Введение к работе
Актуальность проблемы.
Свойства вируса гриппа, такие как способность его к персис-тенции в зараженном организме, к инфицированию клеток иммунной системы и трансплацентарной передаче с Формированием, врожденной медленной инфекции с летальным исходом заставляют более пристально изучать патогенетические механизмы вызываемых вирусом процессов. Ухудшение экологической обстановки и, как следствие, снижение общего иммунитета человека приводит к тому, что многие вирусные заболевания, в том числе и грипп, переходят в хроническую Форму с проявлением новых, нехарактерных для исходных штаммов свойств.
Изучение процессов, протекающих в зараженном вирусом организме, позволило обнаружить специфические для гриппозной инфекции черты. Характерным ее свойством является формирование на острой стадии деструктивно-геморрагического синдрома, т. е. массовой гибели эпителиальных клеток на Фоне ярко выраженной зритоци-тарной экссудации. Никакая другая респираторная вирусная инфекция С аденовирусная, парагриппозная, PC-вирусная) не приводит к этим процессам.
Отдельного рассмотрения заслуживает ироническая гриппозная инфекция, приводящая к формированию в легких людей и лабораторных животных характерной патогистологической картины. Клетки бронхиолярного эпителия - первичные клетки-мишени для вируса гриппа - погибшие в период острой инфекции, начинают замещаться новыми пролиферирушими клетками, однако процесс регенерации не останавливается на стадии реснитчатого эпителия, а приводит к формированию многослойного эпителия и снижению степени дифферен-цировкм клеток (метаплазии). Эти процессы в сочетании с обильной инфильтрацией ткани лимфоидныш клетками приводят к выключению целых областей и долей легкого из нормального процесса дыхания, вызывают хронические пневмонии смешанной этиологии и приводит к легочной недостаточности.
Ранее в нашей лаборатории были получены данные о корреляции между тяжестью протекания гриппа у лабораторных животных в острой фазе С определяемой по проценту смертности) и процентом животных, у которых на стадии хронической инфекции развивались аде-номатозные разрастания. Такая корреляция была показана для разных штаммов вируса гриппа с различной патогенностью для мышей.
что делало необходимым определить, не зависит ли развитие разрастаний от первичного повреждения клеток, а не от непосредственно вирусного присутствия на поздних сроках заболевания (персистен-ции).'
В литературе имеются сведения о том, что гриппозная инфекция у лабораторных живоных в острой Фазе сопровождается резким повышением протеолитической активности в легочной ткани и сыворотке крови. Применение ингибиторов протеаз в значительной мере облегчает течение заболевания и повышает процент выживаемости животных. Геморрагический отек легких обуславливается повышением проницаемости сосудов пои инфекции, процессом, в котором протеа-зы также играют важную роль С Чернух A.M.). В связи с этим актуальной задачей является выяснение роли в патологическом процессе при гриппозной инфекции отдельно протеолитмческих Ферментов и отдельно - вируса. Решение поставленной проблемы требует, с одной стороны, разработки системы контроля, позволящей отделить специфические для вируса изменения в легких от изменений неспецифических, и с другой стороны - применения чувствительного метода выявления вируса в структуре ткани для определения его локализации.
Выявлению вируса гриппа в ткани посвящено большое количество работ. Проанализировав сушествушие методы индикации возбудителя, мы'установили, что ни одна из методик, где используются тканевый гомогенат или выделенная и очищенная РНК, не могут способствовать решению поставленной задачи, поскольку исключают соотнесение вирусспециФического сигнала с теми или иными тканевыми структурами. В этом смысле речь может идти лишь о методах иммуногистохимии, гибридизации in situ и недавно разработанном методе транскрипции in situ. Авторами метод транскрипции in situ был использован для выявления мРНК одного из гормонов гипофиза. В вирусологии этот метод ранее применен не был. Способность вируса гриппа к Формированию абортивной инфекции без продукции вирусных белков делает нецелесообразным применение иммунологических методик, а малое количество копий генома, наблюдаемое при персистен-тной инфекции и лежащее ниже порога чувствительности гибридизации in situ приводит к неоднозначным результатам при использовании этого метода.
Достоинства метода транскрипции in situ заключаются в том, что зонд, полученный в ходе полимеразной реакции, отличается очень высокой удельной активностью, что позволяет значительно по-
- 5 -высить чувствительность и разрешающую способность метода и снизить время экспозиции гисторадиоавтографов.
Из сказанного следует, что исследования в двух направлениях - отдаленные последствия неспецифической деструкции клеток бронхиального эпителия и выявление вируса гриппа в ткани и определение его локализации - является актуальной проблемой, поскольку позволяет определить взаимоотношения двух процессов - метаплазии эпителиальной ткани и персистенции вируса гриппа на поздних сроках инфекции, а также может служить основанием для разработки комбинированных методов терапии отдаленных последствий при гриппе.
Цели и задачи исследования.
Для выполнения работы были сформулированы следующие цели.
-
Выяснить, существуют ли морфологические признаки экспериментальной гриппозной инфекции, не являющиеся результатом неспецифического разрушения эпителиальных клеток.
-
Провести сопоставление метода транскрипции in situ с методами иммуногистохимии и гибридизации in situ и определить границы его применимости в вирусологии.
-
Определить тканевую и клеточную локализацию вируса гриппа в легких инфицированных животных на стадии хронической гриппозной инфекции.
В соответствии с целями для проведения исследования были поставлены следующие задачи.
-
Разработать модель хронической пневмонии под воздействием протеолитических ферментов.
-
Провести морфологическое исследование патологического процесса и сопоставить его характеристики с таковыми при персис-гентной гриппозной инфекции.
-
Провести выявление вирусспецифических РНК на различных стадиях гриппозной инфекции при помощи гибридизации на Фильтрах СNothern-блоттинг).
-
Исследовать динамику распространения вируса гриппа в хо-це экспериментальной инфекции при помопш иммуногистохимического метода с использованием поликлональных антител.
-
Провести выявление РНК вируса гриппа на гистологических срезах при помощи метода транскрипции in situ на различных еросах инфекции,включая хроническую стадию.
-
Сопоставить данные по локализации и динамике распростра-
нения метки, полученные в ходе ишуногистохимического анализа и анализа при помощи транскрипции in situ.
Научная новизна работы.
-
Впервые установлено, что закономерности течения патологических процессов при гриппозной инфекции и неспецифической деструкции эпителия протеолитическими ферментами являются одинаковыми для всех сроков эксперимента вплоть до хронических последствий, что ставит под сомнение способность вируса гриппа как внутриклеточного паразита стимулировать разрастания бронхиолярно-го эпителия на стадии персистентной гриппозной инфекции и доказывает ведущую роль неспецифических разрушений легочной ткани в индукции этого процеса.
-
Впервые метод транскрипции in situ применен для исследования вирусной инфекции. Показано, что этот метод может быть использован для обнаружения вирусного присутствия в организме, причем предварительный шаг гибридизации исследуемого препарата с оли-гонуклеотидным праймесом может быть исключен из процедуры анализа.
-
При помощи метода транскрипции in situ показано, что на стадии хронической гриппозной инфекции вирус находится исключительно в клетках иммунной системы - лимфоцитах, макрофагах и ней-троФилах, находящихся в пределах аденоматозных структур и не проявляет тропизма к клеткам пролиферируюцего эпителия.
Научно-практическая значимость работы.
В результате проведенных исследований разработана и охарактеризована модель хронической пневмонии на основе введения в легкие экспериментальных животных протеолитических ферментов.
Впервые метод транскрипции in situ использован для диагностики вирусной инфекции, и показана его высокая чувствительность и разрешающая способность в отношении морфологической индикации вирусов. Показано, что исключение из методики этапа гибридизации с праймером не влияет на результат исследования, что позволяет рассматривать это как модификацию процедуры, значительно упрощакщую и удешевляющую проведение анализа.
Основные положения, выносимыв на защиту.
-
Неспецифическая деструкция бронхиолярного эпителия ПРО-теолитическими Ферментами приводит к развитию хронической пневмонии, сохраняющейся в течение 3 месяцев со дня обработки без признаков регрессии.
-
Патологические процеси, вызванные интраназалъным введением лротеолитических Ферментов и заражением вирусом гриппа являются сходными по целому ряду морфологических характеристик.
-
Методы гибридизации РНК-ДНК на фильтрах не позволяют обнаружить РНК вируса гриппа на стадии хронической инфекции.
-
Метод транскрипции in situ является чувствительным методом для выявления в исследуемом органе вирусного присутствия, но не может быть использован для дифференцировки самих вирусов.
-
На стадии хронической гриппозной инфекции вирус гриппа локализован в иммунокомпетентных клетках в пределах аденоматоз-ных разрастаний и не проявляет тропизма к клеткам.пролиферирукще-го эпителия.
-
Ведущую роль в генезе патологических разрастаний в легких на стадии хронической гриппозной инфекции играет не вирус гриппа как внутиклеточный паразит, а вызываемое им повреждение слоя клеток бронхиального эпителия и последующая лимфоидная инфильтрация пораженной ткани.
Апробация работы.
Материалы по теме диссертации доложены на конференции молодых ученых с участием специалистов из Университета Невада-Рино (1991), а также на заседании ученого совета института (1993).
Публикации по теме.
По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Объем и структура диссертации.