Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы .13
1.1. Общие сведения о гене сестрине 13
1.2. Сигнальные пути сестринов .14
1.3. Молекулярные механизмы старения .19
1.4. Роль TOR в старении 22
1.5. Нематода C.elegans как модельный организм 24
2. Материалы и методы 29
2.1. Штаммы, использованные в исследовании 29
2.2. Реактивы, наборы реактивов 31
2.3. Культурирование нематод на чашках Петри 33
2.4. Приготовление синхронизированной культуры нематод .34
2.5. Выделение тотальной РНК из нематод 34
2.6. Обработка РНК, выделенной из нематод, дезоксирибонуклеазой I 36
2.7. Обратная транскрипция .36
2.8. Амплификация кДНК генов нематоды при помощи ПЦР .37
2.9. РНК-интерферирующие генетические конструкции .38
2.10. Горизонтальный гель-электрофорез ДНК .41
2.11.Генетическая конструкция для восстановления генотипа дикого типа сестрина нематоды 41
2.12. РНК-интерференция с помощью бактерий 42
2.13. ПЦР в режиме реального времени .42
2.14. Измерение продолжительности жизни при РНК интерференции гена cSESN, при отсутствии пищи .44
2.15. Исследование аутофагии с помощью флуоресцентного микроскопа 45
2.16. Измерение продолжительности жизни в среде М9 45
2.17. Измерение продолжительности жизни при воздействии параквата и перекиси водорода .45
2.18. Исследование образования дауэровских личинок с помощью лаурилсульфата натрия .46
2.19. Денатурирующий ПААГ элегтрофорез .46
2.20. Иммуноблоттинг 49
2.21. Исследование глоточной области нематод с помощью электронного микроскопа 49
2.22. Исследование мышечной дегенерации с помощью флуоресцентного микроскопа 51
2.23. Измерение продолжительности жизни под действием различных концентраций торина 2 и рапамицина .51
2.24. Измерение продолжительности жизни нематод разных возрастов под действием торина 2 в концентрации 25нМоль/мл 51
2.25. Исследование воздействия на онтогенез торина 2 и рапамицина 52
2.26. Трансформирование нематод с помощью микроиньекций в яичники .52
2.27. Скрещивание штаммов нематод .52
2.28. Исследование сигнальных путей образования дауэровских личинок .54
2.29. Статистическая обработка данных 54
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Влияние сестрина на размеры нематоды 55
3.2. Роль гена сестрина в устойчивости нематоды к различным стрессам 56
3.3. Роль гена сестрина в образовании устойчивых к стрессам дауэровских личинок 59
3.4. Роль гена сестрина в гомеостазе мышц 61
3.5. Влияние сестрина на продолжительность жизни нематоды .63
3.6. Роль гена сестрина в регуляции аутофагии 64
3.7. Воздействие торина 2 и рапамицина на продолжительность жизни нематоды 68
3.8. Воздействие торина 2 и рапамицина на аутофагию .68
3.9. Воздействие торина 2 на продолжительность жизни нематод разных возрастов 72
3.10. Воздействие торина 2 и рапамицина на онтогенез .77
Заключение .81
Выводы 82
Благодарности .83
Список литературы 84
Приложение .103
- Сигнальные пути сестринов
- Нематода C.elegans как модельный организм
- Роль гена сестрина в регуляции аутофагии
- Воздействие торина 2 на продолжительность жизни нематод разных возрастов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Старение организма, как биологический феномен,
является одним из центральных объектов исследования биологической науки. Раскрытие причин и механизмов процессов возрастного угасания функций организма важно не только в плане возможного увеличения продолжительности жизни, но и для борьбы с многочисленными болезнями позднего возраста. У человека процесс старения особенно явно начинает проявляться через 25-30 лет после достижения детородного возраста, т. е. по завершении необходимого репродуктивного периода. Старение характеризуется постепенным комплексным угасанием физиологических функций организма, ослаблением устойчивости к нагрузкам и стрессам. На уровне тканей происходит замещение специфических для тканей активных клеточных компонентов соединительной тканью, появлением признаков хронического воспалительного процесса, повышенным уровнем соединений активного кислорода, которые повышают мутагенную нагрузку и истощают регенеративный потенциал тканей. На этом фоне существенно повышаются риски развития многих патологий позднего возраста, к которым относятся метаболические расстройства (ожирение, диабет), нейродегенеративные, сердечно-сосудистые и онкологические заболевания. На молекулярном и клеточном уровне происходит накопление не утилилизированных белковых агрегатов, укорочение теломер, изменение эпигенетического статуса многих генов, ослабление контроля тканеспецифической экспрессии генов, нарушения функционирования компонентов врожденного и адаптивного иммунитета. Все эти изменения являются следствием нарушений процесса гомеостаза, поддержания физиологического баланса процессов, необходимого для стабильного функционирования всех систем организма.
Существуют разные мнения по поводу биологического значения этого процесса, является ли старение специальной программой, или результатом хаотического процесса "доживания". Тем не менее, понимание природы процессов, лежащих в основе старения может позволить разработать комплекс мер, направленных на максимальное преодоление негативных проявлений, создающих почву для развития патологий, увеличить качество жизни пожилых людей, продлить период здоровой старости и увеличить как среднюю, так и максимальную продолжительность жизни.
В последние годы, благодаря революционным открытиям в области наук о жизни, наметился
существенный прогресс в понимании механизмов, лежащих в основе процесса старения. Если
раньше старение представлялось как следствие накопления молекулярных повреждений, вызванных
длительными воздействиями неблагоприятных условий среды, то теперь ведущую роль отдается
возрастному ослаблению процессов репарации клеток и тканей, центральным компонентов которых
является аутофагия. Углубленное изучение процесса аутофагии открыло новые горизонты для
понимания механизмов регуляции метаболических процессов, их изменения при патологиях и
старении. Благодаря высокой консервативности этих механизмов их исследования проводятся на
многих животных моделях, от дрожжей до млекопитающих и человека. Было установлено, что
главенствующую роль в продвижении процессов старения играет нарушение баланса
метаболических процессов, приводящее к все возрастающей активности сигнального пути IGF/Akt и
mTOR. Этот процесс существенно тормозится при ограничении питательных веществ, приводя к
активации аутофагии и существенному омоложению соматических клеток и тканей. Относительно
недавно стало известно что семейство р53 и FOXO- регулируемых генов сестринов является
регулятором множества процессов связанных со старением. Сестрины действуют как
антиоксиданты в сигнальных сетях опухолевого супрессора р53, и как потенциальные индукторы катаболических процессов, они регулируют активность mTORкиназного комплекса 1 (TORC1) через три независимых пути - опосредуя присоединение и активацию AMPK к TSC, подавляя сигнальную ветвь TGFb-Akt, и выступая в качестве биологического сенсора уровня аминокислот, за счет связывания лейцина с специфическим участком молекулы сестрина, приводящего к конформационным перестройкам ведущим к включению системы активации киназыmTOR через ее транслокацию в места сборки активного киназного комплекса в лизосомах. Таким образом сестрины являются универсальными ингибиторами сигнального пути mTOR, а их изучение исключительно важно для понимания процессов старения и разработке средств как для замедления этого процесса,
так и для профилактики болезней позднего возраста.
Следует отметить, что ген сестрина 2 человека, являющийся по-видимому наиболее
значимым представителем семейства, впервые был описан российскими исследователями,
работающими в ИМБ РАН. Сестрины являются сильными индукторами аутофагии, что делает их
привлекательными в качестве мишеней для создания лекарств. Семейство сестринов весьма
консервативно и присутствует также у беспозвоночных, например у дрозофил и нематод. Эти
модели особенно интересны для изучения функций сестринов не только благодаря своей простоте и
хорошо разработанной генетике. Если у позвоночных семейство сестринов представлено тремя
генами, имеющими похожие функции, то геном нематоды Caenorabditis elegans имеет единичный
ген, что позволяет проводит эксперименты по генному нокауту и изучать соответствующие
фенотипы. В связи с этим в задачи исследования входило всестороннее изучение функции сестрина
нематоды Caenorabditis elegans, их роль в формировании фенотипа, определении
продолжительности жизни, регуляции метаболизма, сопряжении с сигнальными путями, участвующими в процессах старения и развития хронических патологий.
Помимо задач связанных с изучением роли сестринов у нематод в ходе выполнения диссертационной работы были затронуты практически не связанные с данной проблемой вопросы, относящиеся к текущим задачам лаборатории. В рамках отдельной работы, связанной обязательством лаборатории по разработке проекта финансируемого Госконтрактом Министерства образования и науки (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60714X0014), во время выполнения диссертационной работы была проведена оценка динамики онколитического действия вакцинного штамма полиовируса 1 типа на модели подкожных ксенотрансплантатах клеток глиобластомы человека, культивируемых в виде подкожных опухолей на бестимусных мышах. Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось:
-
Описать фенотипы нематод Caenorabditis elegans, имеющих делецию гена сестрина (cSESN), включающие внешние параметры, характер развития, поведения, продолжительности жизни, чувствительности к стрессам, метаболические характеристики. Воспроизвести фенотип отсутствия сестрина путем РНК интерференции, восстановить утраченный делецией гена сестрина фенотип путем трансдукциии в зародышевую линию генетических конструкций для экспрессии сестрина нематоды или сестрина человека.
-
Изучить сигнальные пути, участвующие в образовании дауэрных личинок и их компоненты, повреждаемые при делеции гена сестрина. В частности, определить участие сестрина в сигнальном пути daf2-daf15-daf-16 (эквивалентен сигнальному пути IGF1-Akt-FOXO у человека), сигнальном пути daf-1-daf-4-daf-7-daf-8 и daf-14 (эквивалентен сигнальному пути TGF--Smad) и гуанил-циклазном daf-11 сигнальном пути.
-
Изучить роль сестрина в индукции аутофагии и выживаемости при ограничении калорий. Описать различия в фенотипах связанных с мобилизацией жиров при голодании в зависимости от активности гена сестрина.
-
Изучить роль сестрина в увеличении продолжительности жизни при ограничении питательных веществ и значении сигнального пути TOR в сестрин-зависимом продлении жизни.
-
Провести испытание ингибиторов TOR на модели нематод (рапамицин, торин 2), их способность индуцировать аутофагию, подавлять развитие, увеличивать продолжительность жизни. Сравнить получаемые эффекты с действием сестрина, установить возможность преодоление фенотипов связанных с отсутствием гена сестрина при действии ингибиторов TOR.
-
В рамках отдельной работы провести оценку динамики онколитического действия вакцинного штамма полиовируса 1 типа на модели подкожных ксенотрансплантатах клеток глиобластомы человека, культивируемых в виде подкожных опухолей на бестимусных мышах.
Научно-практическая значимость работы. В ходе работы были получены новые фундаментальные данные как о функции сестрина на модели нематоды C. elegans, так и выяснен ряд вопросов, относящихся к функционированию сигнальных путей, имеющих отношение к процессам аутофагии, регуляции метаболизма, сигналинга факторов роста, устойчивости к стрессам.
Полученные данные о роли гена сестрина нематод в аутофагии, процессе поддержания физиологического состояния клеток и тканей, лежащего в основе процессов репарации клеток и преодоления проявлений старения, позволят использовать модель нематод для поиска потенциальных лекарственных средств для модулирования активности сигнального пути TOR и процесса аутофагии. Такие соединения будут востребованы фармацевтической промышленностью для создания средств борьбы с хроническими заболеваниями позднего возраста, включая диабет, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, идиопатическая эмфизема легких, нейродегенеративных и злокачественных заболеваний.
Фундаментальные сведения об участии сестрина в функционировании ряда сингальных путей имеют самостоятельную научную ценность как новый вклад в изучение процессов адаптации организмов к меняющимся условиям обитания и к ряду стрессов. Эти сведения будут использованы как в дальнейшей работе диссертанта, лаборатории и института, так и другими членами научного сообщества.
В ходе работ был также получены модельные линии опухолевых клеток человека с подавленной экспрессией ряда генов рецепторов проникновения в клетку энтеровирусов человека, которые могут быть использованы для диагностики энтеровирусных инфекций и определения противоопухолевой активности создаваемых новых штаммов онколитических энтеровирусов.
Таким образом, результаты проведенных исследований имеют высокую научную и практическую ценность, вносят вклад в понимание фундаментальных механизмов старения организма и закладывают основу для медикаментозного воздействия.
Методология и методы исследования. В работе были использованы разнообразные современные биологические методы, включающие культивирование нематод на твердом носителе и жидкой среде, подавление экспрессии отдельных генов с помощью РНК интерференции, процедуры скрещивания нематод и выведение гибридного потомства, эпистатический анализ сигнальных путей, поддержание и анализ мутантных штаммов нематод, определение продолжительности жизни, устойчивости к стрессам, описание фенотипов, методы анализа аутофагии с помощью микроскопии, иммуноблоттинг, получение рекомбинантных конструкций, получение трансгенных нематод путем микроинъекции в зародышевую линию, методы работ с культурами клеток, конструирование и введение лентивирусных векторов для подавления активности генов в культуре клеток, анализ экспрессии с помощью ПЦР в реальном времени, анализ экспрессии поверхностных белков с помощью проточной цитометрии, работа с иммунодефицитными мышами, поддержание колонии мышей, введение опухолевых клеток человека и анализ скорости роста опухолей, экспериментальная терапия опухолей с помощью онколитических энтеровирусов.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на 5 международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 108 страницах и включают 14 таблиц и 34 рисунка. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список сокращений», «Список литературы», который содержит 158 ссылок. «Приложение»
С. elegans - нематода Caenorabditiselegans; TOR – Тarget of Rapamycin; ПЦР - полимеразная цепная реакция; БОЕ - бляшко-образующая единица;
Сигнальные пути сестринов
Сестрины снижают уровень внутриклеточных активных форм кислорода, таким образом опосредуя антиоксидантную функцию белка р53, который в значительной мере определяет стабильность генома и устойчивость к раку [7, 11, 12]. Один из механизмов, лежащих в основе этого, является способность сестринов восстанавливать окисленные формы пероксиредоксинов (Prxs), основных пероксидаз клетки, взаимодействующих с перекисью водорода [9]. Сестрины связываются с пероксиредоксинами и сульфоредоксином (Srx) [9], энзимом, восстанавливающим переокисленную неактивную форму пероксиредоксина [13, 14]. Сестрины опосредуют восстановление пероксиредоксинов и усиливают разложение перекиси водорода, сигнальной молекулы во многих клеточных процессах. Такая антиоксидантная активность сестринов может быть объяснена подавлением анаболических процессов [8, 15, 16] и участием в регуляции аутофагии [17].
Сестрины способны напрямую взаимодействовать с ключевым сенсором энергии в клетке - киназой AMPK. Сестрины способны связываться с каталитической субъединицей AMPK, и связывать АМРК с белком TSC2. AMPK затем фосфорилирует TSC2, а он в свою очередь образует активный комплекс с белком TSC1,затем сформировавшийся комплекс подавляет ГТФ связывающий белок Rheb, являющийся активатором комплекса mTORC1 [8, 15, 18, 19]. Отсюда следует что сестрины являются опосредованными регуляторами киназы p70-S6 и способны подавлять CAP-зависимую трансляцию, так как способны подавлять mTORC1 [19-21]. Кроме того , активация сестринами комплекса TSC1/TSC2 ведет к активации комплекса TORC2, и последующей активации киназы Akt [8, 15, 22]. В результате подавления mTORC1 сестрины снимают TOR-опосредованное угнетение аутофагии, являющегося следствием фосфорилирования белка ULK1 [23]. В подтверждение этого оверэкспрессия сестрина 2 активирует аутофагию [17]. Кроме того белок ULK1 и его даунстрим в активации аутофагии регулируются AMPK [24-27].
Сестрины играют роль в регуляции mTORC1 через сигнальный путь TGF [16]. В сигнальном пути TGF подавление mTORC1 является причиной активации Akt [28, 29].
Подавление сестрина 2 приводит к накоплению PDGF рецептора и постоянной активации сигнального пути PDGF [30]. Это наблюдение позволяет предположить, что сестрин2 участвует в какой-то степени в эндоцитозной переработке рецепторов ростовых факторов.
Существует позитивная обратная регуляторная связь между сестринами и транскрипционными факторами семейства FoxO. Транскрипция сестринов регулируется семейством FoxO [15], важного компонента IGF1/Akt/mTOR/AMPK/ сигнального пути. Дополнительно к этому семейство FoxO регулируется AMPK [31-33].
Судя по всему, сестрины участвуют во многих важных гомеостатических сигнальных путях, являясь, по-видимому, соединительным звеном в цепочках процессов поддержания нормального состояния клетки, нарушенных в стареющих клетках. Наиболее перспективным выглядит поиск фармакологических активаторов сестринов. Для понимания функций сестринов следует найти их наиболее характерные общие черты. Вполне возможно, что такой общей особенностью сестринов является их способность энергетически независимо активировать AMPK. Сестрин способен связываться с AMPK1 и 2 субъединицами, связываться с мишенями АМРК белками ULK1, Foxo1, FoxO3a, Smad3, связываться с белком SIRT1, важным членом сигнального пути AMPK [34].
Новые открытия функций сестринов могут быть получены путем отслеживания их функций в эволюции. Нематода C. elegans примечательна тем, что у нее нет гомологов и ортологов сульфоредоксина и нематоды не восстанавливают переокисленный пероксиредоксин [4]. Кроме того, у C. elegans сигнальный путь AMPK/Sesn-опосредованного подавления TORC1 описанный для млекопитающих [15] не существует, так как у нематоды нет гомологов белков TSC1 и TSC2. C, что дает возможность предположить, что фенотип нокаута сестрина у нематоды C. elegans может быть вообще не связан с сигнальными путями, описанными для млекопитающих. Вполне возможно, у нематоды C. elegans существуют другие механизмы влияния сестринов на метаболизм, аутофагию, и продолжительность жизни.
Известно ,что AMPK играет главную роль в явлении увеличения продолжительности жизни при низкокалорийной диете как у млекопитающих, так и у нематод [31, 35-38]. В условиях недостатка энергии AMPK фосфорилирует ряд мишеней и запускает катаболические процессы. В частности, АМРК фосфорилирует белки TSC2 [39] и Raptor [40] подавляя синтез белков и липидов через подавление комплекса mTORC1, а также фосфорилирует белок ULK1 [24 27, 41] таким образом, активируя аутофагию Аутофагия - процесс, критически важный для существования клетки в условиях недостатка нутриентов и энергии, и для поддержания нормального гомеостаза клетки, своевременного удаления поврежденных органелл и белков. Основным сигнальным путем регуляции аутофагии, известным для нематоды, является сигнальный путь инсулиноподобного фактора роста (IGF), контролирующий работу транскрипционных факторов семейства FoxO (у нематоды это белок DAF-16)[42]. Схожую роль также играет гомолог транскрипционного фактора FoxA белок PHA-4 [43, 44]. DAF-16 способен индуцировать транскрипцию ряда генов, необходимых для аутофагии. Далее, DAF-16 может подавлять экспрессию Raptor (у C. elegans это белок DAF-15), таким образом, подавляя TORC1 и глобально трансляцию мРНК. Как и у млекопитающих у нематод C. elegans TORC1 подавляет аутофагию, и соответственно, подавление TORC1 белком DAF-16 ее стимулирует. AMPK активирует DAF-16 [32] и таким образом активирует аутофагию.
Низкокалорийная диета (НД) увеличивает продолжительность жизни и снижает возрастные изменения практически у всех животных, включая C. elegans [45]. Эффекты НД строго зависят от аутофагии [43, 46-50]. Существует ряд методик НД, но до сих пор не ясно, существует ли общий механизм лежащий в основе этого явления. Для C. elegans описаны восемь разных НД, задействующих разные механизмы и разные гены [51, 52]. Например, мутация в гене eat-2, снижающая частоту сокращений глотки, задействует гомолог гена FoxA [53] ген pha-4, но не DAF-16 (FoxO) или AMPK [44, 54]. В другом примере , AMPK и FoxO (но не PHA-4) задействуются при НД с разбавленной едой на агаровых чашках [51]. AMPK но не FoxO требуется в случае применения НД-миметика резвератрола [51]. Подавление TOR происходит в некоторых случаях, но не во всех [55]. Гомолог транскрипционного фактора Nrf2 белок SKN-1 необходим для НД в жидкой культуре [56], а также белок теплового шока HSF-1 играет роль в НД при полном отсутствии пищи [57]. Любопытно, что НД способна дополнительно увеличивать эффект продления жизни у нематод с мутацией в eat-2 [51].
У млекопитающих AMPK и кальций-зависимая фосфатаза кальциневрин антагонистически регулируют CREB-зависимые транскрипционные ко активаторы CRTCs [58]. Обнаружено, что единственный гомолог генов CRTCs у C. elegans (crtc-1) является важным участником регуляции продолжительности жизни, так как его выключение увеличивает продолжительность жизни на 53%, схожим образом действует ген tax-6 (гомолог кальциневрина) или активация AAK-2 (AMPK) [59]. Было показано, что увеличение продолжительности жизни при активации АМРК достигается при подавлении crtc-1. Белок CRTC-1 является прямой мишенью для фосфорилирования AMPK, что приводит к инактивации и выходу CRTC-1 из ядра, а белок TAX-6 в свою очередь может активировать CRTC-1 [59].
Белок CRTC-1 необходим для активации транскрипционного фактора CREB-homologue-1 (crh-1 у C. elegans), у млекопитающих эти гены регулируют энергетический гомеостаз клетки [58, 60, 61] а также участвуют в реакции на неупакованные белки (UPR) [62]. Инактивация CRTC-1 и CRH-1 киназой AMPK приводит к активации генов семейства abu (activated in unfolded protein response (UPR)) [59], Гены семейства abu кроме того активируются резвератролом и играют решающую роль в опосредованном им увеличении продолжительности жизни [63]. Видимо, гены abu необходимы для НД опосредованного увеличения продолжительности жизни, и эти эффекты регулируются активной AMPK [63]. Тем не менее остается неизвестным уровень активности АМРК, необходимый для активации FOXO (DAF-16)-CRTC-1/CRH-1 сигнального пути, связанного с аутофагией.
Нематода C.elegans как модельный организм
Весьма примечателен тот факт, что влияние TOR на старение многоклеточных организмов было впервые описано для нематоды C.elegans. Впервые нематоду предложено было исполтьзовать в качестве модельного организма для изучения генетики еще в 1948 году [127], затем для изучения генетического регулирования развития [128] в 70-е годы 20го века. Нематода была выбрана для этих исследований , благодаря ряду свойств, делающих это животное очень удобным модельным организмом.
Нематоду легко содержать в лабораторных условиях, она способна питаться бактеримями лабораторных видов (например, E. Coli, для нематод используется штамм ОР-50, ауксотрофный по урацилу[128]) и обитать на поверхности агара или в жидкой среде. Для длительного хранения нематод можно замораживать при -700С и в жидком азоте. Генетические манипуляции с нематодой проводить сравнительно легко. Их достаточно просто скрещивать или осуществлять нокдаун генов. Для подавления генов рнк-интерференцией с помощью генетических конструктов не требуется трансформация нематод, их достаточно кормить бактериями, экспрессирующими двойную рнк или просто поместить ненадолго в раствор, содержащий двойную рнк против гена, который нужно подавить[131]. У нематоды был впервые полностью отсеквенирован, что очень удобно для генетических исследований[132]. Для наших исследований, кроме очевидных преимуществ нематоды как модельного организмы, сыграл тот факт, что у нематоды интересующее нас семейство генов сестринов представлено одним ортологом[4].
Жизненный цикл нематоды после вылупления из яйца включает в себя четыре последовательные линьки, между которыми нематода находится в соответствующих дичиночных стадиях (рисунок 3), до достижения фертильного возраста.
Скорость жизненного цикла зависит от факторов окружающей среды, в первую очередь, от температуры и наличия еды. При температуре 220С (нормальной температурой для нематоды является диапазон температур от 140С до 230С) нематоде требуется 72 часа, чтобы пройти все стадии[133](рисунок 4).
На стрелках обозначено время , которое нематода проводит в предыдущей стадии. Размеры указаны в микрометрах. Адаптировано из [130].
Основную популяцию нематод составляют гермафродиты (рисунок 5), встречаемость самцов (рисунок 6) в нормальных условиях около 2 на 1000. C. elegans имеет типичное строение для круглых червей, цилиндрическое тело с представляющее собой внешнюю трубку (кожно–мускульный мешок) и внутреннюю трубку. Кожно–мускульный мешок состоит из кутикулы, энтодермиса, секреторных клеток, миоцитов и нейронов. Внутренняя трубка состоит из глотки, кишечника и гонад. Основное отличие гермафродитов от самцов в строении гонад (рисунки 5,6). У гермафродитов гонады состоят из соматических гонад, зародышевых клеток и яйцекладущего аппарата. Два дистальных плеча гонад переходят в центре матку через проксимальные гонады – оотеки. Ооциты оплодотворяются при движении через оотеки. Затем из оплодотворенных оотек развиваются яйца, откладываемые через вульву, расположенную в центре тела гермафродита (рисунок 5)[134, 135]. Гермафродиты способны формировать примерно 200-300 яиц в течении первых пяти дней взрослой жизни, затем их фертильность угасает.
Отличие самцов от гермафродитов морфологически наблюдается в районе хвоста. Эти отличия появляются на стадии L2 в виде заметного утолщения хвостовой части[136]. В дальнейшем здесь развивается копуляторный аппарат, с девятью чувствительными волосками, облегчающими перенос спермы через вульву гермафродитов[137]. Гонады самцов представляют собой одно плечо, состоящее из соматической гонады и зародышевых клеток. Гонада связана с проктодеумом посредством семенных везикул и семявыносящего протока (рисунок 6). Рисунок 6. Самец нематоды C. elegans. А) Схематическое изображение анатомических структур (левая сторона); Б) увеличенное изображение хвоста; Г) увеличенное изображение гонады; Д) увеличенное изображение хвоста , вид снизу (стрелокой обозначена клоака); Е) изображение самца под микоскопом с DIC. Шкала соответствует 0,1 мм. Адаптировано из [130].
В случаях, если популяция нематод находится в стрессовых условиях (голод, скученность, высокая температура) нематоды способны образовывать арестные стадии, например, при отсутствии пищи нематоды в стадии L1 способны останавливатья в развитии.
Наиболее хорошо изучены сигнальные пути образования особой личиночной стадии - дауэровской личинки. В условиях стресса в популяции взрослые нематоды выделяют вокруг себя феромоны, и другие нематоды, в стадии L2, способны переходить в дауэровскую личинку(Ld) (рисунок 3). В процессе подготовки к переходу в эту стадию нематода накапливает синтезированные de novo липиды, у нее деградирует пищеварительный тракт, замирает развитие гонад, останавливается сокращение глотки, формируется плотная кутикула, закрывающую ротовое отверстие. В такой личиночной стадии нематода способна выживать несколько месяцев, это явление называется дауэровской диапаузой[133, 138].
Роль гена сестрина в регуляции аутофагии
Известно, что в основе способности нематоды не только выживать но и продлевать продолжительность жизни при отсутствии пищи лежит активация аутофагии [150, 153] и подавление активности TOR[154]. Участие сестрина нематоды в этих процессах исследовалось нами с помощью оценки аутофагии, и оценки степени фосфорилирования мишени TOR белка rpS6. Для оценки индукции аутофагии использовался штамм нематод, несущий в клетках генетический конструкт, экспрессирующий аналог белка LC3 млекопитающих, белок LGG-1, сшитый с GFP (LGG::GFP fused) под своим промотором [155]. Этот конструкт экспрессируется равномерно по всему телу, в случае образования аутофагосомы, GFP сигнал концентрируется на поверхности мембраны аутофагосомы, она становится видна как светящаяся точка, это позволяет рассмотреть и подсчитать их (рисунок 16). Сестрин у этого штамма был подавлен РНК-интерференцией.
Подсчет проводился в клетках гиподермального шва нематод в стадии L3, который выглядит как цепочка клеток по обеим сторонам тела. Размеры этих клеток позволяют сравнительно легко находить внутри них меченные GFP лизосомы[156] (рисунок 17).
Животные экспонировались в течении 16часов в условиях, описанных для оценки продолжительности жизни. Выяснилось, что голод активирует накопление аутолизосом у дикого типа нематод на 416 %, а при отсутствии функционального сестрина всего на 61% (рисунок 18).
Для контроля полученных данных был получен штамм RB2325xDA2123 путем скрещивания штаммов RB2325 (делеция в гене сSESN) и DA2123. Для этого штамма получены аналогичные результаты.
Затем был проведен иммуноблоттинг с лизатами, полученными из нематод штамма DA2123, подвергнутых таким же условиям. На блоте с антителами против GFP (рисунок 18) видно, что в случае голода у дикого типа аутофагия значительно активируется, что не наблюдается в случае подавления сестрина. Это означает что сестрин нужен для адекватной активации аутофагии в условиях голода. Рисунок 18. Иммуноблоттинг лизатов нематод, окрашенный против против GFP и фофсфорилированной формы rpS6. В качестве контроля нагрузки использовались антитела против актина.
На блоте с антителами против фосфорилированной формы рибосомального белка S6 (rpS6) видно, что фосфорилироване rpS6 у мутанов во время голода не снижается, тогда как у голодных червей пропадает (рисунок 18). Это означает что сестрин нужен для подавления ТОР, что обычно происходит при голодании.
Далее была проведена оценка состояния тканей в области глотки нематоды, как места, наиболее сильно подвергающегося воздействию аутофагии при голоде. У нематод этого рода глотка в течении жизни постоянно сокращается. В условиях голода прилежащие ткани в прямом смысле самопоедаются, для обеспечения мышц глотки энергией, а это дает возможность оценить аутофагию на микроскопическом уровне по последствиям самопоедания. На снимке среза глотки, полученного с помощью элетронной микроскопии, видно разрежение прилегающих к мышцам тканей у нематод дикого типа, у делеционных по сестрину мутантов это не наблюдается (рисунок 19). Видимо, это явление лежит в основе описанного в литературе замедления движений нематоды и снижения локомоторной активности [157].
Воздействие торина 2 на продолжительность жизни нематод разных возрастов
Для изучения механизма действия торина-2 в нематоде оценивалась индукция аутофагии. Для этого использовался штамм нематод, несущий в клетках генетический конструкт, экспрессирующий аналог белка LC3 млекопитающих, сшитый с GFP (LGG-1::GFP fused), такой же как в исследовании роли сестрина в регуляции аутофагии. Сначала нами была оценена активация аутофагии у нематод в целом (качественно). Наиболее активно аутофагия проявляется в области , где глотка нематоды переходит в верхний отдел кишечника. Связано это с тем, что глотка постоянно сокращается со скоростью около 280 сокращений в минуту, и поэтому постоянно нуждается в энергии и нутриентах. Нами были исследованы нематоды под действием серийных разведений торина и рапамицина в течении 16 часов, а в качестве контроля активации аутофагии нематод подвергали 16 часовому голоду. На полученных снимках (рисунок 23) четко видна сильная активация аутофагии у нематод, обработанных торином и у голодных, в отличие от нематод, обработанных рапамицином.
Количественная оценка проводилась с помощью подсчета аутофагосом в клетках гиподермального шва нематод в стадии L3 (рисунок 24). Для подсчета аутофагосом нематод штамма DA2123 обработали в течении 16 часов 100 мкМ торина 2 и рапамицина, для контроля нематод подвергали 16 часовому голоду а также подавили с помощью рнк-интерференции сTOR, так как известно, что он является ингибитором аутофагии.
Выяснилось, что в этом эксперименте голод приводит к увеличению количества аутолизосом на 506% больше , чем в контроле, при воздействии РНК-интерференции против сTOR и торина 2 на 420% , при воздействии рапамицина всего на 38%.
Затем были получены лизаты из нематод, культивированных в синхронной культуре на твердой среде с добавлением в агар 5, 10 , 25, 50 и 100 нМ/мл торина 2 и 50, 100, 250, 500 и 1000мкМ/мл рапамицина в течении 16 часов при 200С. Выбор концентраций действующих веществ объясняется желанием проверить с помощью иммуноблотинга действие оптимальных концентраций торина 2 и рапамицина. Далее был проведен имунноблоттинг этих лизатов с антителами против GFP, по методу как в исследовании сестрина. На блоте наблюдается дозозависимость действия торина 2, процесс аутофагии проходит все стадии (наблюдается расщепленный GFP). Фосфорилирование белка rpS6 подавляется торином 2 тоже дозозависимо. Интенсивность аутофагии, накопления расшепленного GFP и фосфорилирования rpS6 можно оценить по соотношению этих показателей к актину, нормализованному по контролю (рисунок 25). В случае рапамицина также наблюдается дозозависимость действия рапамицина, но процесс аутофагии активируется незначительно, и не проходит все стадии (нет расщепленного GFP) (рисунок 26).