенировании рекомбинантных фагов, полученных при скрининге геномной библиотеки (см. рис. 32).
В составе девяти выделенных фагов были секвенированы несколько аллелей каждого из пяти генов hsp70 S. singularior: 3 аллеля для гена hsp70S1, по 2 для hsp70S2 и hsp70S4, 4 для hsp70S3 и 5 для hsp70S5. При этом был показан достаточно высокий полиморфизм в области 5-UTR и CDS как между соседними генами, так и между аллелями одного и того же гена. Сравнение полученных последовательностей с помощью теста McDonald-Kreitman