Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Значимость вирусных инфекций для здравоохранения 8
1.2. Природа вирусов. Вирус иммунодефицита человека
1.2.1. Строение вириона ВИЧ 9
1.2.2. Жизненный цикл ВИЧ 11
1.3. Обратная транскриптаза ВИЧ-1 как мишень для разработки лекарственных средств 13
1.3.1. Структура обратной транскриптазы ВИЧ-1 13
1.3.2. Механизмы ингибирования обратной транскриптазы ВИЧ -1 15
1.4. Противовирусные средства широкого спектра действия 24
1.4.1. Ингибиторы входа оболочечных вирусов 24
1.4.2. Ингибиторы белок-белковых взаимодействий 27
2. Обсуждение полученных результатов 29
2.1. Синтез 2-(2-(урацил-1-ил)метил)фенокси)-N-фенилацетамидов 29
2.2. Синтез 2-(1-бензил-урацил-3-ил)-N-фенилацетамидов 30
2.3. Синтез 2-(3-бензил-урацил-1-ил)-N-фенилацетамидов 32
2.4. Синтез 3-бензил-1-циннамилурацилов 34
2.5. Синтез 2-(1-бензил-урацил-3-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамидов 35
2.6. Синтез 2-[1-(-феноксиалкил)урацил-3-ил]-N-(4-феноксифенил)ацетами дов 36
2.7. Синтез 1-(3-бензоилбензил)урацилов 40
3. Экспериментальная часть 45
3.1. Общие методы 45
3.2. Синтез целевых соединений
3.2.1. Синтез 2-(2-(урацил-1-ил)метил)фенокси)-N-фенилацетамидов 45
3.2.2. Синтез 2-(1-бензилурацил-3-ил)-N-фенилацетамидов 57
3.2.3. Синтез 2-(3-бензил-урацил-1-ил)-N-фенилацетамидов 64
3.2.4. Синтез 3-бензил-1-циннамилурацилов 70
3.2.5. Синтез 2-(1-бензил-урацил-3-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамидов 73
3.2.6. Синтез 2-[1-(-феноксиалкил)урацил-3-ил]-N-(4-феноксифенил)ацета мидов 75
3.2.7. Синтез 1-(3-бензоилбензил)урацилов 85
4. Биологическая активность 97
4.1. Ряд А 98
4.2. Ряд B 99
4.3. Ряд B1 100
4.4. Ряд B2 105
4.5. Ряд B3 107
4.6. Ряд B4 108
4.7. Ряд С 1 5. Выводы 117
6. Список терминов, условных обозначений и сокращений 118
7. Список литературы
- Природа вирусов. Вирус иммунодефицита человека
- Механизмы ингибирования обратной транскриптазы ВИЧ
- Синтез 2-[1-(-феноксиалкил)урацил-3-ил]-N-(4-феноксифенил)ацетами дов
- Синтез 2-(1-бензил-урацил-3-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамидов
Введение к работе
Актуальность темы. В течение последнего столетия наблюдается существенный прогресс в борьбе с инфекционными заболеваниями. Это было достигнуто благодаря улучшению санитарных условий, качества водоснабжения, развитию химиотерапии и вакцин и улучшению медицинской помощи, что резко снизило угрозу для здоровья человека, особенно в развитых странах. В первую очередь это справедливо для инфекций бактериальной природы. В тоже время, вирусные инфекции остаются серьезной проблемой для современного здравоохранения в силу высокой генетической изменчивости вирусов и сложности разработки этиотропных противовирусных агентов.
Учитывая широкую распространенность вирусных инфекций и
экономические потери, связанные с расходами на лечение, очевидно, что поиск соединений, обладающих противовирусной активностью, является крайне актуальной задачей. Особое значение придается поиску противовирусных агентов широкого спектра действия, способных подавлять репликацию различных вирусов. Создание на их основе препаратов, которые будут использованы в терапии социально значимых инфекционных заболеваний вирусной этиологии, является важнейшей задачей современной медицины.
Цели и задачи диссертации. Целью настоящего исследования является разработка на основе полиядерных производных урацила новых противовирусных агентов, эффективно ингибирующих репликацию различных вирусов, таких как ВИЧ-1, ВГС, ЦМВ, ВЗВ, РСВ. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
-
Разработать эффективные и доступные методы синтеза целевых соединений – полиядерных ароматических производных урацила.
-
Охарактеризовать физико-химические и спектральные свойства синтезированных соединений, подтвердить идентичность их структуры и чистоту.
-
Изучить противовирусную активность целевых соединений на инфекционных клеточных культурах и в отношении вирусных ферментов; параллельно определить их цитотоксичность.
-
На основе полученных данных выявить закономерности структура-противовирусная активность в рядах синтезированных соединений.
Научная новизна. Синтезированы не описанные ранее производные 2-(2-((2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1(2H)-ил)метил)фенокси)-N-фенилацетамида и 2-(3-бензил-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил)-N-фенилацетамида.
Синтезированы не описанные ранее производные 1-(3-бензоилбензил)-пиримидин-2,4(1H,3H)-диона. Найдено, что данные соединения проявляют некоторую анти-ВИЧ-1 и анти-ВГС активность.
Разработан синтез производных 2-(3-бензил-2,4-диоксо-3,4-дигидро-
пиримидин-1(2H)-ил)-N-фенилацетамида. Обнаружено, что данные соединения проявляют выраженную анти-ВИЧ-1 активность.
Синтезирован ряд производных 3-бензил-1-циннамилпиримидин-
2,4(1H,3H)-диона. Показано, что они проявляют выраженную активность как в отношении ВИЧ-1, так и в отношении ЦМВ.
Осуществлен синтез ранее не описанных производных 2-(3-бензил-2,6-
диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамидов. Най
дено, что данные соединения проявляют заметную ингибиторную активность в
отношении ЦМВ и ВГС.
Синтезированы ранее не описанные производные 2-(3-(-(4-
бромфенокси)алкил)-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамидов. Обнаружено, что данные соединения обладают широким спектром противовирусной активности и блокируют репликацию ВГС, ЦМВ, ВЗВ и РСВ в микро- и наномолярном диапазоне. Предварительные данные показывают, что их мишенью не являются вирусные ферменты.
Практическая ценность результатов. Разработанные синтетические подходы и данные биологических испытаний позволили выявить ряд соединений-лидеров, которые могут послужить основой для создания прототипов противовирусных препаратов широкого спектра действия для лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ-1, ВГС и ЦМВ.
Методы исследования. В данном исследовании применяются классические
методы и подходы медицинской химии, молекулярной биологии и вирусологии.
При осуществлении химического синтеза соединений-лидеров применялись как
известные методы, так и неописанные ранее синтетические подходы, что
подразумевало исследование реакционной способности промежуточных
соединений и селективности протекания химических процессов. Структура полученных соединений исследована с помощью методов 1H ЯМР, 13C ЯМР, а также масс-спектроскопии высокого разрешения.
Активность в отношении широкой панели оболочечных и безоболочечных
вирусов в культурах эукариотических клеток и изолированных вирусных
ферментов изучена в соответствии с известными методами. Кроме того, изучена
токсичность синтезированных соединений в релевантных культурах
эукариотических клеток. Результаты биологического скрининга
рационализированы с привлечением молекулярного докинга.
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Синтез соединений ряда 2-(2-((2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1(2H)-ил)метил)фенокси)-N-фенилацетамидов, 2-(3-бензил-2,6-диоксо-3,6-дигид-ропиримидин-1(2H)-ил)-N-фенилацетамидов, 1-(3-бензоилбензил)пиримидин-2,4(1H,3H)-дионов, 2-(3-бензил-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1(2H)-ил)-N-фенилацетамидов, 3-бензил-1-циннамилпиримидин-2,4(1H,3H)-дионов, 2-(3-бензил-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил)-N-(4-феноксифенил)ацет-амидов, 2-(3-(-(4-бромофенокси)алкил)-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамидов.
-
Некоторые 2-(3-бензил-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1(2H)-ил)-N-фенилацетамиды проявляют выраженную анти-ВИЧ-1 активность.
-
Некоторые 3-бензил-1-циннамилпиримидин-2,4(1H,3H)-дионы проявляют выраженную активность как в отношении ВИЧ-1, так и в отношении ЦМВ.
-
Некоторые 2-(3-(-(4-бромофенокси)алкил)-2,6-диоксо-3,6-дигидро-пиримидин-1(2H)-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамиды имеют широкий спектр противовирусной активности и блокируют репликацию ВГС, ЦМВ, ВЗВ и РСВ в микро- и наномолярном диапазоне.
Достоверность научных положений. Строение и чистота соединений, обсуждаемых в диссертационной работе, подтверждены данными 1Н ЯМР, 13С ЯМР, масс-спектрометрией высокого разрешения. Использованы современные системы сбора и обработки научно-технической информации: электронные базы данных Reaxys (Elsevier), SciFinder (Chemical Abstracts Service) и Web of Science (Thomson Reuters), а также полные тексты статей и книг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ: 11 статей, в том числе 7 в изданиях из перечня ВАК, включая Химико-фармацевтический журнал (Фолиум), Bioorganic & Medicinal Chemistry (Elsevier), Tetrahedron Letters (Elsevier), MedChemComm (Royal Society of Chemistry), Synthesis (Thieme), и 3 тезиса докладов.
Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на IV
Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с
международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012 г.), V Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых с международным участием «Геномные и протеомные технологии при создании новых лекарственных средств» (Волгоград, 2013 г.), Международном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ FEBS «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 2013 г.), ежегодных научных конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2013-2015 гг.).
Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен на 134 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал проиллюстрирован 18 таблицами и 23 рисунками. Список литературы включает 165 наименований.
Природа вирусов. Вирус иммунодефицита человека
Бислойная мембрана суперкапсида имеет клеточное происхождение и включает в себя приблизительно 72 молекулы гликопротеинового комплекса Env, состоящего из доменов gp120 и gp41, а также некоторое количество белков клеточного происождения.8 Капсид ВИЧ образован рядом белков: MA, или p17 – матричный белок – формирует оболочку капсида, непосредственно ассоциированную с внутренней поверхностью суперкапсида через N-концевой фрагмент;9 CA, или p24 – капсидный белок – формирует гексамерные кольца, составляющие основу капсида;10 NC, или p7 – нуклеокапсидный белок – задействован в формировании и стабилизации генома ВИЧ и нуклеокапсида;11 p6 – домен белка p55 – необходим на последней стадии сборки вирусных частиц, их эффективного высвобождения из материнской клетки и встраивания белка Vpr в зрелый вирион.12 Капсид является вместилищем вирусного генома и ферментов: вирусной протеазы, обратной транскриптазы и интегразы, а также некоторых клеточных факторов.13,14 Геном вириона представлен димерами идентичных одноцепочечных молекул РНК, в то время как для персистирующей формы ВИЧ это двухцепочечная провирусная ДНК, встроенная в генетический аппарат инфицированных клеток.
Инфекционный процесс инициируется прикреплением вириона к клеточной поверхности, что опосредуется взаимодействием экстрацеллюлярного домена вирусного гликопротеина gp120 и рецепторов клетки (Рисунок 2).15 CD4 является главным рецептором для ВИЧ-1 и ВИЧ-2, а рецепторы хемокинов CCR5 и CXCR4 – главными сорецепторам.16 После связывания с сорецептором происходит слияние вирусной и клеточной мембран и выход нуклеокапсида ВИЧ в цитоплазму клетки. В стадии раздевания вируса участвуют клеточные факторы и вирусные белки MA, Nef и Vif. Затем вирусная РНК транскрибируется в двуцепочечную молекулу ДНК под действием обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ.17 Функционирование ОТ находится под влиянием клеточного протеина APOBEC3G (или CEM15).18,19
ОТ обладает двумя видами ферментативной активности: ДНК полимеразной, которая позволяет копировать как ДНК, так и РНК-матрицы, и РНКазной Н, которая гидролизует РНК только когда она является частью дуплекса РНК-ДНК. Две ферментативные функции ОТ, полимеразная и РНКазная Н, взаимодействуют, чтобы преобразовать одноцепочечную РНК в двухцепочечную линейную ДНК. Это преобразование происходит в цитоплазме инфицированной клетки. После завершения синтеза вирусная ДНК перемещается в ядро, где встраивается в геном клетки-хозяина интегразой ВИЧ. Эта встроенная копия ДНК, называемая провирус, является источником как вирусных геномных, так и матричных РНК, которые синтезируются клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Хотя другие вирусные белки (в частности, нуклеокапсидные шапероны, и, возможно, интеграза) и некоторые клеточные факторы содействуют функционированию ОТ, она содержит все необходимые ферментативные активности для конвертации вирусного генома. Рисунок 2. Схема цикла репликации ВИЧ
На следующем этапе содержащий провирусную ДНК комплекс под контролем белка Vpr мигрирует в кариоплазму через поры ядерной мембраны.20 До этапа интеграции вирусная ДНК существует в ядре клетки в трех формах: линейной и кольцевых 1-LTR и 2-LTR.9 Протеины Nef, Tat и Rev в основном продуцируются из этих форм ДНК посредством активации промоторов LTR клеточными факторами, такими как NF-B.21 Линейная форма двуцепочечной ДНК встраивается в хромосому хозяина вирусной интегразой.22,23 После этого начинается транскрипция генов ВИЧ клеточной полимеразой II типа под контролем регуляторного протеина Tat.17 Протеин Rev защищает синтезированные молекулы мРНК от сплайсинга клеточными ферментами и стимулирует их транспорт к полисомам цитоплазмы.24 Первичными продуктами трансляции являются полипептиды gp160, Gag (p55) и Gag-Pol. Продуктами протеолиза Gag являются шесть структурных протеинов. Gag-Pol дополнительно включает ферментные полипептиды. После миграции вирусных белков к клеточной мембране начинается процесс сборки дочерних вирионов.25 В формирующийся капсид включаются вирусные ферменты, геномные молекулы РНК, клеточный тРНК-праймер.26
Механизмы ингибирования обратной транскриптазы ВИЧ
Синтетический подход к получению целевых соединений ряда представлен на Схема 6. Первый набор производных характеризуется модификациями, сосредоточенными в левом ароматическом кольце. Исходя из коммерчески доступных фенолов, по известным методикам были получены бромиды 18а-е.117118 Модифицированная силильная реакция Гилберта-Джонсона, т.е. конденсация эквимолярных количеств 2,4-бис(триметилсилил)пиримидина119 с бромидами 18а-е, проводилась при 160-170 С в отсутствие растворителя120 с получением целевых соединений 19а-е, выход которых составил 76-88% (Таблица 6).
Вторая серия аналогов содержит модифицированный линкер, соединяющий левое ядро с остатком урацила (Таблица 7). Соединения 201 и 20i-k, имеющие 2, 4, 6 и 8 метиленовых групп, соответственно, были получены аналогично соединениям 20а-е. Синтез производных 20f-h потребовал применения различных подходов. Так, катализируемое купратом лития сочетание фенилмагний бромида с избытком 1,6-дибромгексана в абсолютном ТГФ121 использовалось для получения бромида 21 (Схема 7), который далее конденсировался с 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидином (3а) с получением соединения 19f, однако с неожиданно низким выходом (30%). Одним из объяснений может служить отсутствие анхимерного содействия со стороны атома кислорода, которое, скорее всего, имеет место в случае бромидов 18a-e.122–124
Хлорметиловый эфир 23 синтезировался по классическому методу Генри.125 Будучи более реакционноспособным, чем бромиды 18a-e и 21, он конденсируется с 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинами в 1,2-дихлорэтане при комнатной температуре.126 В ходе реакции Гилберта-Джонсона образуется триметилсилилбромид, способный расщеплять простые диалкиловые эфиры при повышенной температуре.127 По этой причине, для получения соединения 20h мы выбрали алкилирование урацила в присутствии карбоната калия тозилатом 24, который был получен с помощью синтеза Вильямсона между 1,4-бутандиолом и 4 -бромбензилбромидом128 с последующей конденсацией с 4-толуолсульфонил-хлоридом в присутствии пиридина.
Этилацетат-ДХЭ, 1:1. Третья серия модификаций сосредоточена в боковой ацетамидной цепи (Таблица 9). Обработка калиевых солей производных урацила 19a-h 2-хлорацетамидами 9f-h в ДМФА позволила получить целевые соединения 20 с хорошими выходами. Чтобы избежать возможного замещения иода в производном 20т в качестве основания был успешно применен гидрид натрия.129
Получение производного бензофенона 20q потребовало другого синтетического подхода. Во-первых, исходя из 19с, был получен эфир 25. (Схема 8). Последующий гидролиз до кислоты и обработка ее хлорангидрида N-триметилсилил производным 4-(бензоил)анилина в соответсвии с ранее опубликованной методикой130 дала целевой аналог 20q. Формирование амидной связи в отсутствии основания позволило избежать образования побочных продуктов, возникающих вследствие конденсации Кневенагеля между карбонилом бензофенона и СН-кислотным метиленом остатка уксусной кислоты.128
Синтез 1-(3-бензоилбензил)урацилов Синтез целевых структур заключался в двух основных стадиях: синтезе замещенных 3-метилбензофенонов и их введении по атому азота соответствующего гетероцикла. Бензофеноны 27а-f были получены сочетанием N-метокси-N-метиламидов (амидов Вейнреба) с мета-толилмагния бромидом (Схема 9). Оригинальная методика была впервые описана Nahm и Weinreb.131 В отличие от других многочисленных методов синтеза кетонов, исходящих из металлоорганических реагентов,132 этот способ не требует катализа переходными металлами. Кроме того, он исключает присоединение реактива Гриньяра к целевому кетону и образование побочных третичных спиртов.
Реагенты и условия: a) SOCl2, ДХЭ, 85 C; b) NHMe(OMe)HCl, K2CO3, PhMe-H2O, 22 C; c) m-MeC6H4MgBr, THF, -5 C; d) Br2, CCl4, 77 C; e) 2,4-бис(триметилсилилокси)-5-R2-пиримидин, ДХЭ, 85 C; f) Br2, NaOAc, AcOH, 60 C; g) Me2SO4, K2CO3, Me2CO, 22 C. Карбонильные группы исходных бензойных кислот были активированы превращением в соответствующие хлорангидриды, которые легко образовывали амиды Вейнреба 26a-f при обработке N,O-диметилгидроксиламина гидрохлоридом в условиях межфазного катализа (K2CO3, вода-толуол 1:1). Последующее сочетание с мета-толилмагния бромидом было успешно выполнено в абсолютном ТГФ при –5 С в атмосфере аргона. Оригинальная методика предписывает использовать 3 эквивалента реактива Гриньяра для реакции с 1 эквивалентом амида. Чтобы выяснить необходимость этого условия, мы провели ряд экспериментов (Таблица 10). Результаты показали, что избыток металлоорганического реагента действительно ведет к увеличению выхода кетона, однако он становится количественный уже при 1,5-кратном избытке. Следует отметить, что сниженный выход 27е, вероятно, обусловлен добавлением реактива Гриньяра к циано-группе.
Синтез 2-[1-(-феноксиалкил)урацил-3-ил]-N-(4-феноксифенил)ацетами дов
Аналогичный метод142 был использован для синтеза 1-[3-(3,5 дихлорбензоил)бензил]урацила 29т и производного гидантоина 29п (Схема 11). Бензилоксиметильная (ВОМ) защитная группа гладко снималась при кипячении с обратным холодильником в смеси хлористоводородной кислоты и этанола.143 Свойства целевых соединений ряда собраны в Таблице 12. сі В работе использовались коммерчески доступные реагенты высшей степени очистки производства Sigma-Aldrich и Acros Organics. Безводный ацетон, ДХЭ и EtOAc были получены путем перегонки над P205. Спектры 1Н и 13С ЯМР регистрировали на приборе Bruker Avance 400 (400 или 600 МГц для 1Н и 100 или 150 МГц для 13С, соответственно) в ДМСОd или CDC13 с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта. ТСХ проводили на пластинах с закрепленным слоем силикагеля Merck TLC Silicagel 60 F254, проявляли УФ-лампой VL-6.LC (Франция). Для колоночной хроматографии использовали силикагель Kieselguhr 60-200 мкм, 60 (Acros Organics, Бельгия). Точки плавления определяли в стеклянных капиллярах на приборе Melemp 3.0 (Laboratory Devices Inc., США). Выходы относятся к спектрально однородным веществам ( Н и 13С ЯМР). Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на приборе Bruker micrOTOF II методом электрораспылительной ионизации (HRESIMS). Измерения проводили в режиме положительных ионов (поверхностное капиллярное напряжение -4500 В) в диапазоне масс от m/z 50 до m/z 3000 Да; внешняя и внутренняя калибровка была выполнена с помощью ESI Tuning Mix (Agilent Technologies). Использовался шприцевой ввод вещества для растворов в ацетонитриле, скорость потока 3 мкл/мин, газ-распылитель - сухой азот, температура интерфейса 180 С.
Безводный K2С03 (20.1 г, 145.36 ммоль) добавляли к раствору 2-метилфенола (10.0 мл, 96.91 ммоль) в 70 мл ацетона с последующим прибавлением этилбромацетата (11.80 мл, 106.60 ммоль). Полученную суспензию нагревали с обратным холодильником в течение 24 ч., фильтровали и упаривали при пониженном давлении. Остаток растворяли в 40 мл CHCl3, промывали 5% раствором NaOH (2 х 50 мл), затем водой. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали вакуумной перегонкой. Выход 14.33 г (76%); бесцветное масло; Т.кип. 125-128 C (5 мм рт. ст.). Смесь продукта 1 (14.33 г, 73.78 ммоль) и TV-бромсукцинимида (13.80 г, 77.53 ммоль) в 100 мл CCl4 нагревали с обратным холодильником при облучении 100 Вт лампой накаливания в течение 4 ч., охлаждали до комнатной температуры, фильтровали и упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали вакуумной перегонкой. Выход 18.10 г (90%), бледно-желтое масло; т.кип. 145-148 C (5 мм рт. ст.).
Смесь пиримидинового основания (урацила, тимина, 5-фторурацила, 5-хлорурацила, цитозина) и хлорида аммония (0.30 г, 5.60 ммоль) в ГМДС (15 мл) нагревали с обратным холодильником, снабженным осушающей трубкой, до получения прозрачного раствора. Избыток силилирующего агента удаляли при пониженном давлении. Полученные в виде бесцветного масла продукты использовали в последующих синтезах без дополнительной очистки.
Соответствующий 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидин За-d (53.53 ммоль) растворяли в 100 мл безводного 1,2-дихлорэтана и добавляли бромид 2 (14.62 г, 53.53 ммоль). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником, снабженным осушающей трубкой, в течение 20 ч., охлаждали до комнатной температуры и медленно добавляли 15 мл /-РЮН. Полученный осадок фильтровали и очищали с помощью флэш-хроматографии (элюент - смесь ЕЮН-ДХЭ, 1:10).
Синтез 2-(1-бензил-урацил-3-ил)-N-(4-феноксифенил)ацетамидов
Природа линкерного фрагмента Х оказывает наиболее выраженный эффект на биологические свойства данных производных. Замена атома кислорода в составе мостика на метилен (20f) не оказала существенного влияния, в то время как введение дополнительного атома кислорода (20g) производит выраженный негативный эффект, как и введение 2-(4-фенилфенокси)этильного фрагмента (20l). Самые интересные результаты были получены при увеличении длины метиленовой цепочки. Соединения 20k и 20j, содержащие шесть и восемь метиленов соответственно, активнее пятиметиленового аналога 20с в 34 и 13 раз. Также, они показали лучший индекс селективности среди остальных соединений серии.
Алкильные заместители в ядре урацила практически не влияли на уровень цитотоксичности, однако оказывали положительный эффект на активность. Например, производное 5-метил-6-этилурацила 20о характеризуется величиной IC50 в 20 раз меньше незамещенного по урацилу аналога 20g.
Изучение влияния природы линкерного фрагмента Y показало, что оптимальные вирус-ингибиторные свойства обеспечивает метиленовая группа (20p). Она обеспечивает лучшие показатели активности и селективности действия по сравнению с атомом кислорода (20c), карбонильной (20q) и оксиметиленовой группой (20u).
Введение пара-заместителей в ядро R3 также имело благоприятный эффект. Атом хлора увеличивает активность в 6 раз (20r), метильная группа – в 10 раз, однако при этом отмечается двухкратное увеличение цитотоксичности (20t). Метилирование атома азота ацетанилидной цепи увеличивает противовирусную активность, но в тоже время ведет к резкому падению селективности (20v), что ограничивает дальнейшие модификации в этом направлении.
Целевые соединения также оценивались как ингибиторы репликации ЦМВ, ВЗВ, ВПГ-1 и ВПГ-2 в культурах клеток HEL. Результаты приведены в Таблице 21Таблица 21. Для большинства синтезированных соединений отмечена существенная противовирусная анти-ЦМВ и анти-ВЗВ активность. В тоже время, они неактивны в отношении ВПГ-1 и ВПГ-2. Это несколько удивительно, так как практически все анти-герпес препараты, ингибирующие вирусную ДНК-полимеразу, обладают широким спектром активности против различных типов герпесвирусов.160–164 Поэтому механизм действия данных соединений остается неясным и требует тщательного изучения.
Исследования показали, что характер заместителя R1 влияет на противовирусную активность в значительной степени: 20а (R1 = H) 20b (R1 = 3-Br) 20e (R1 = 4-фенил) 20d (R1 = 4-CN) 20c (R1 = 4-Br). Таким образом, соединение 20c показало самые низкие значения EC50 (0.40 и 0.30 мкМ на штаммах AD-169 и Davis, соответственно) и рассматривалось как исходное для дальнейших модификаций.
Природа линкерного фрагмента X, соединяющего урацил и бензольное ядро, влияет на анти-ЦМВ активность наиболее выраженным образом. Его удлинение от 4 до 8 метиленовых групп последовательно снижает значения EC50, что демонстрируют следующие соединения: 20i (X = O(CH2)4) 20c (X = O(CH2)5) 20j (X = O(CH2)6) 20k (X = O(CH2)8). В частности, введение четырех дополнительных метиленовых звеньев повышает активность 20k в 51-56 раз по сравнению с 20i в зависимости от штамма вируса. Однако обращает на себя внимание сопутствующее увеличение цитотоксичности.
Замена атома кислорода на метилен (20f) приводит к потере активности, что указывает на важную роль эфирной группы в данном фрагменте молекулы. Сдвиг кислорода от ароматического фрагмента снижает активность в 3 раза (20h по сравнению с 20c). Введение дополнительного атома кислорода полностью лишает соединение 20g активности. Таким образом, алкоксифенильная боковая цепь является оптимальной для проявления вирус-ингибиторных свойств.
Ограниченные модификации урацильного фрагмента позволили получить ценные данные. Так, защитный эффект производного тимина 20n оказался в 3 раза ниже по сравнению с исходным 20c, однако, при этом оно обладает значительно меньшей цитотоксичностью. Замена H5 урацила на атом иода делает соединение 20m полностью неактивным.
Далее были изучены модификации в ацетанилидной боковой цепи. Исследования роли линкера между ароматическими остатками определило, что атом кислорода обеспечивает оптимальное соотношение активности и цитотоксичности. Метиленовый аналог сохраняет уровень активности, но является более токсичным (20p), а карбонильный (20q) или ОСН2 (20u) значительно менее активны. N-Метилирование также неблагоприятно: соединение 20v в 4 раза менее активно, чем исходное 20c.
Аналогичная взаимосвязь «структура-активность» наблюдается для анти-ВЗВ свойств. 4-Бром замещенное соединение 20c блокирует репликацию ВЗВ на уровне 1.14 мкМ (штамм ОКА), что сравнимо с ацикловиром, использованным в качестве стандарта. В то же время, дефицитный по тимидинкиназе штамм 07-1 также чувствителен к 20c. Таким образом, данные соединения действуют как ненуклеозидные ингибиторы.165 Другие заместители в R1 привели к неактивным соединениям 20а, 20b, 20d и 20е.
Как было описано выше для ингибирования ЦМВ, удлинение линкерного фрагмента у N1 имеет выраженный положительный эффект и на анти-ВЗВ свойства. Соединение 20k, содержащее 8 метиленовых групп, является наиболее активным с ЕС50 0.084 мкМ и 0.16 мкМ для ОКА и 07-1 штаммов, соответственно. Повышение активности отмечено более высокой цитотоксичностью для производных 20j и 20k.
Кроме того, для некоторых соединений ряда В4 была отмечена активность относительно репликации респираторно-синцитиального вируса (РСВ), сравнимая с препаратом сравнения рибавирином (Таблица 22). Наибольшей ингибиторной способностью обладают феноксипентильные производные, содержащие в качестве заместителя R1 4-фенил (20e) или 4-циано-группу (20d). Несколько меньшую активность проявили производные 5-иодурацила (20m), тимина (20n) и 5-метил-6-этилурацила (20o).