Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Убиквитин-протеасомная система деградации белков 8
1.1.1. Система убиквитинирования белков 8
1.1.2. Строение протеасомы 11
1.1.3. Механизм взаимодействия протеасомы с субстратом 15
1.1.4. Деградация белков 20S протеасомой 17
1.1.5. Альтернативные регуляторы 20S протеасомы 18
1.1.6. Химическое ингибирование протеасомы 20
1.2. Регуляция экспрессии протеасомных генов 24
1.2.1. Факторы транскрипции, регулирующие экспрессию протеасомных генов в норме и при стрессе 24
1.2.2. Фактор транскрипции Rpn4 26
1.3. Клеточный ответ на повреждение ДНК 32
1.3.1. Источники повреждений ДНК в клетке 32
1.3.2. Клеточный ответ на повреждение ДНК 34
1.3.3. Убиквитин-протеасомная система в ответе на ДНК-повреждающий стресс 39
2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Материалы 42
2.1.1. Реактивы 42
2.1.2. Растворы 43
2.1.3. Культуральные среды 43
2.1.4. Ферменты 44
2.1.5. Наборы 44
2.1.6. Бактериальные штаммы 44
2.1.7. Дрожжевые штаммы 44
2.1.8. Плазмиды 45
2.1.9. Олигонуклеотиды 46
2.2. Методы 51
2.2.1. Молекулярное клонирование 51
2.2.2. Трансформация клеток S. cerevisiae 51
2.2.3. Метод выращивания серийных разведений дрожжевой культуры на чашках Петри (определение устойчивости клеток к стрессу) 52
2.2.4. Выделение РНК из клеток S. cerevisia e 52
2.2.5. Измерение относительного уровня мРНК генов 53
2.2.6. Выделение геномной ДНК S. cerevisiae 53
2.2.7. DamID 54
2.2.8. Измерение активности -галактозидазы 54
2.2.9. Измерение активности протеасомы 55
2.2.10. Вестерн-блот анализ клеточных лизатов 55
2.2.11. Определение активности систем репарации двухцепочечных разрывов 56
3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Разработка метода детекции привлечения Rpn4 к ДНК при помощи dam-метилазы
E.coli 57
3.1.1. Конструирование плазмид, кодирующих метилазу dam и гибридные белки, слитые с ней 58
3.1.2. Подбор условий рестрикции ДНК, выбор контролей и анализ привлечения Rpn4 к промоторным областям генов 60
3.2. Конструирование и исследование штамма с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией протеасомы 63
3.2.1. Конструирование штамма с мутацией PACE в промоторе гена PRE1 63
3.2.2. Исследование влияния нарушения регуляции гена одной из субъединиц на активность 20S протеасомы 65
3.2.3. Оценка влияния ингибирования протеолитической функции протеасомы на устойчивость клеток дрожжей к генотоксическому стрессу 67
3.2.4. Исследование стабильности Rpn4 и экспрессии его мишеней в штамме с нарушенной активностью протеасомы 70
3.3. Идентификация мишеней Rpn4, участвующих в ответе на ДНК-повреждающий стресс 73
3.3.1. Поиск мишеней Rpn4, участвующих в ответе на ДНК-повреждающий стресс 73
3.3.2. Исследование вклада Rpn4 в регуляцию генов MAG1-DDI1 и RAD52 75
3.3.3. Определение вклада Rpn4 в регуляцию других генов стрессового ответа 79
3.4. Конструирование и характеристика штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов, кодирующих белки системы репарации 82
3.4.1. Конструирование штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов MAG1-DDI1, RA D23 и RAD52 82
3.4.2. Характеристика устойчивости штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов MAG1-DDI1, RAD23 и RAD52 к генотоксическому стрессу 85
3.5. Обсуждение результатов 87
4. Выводы 91
5. Список сокращений 92
6. Список литературы 93
- Система убиквитинирования белков
- Культуральные среды
- Подбор условий рестрикции ДНК, выбор контролей и анализ привлечения Rpn4 к промоторным областям генов
- Конструирование штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов MAG1-DDI1, RA D23 и RAD52
Введение к работе
Актуальность проблемы
Повреждение ДНК является основной угрозой жизнедеятельности клетки, и может приводить к программируемой смерти по механизму апоптоза, либо к неконтролируемому делению клетки и развитию злокачественных опухолей. Однако одно- и двунитевые разрывы постоянно происходят и в норме, в результате плановых перестроек в цепи ДНК при мейозе, репликации и некоторых других процессах. Поэтому клеточные механизмы ответа на повреждение ДНК разнообразны и задействуют множество функциональных систем. Относительно мало изучена связь между клеточным ответом на повреждение ДНК и убиквитин-протеасомной системой.
Убиквитин-протеасомная система (УПС) – это сложная сеть белок-белковых
взаимодействий, обеспечивающих контролируемый протеолиз значительной части
внутриклеточных полипептидов. На первом этапе каскад реакций, осуществляемых ферментами,
обозначаемыми как Е1-Е2-Е3, осуществляет распознавание субстрата и навешивание на него
одной или нескольких молекул небольшого белка убиквитина. На втором этапе
убиквитинированный субстрат расщепляется в протеасоме. 26S протеасома – главный компонент УПС, представляет собой многосубъединичный протеазный комплекс. Он состоит из двух субкомплексов – протеолитического 20S (20S протеасомы) и регуляторного 19S субкомплекса. Координированная регуляция генов убиквитин-протеасомной системы хорошо описана только у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, где осуществляется посредством фактора транскрипции Rpn4.
Помимо функции простой утилизации белков, 26S протеасома вовлечена в регуляцию ряда клеточных процессов, включая транскрипцию и репарацию. Так, показано привлечение протеасомы к местам двуцепочечных разрывов в ДНК. 19S субкомплекс независимо от функции протеолиза участвует в регуляции репарации по механизму эксцизионной репарации нуклеотидов. Кроме того, субъединица 19S субкомплекса Sem1 в дрожжах необходима для репарации двухцепочечных разрывов, а делеция гена SEM1 приводит к развитию гиперчувствительности к различным ДНК-повреждающим агентам. Sem1 является гомологом человеческого белка DSS1, который взаимодействует с BRCA2 при репарации двуцепочечных разрывов по механизму гомологичной рекомбинации.
Несмотря на то, что участие протеасомы в репарации задокументировано, неясно, какую
же роль – положительную или отрицательную, она играет в клеточном ответе на действие ДНК-
повреждающих факторов (генотоксический стресс). Относительно немногочисленные
исследования содержат противоречивые сведения – так, например, обработка ингибиторами
протеасомы клеток млекопитающих приводит к подавлению гомологичной рекомбинации, с
другой стороны, на дрожжевых клетках показано, что ингибирование протеасомы делает клетки
более устойчивыми к действию цисплатина (ДНК-повреждающего агента, используемого как
противоопухолевый препарат). Так как возможность использования ингибиторов протеасомы в
качестве противоопухолевых агентов активно исследуется, а некоторые из них (бортезомиб)
одобрены к применению, вопрос о роли протеасомы в ответе на повреждение ДНК требует
дальнейшего изучения. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются удобной моделью для
изучения последствий повреждений ДНК и репарации, так как основные участники процесса (в
частности, гены из группы эпистаза RAD52) гомологичны генам человека. При этом с клетками
дрожжей, удобно проводить практически любые генетические манипуляции.
В данной работе на дрожжах Saccharomyces cerevisiae мы исследовали роль 20S протеасомы в устойчивости клеток к действию различных ДНК-повреждающих агентов путем нарушения Rpn4-зависимой регуляции ее субъединицы Pre1. Мы обнаружили, что ингибирование протеасомы различными способами приводит к развитию гиперустойчивости клеток к действию ряда агентов, в том числе метилметансульфонату и зеоцину (блеомицину). Кроме того, мы описали Rpn4-опосредуемый механизм развития устойчивости клеток с нарушенной функцией протеасомы за счет активации различных путей репарации ДНК.
Цели и задачи исследования
Целью данной диссертационной работы является исследование механизмов устойчивости к стрессу дрожжей Sacch aromyces cerevisiae, опосредуемых транскрипционным фактором Rpn4. Экспериментальной задачей исследования является изучение вклада Rpn4 в регуляцию отдельных генов в модели ДНК-повреждающего стресса путем создания дрожжевых штаммов, мутантных по сайтам связывания Rpn4, и оценки их фенотипа. В рамках этой задачи в работе можно выделить следующие этапы:
-
Создание штамма с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией 20S протеасомы и изучение его фенотипа в условиях ДНК-повреждающего стресса;
-
Создание штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцие й генов, кодирующих белки-участники различных путей репарации ДНК, и их изучение при действии ДНК-повреждающих агентов.
Научная новизна
В ходе работы был разработан метод оценки привлечения нестабильного
транскрипционного фактора Rpn4 к ДНК путем его слияния с dam метилазой E. coli. При помощи этого метода было подтверждено, что привлечение Rpn4 к промоторной области гена снижается при мутации его сайта связывания. Созданы дрожжевые штаммы со стабильными мутациями в промоторных областях генов убиквитин-протеасомной системы (PRE1) и системы репарации ДНК (MAG1, RAD23 , RAD5 2), обладающие повышенной либо пониженной чувствительностью к ДНК-повреждающим агентам. Достоверно показано, что снижение протеолитической активности протеасомы приводит к гиперустойчивости дрожжевых клеток к различным ДНК-повреждающим агентам. Установлен механизм развития этой гиперустойчивости – нарушение регуляции 20S протеасомы приводит к стабилизации Rpn4 и к опосредованной этим активации системы репарации ДНК. Также в работе показано, что мутации в сайтах связывания Rpn4 в промоторных областях некоторых генов системы репарации приводят к гиперчувствительности к ДНК-повреждающим агентам, в частности, метилметансульфонату, 4-оксинитрохинолину и зеоцину. Эти данные позволяют сформулировать механизм участия транскрипционного фактора Rpn4 в ответе на генотоксический стресс, при котором ключевую роль играет активация этим фактором генов системы репарации, а активация протеасомы может играть скорее отрицательную роль. Кроме того, в работе исследован вклад Rpn4 в процесс гомологичной рекомбинации, который осуществляется, по-видимому, через регуляцию гена RAD52.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на 14–й Пущинской конференции молодых ученых (Россия, Пущино, 2010), на 36-ом международном конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011), 25ой международной конференции по молекулярной биологии и генетике дрожжей (Ольштын, Польша, 2011), на научной школе-конференции «Структура и динамика биологических макромолекул» (София, Болгария, 2012).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезиса конференций.
Структура и объем диссертации
Система убиквитинирования белков
Как было отмечено ранее, 20S протеасома составляет значительную часть от всего пула протеасом в клетке. Соотношение между количеством 20S и 26S протеасом может изменяться в результате изменений в клеточном метаболизме. Для дрожжей показано, что преобладание тех или иных комплексов зависит от используемого источника углерода: при росте на среде с глюкозой количество 20S протеасом в клетках повышено по сравнению с клетками, которые выращивали на среде с этанолом и глицеролом [Demasi и др., 2014a]. При этом в первом случае в клетке окислительно-восстановительный баланс сдвинут в сторону окисления, так как, несмотря на пониженное потребление кислорода, антиоксидантные системы клетки не работают в результате катаболитной репрессии, т.е. подавления экспрессии генов глюкозой. На клетках млекопитающих показано, что соотношение «метаболических молекул» НАДН/НАД+, которое является показателем внутриклеточного редокс-баланса, регулирует соотношение 20S/26S. Восстановленный НАДН непосредственно связывается с субъединицами 19S субкомплекса и стабилизирует 26S протеасому [Tsvetkov и др., 2014].
Искусственно смоделированный окислительный стресс, вызванный инкубацией клеток с перекисью водорода, приводит к диссоциации 26S частиц и увеличению количества свободных 20S частиц. Более того, под действием перекиси нарушается убиквитин-зависимая деградация субстратов 26S протеасомы, что приводит к накоплению полиубиквитинированных белков [Wang и др., 2010]. Тепловой шок также приводит к диссоциации протеасом, причем сверхэкспрессия шаперона Hsp90 препятствует этому процессу. Интересно, что этот шаперон, судя по всему, необходим для сборки и поддержания 26S протеасомы, так как недостаток Hsp90 в результате мутации сам по себе приводит к диссоциации протеасом [Imai и др., 2003].
Из приведенных примеров можно предположить, что в условиях стресса в клетке деградация белков преимущественно переключается на убиквитин-независимый протеолиз с участием 20S протеасом. В процессе убиквитин-независимого протеолиза отсутствует этап гидролиза АТФ, который, в случае протеолиза 26S протеасомой, необходим в том числе для разворачивания субстрата. Отсюда следует, что 20S протеасома в первую очередь расщепляет те белки, которые не нужно разворачивать. Действительно, среди субстратов 20S протеасомы преобладают белки, поврежденные и частично развернутые в результате окисления, мутаций и других процессов, происходящих, например, в процессе старения клетки. Также это белки, обладающие значительными по длине неструктурированными областями (больше 30 аминокислот), и белки, вообще не имеющие определенной структуры. В последнюю группу входит множество регуляторных и сигнальных белков, концентрация которых в клетке подвержена строгой регуляции [Ben-Nissan, Sharon, 2014].
Важной функцией 19S регуляторного комплекса является открытие канала, ведущего в протеолитическую камеру путем взаимодействия с -субъединицами 20S протеасомы. Помимо 19S, существует два семейства АТФ-независимых регуляторов протеасомы, 11S (PA28) и Blm10/PA200 [Frster, Hill, 2007]. Они не обладают способностью узнавать полиубиквитин и гидролизовать АТФ, и их основной функцией, по-видимому, является механическое взаимодействие с -субъединицами и открытие канала, чтобы обеспечить доступ субстрата. 11S (PA28) регуляторы встречаются у высших эукариот, но не у дрожжей. Существует три изоформы PA28: и , которые работают в паре и формируют гетерогептамер, и , который формирует гомогептамер. Из Trypanosoma brucei выделен активатор PA26, существенно отличающийся от PA28, но способный открывать протеасомы из разных видов, в том числе Saccharomyces cerevisiae. Другое семейство регуляторов 20S протеасомы включает в себя дрожжевой белок Blm10 и его человеческий ортолог PA200. Blm10 функционирует как мономер и встречается преимущественно в составе гибридных комплексов Blm10-20S-19S. Его функции изучены не очень хорошо, но известно, что он участвует в регуляции клеточного метаболизма и вовлечен в клеточный ответ на повреждение ДНК. Дрожжи, дефектные по гену, кодирующему Blm10, проявляют повышенную чувствительность к различным агентам, вызывающим окислительный и генотоксический стресс [Doherty и др., 2012]. Как показано in vitro на модельном субстрате tau-441, Blm10 стимулирует деградацию протеасомой несвернутых белков [Dange и др., 2011].
Помимо активатор-зависимого механизма открытия 20S протеасомы, существуют и другие пути, в частности, химическая модификация протеасомы. Изменение внутриклеточного редокс-баланса может регулировать активность 20S протеасом, определяя тем самым потенциал для удаления поврежденных в результате окисления белков [Demasi и др., 2014b]. В условиях окислительного стресса активируются антиоксидантные системы и повышается внутриклеточная концентрация глутатиона (трипептида -глутамилцистеинилглицина), который служит акцептором активных форм кислорода. Через остаток цистеина глутатион может модифицировать белки, в частности 5-субъединицу протеасомы. Показано, что S-глутатионилирование непосредственно вызывает открытие канала 20S протеасомы и опосредованное общее увеличение протеолитической активности в клетке [Demasi и др., 2014a].
Помимо активаторов известны и внутриклеточные ингибиторы протеасомы. В клетках высших эукариот с 20S протеасомой может связываться белок PI31, обладающий сходной с Blm10 структурой С-концевого домена с мотивом HbXY, через который он взаимодействует с -субъединицами корового субкомплекса. PI31 ингибирует протеолитическую активность 20S протеасомы, по крайней мере, in vitro. Он связывает 20S, конкурируя с активаторами 19S (PA700) и PA28. Функции PI31 in vivo не совсем ясны [Li и др., 2014]. В дрожжах относительно недавно описана ингибирующая активность белка Ecm29, который связывается с 26S протеасомой, вызывает закрытие канала в протеолитическую полость протеасомы и подавляет АТФазную активность Rpt-субъединиц [La Mota-Peynado De и др., 2013]. В условиях протеотоксического стресса (рост дрожжей на среде с токсичным аналогом аргинина канаванином), как и при тепловом шоке, когда необходима повышенная активность протеасомы, делеция ECM29 улучшает выживаемость клеток, что подтверждает его ингибирующую функцию in vivo. Кроме того, Ecm29, как показано на нескольких мутантных штаммах с мутантными субъединицами протеасомы, предпочтительно связывается с испорченными комплексами [La Mota-Peynado De и др., 2013]. Ранее для этого белка было показано участие в диссоциации 26S протеасом под действием перекиси водорода, кроме того, оказалось, что дрожжи с делецией гена ECM29 обладают повышенной чувствительностью к перекиси (в противоположность протеотоксическому стрессу) [Wang и др., 2010].
Культуральные среды
Дрожжевые штаммы выращивали в течение ночи в жидкой среде YPD, либо селективной среде, затем разводили до OD600=0,2 и подращивали в течение 4х часов, затем добавляли MMS до концентрации 0,1% и инкубировали еще 30 мин. РНК выделяли ка к описано ранее. Комплементарную ДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы RevertAid по протоколу, рекомендованному производителем, с олиго-dT в качестве затравки. Количество мРНК определяли методом ПЦР в реальном времени с красителем SYBR Green на приборе АНК-32 (Синтол, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Реакцию проводили в следующем режиме: 96С – 4 , 35 циклов, 96С – 20 , XС – 25 , 72С – 25 . X – температура отжига праймеров для каждой пары праймеров подбиралась отдельно. Длины амплифицируемых фрагментов в каждом случае составляли 100-150 пар нуклеотидов. Каждая реакция замешивалась в трех повторностях. Пороговый цикл реакции и эффективность рассчитывались с помощью программного обеспечения, предоставляемого производителем прибора. Для расчета данных среднюю эффективность возводили в степень, равную разности пороговых циклов для референтного гена и для опытного.
Культуру выращивали в течение ночи в 10 мл жидкой среды до OD600=1-1,5. Клетки осаждали центрифугированием 3000g 3 мин. Осадок отмывали от ростовой среды в mQ и ресуспендировали в 200 мкл буфера лизиса B. Добавляли равный объем смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1 (v:v:v)) и 0,2 г стеклянных шариков ( 0,7 мм), встряхивали на шейкере на максимальной скорости в течение 2 мин. Суспензию центрифугировали на максимальной скорости в течение 5 мин. Водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли трехкратный объем 96% этанола и десятую часть объема 3M NaOAc. Инкубировали при -20 С 30 мин. ДНК осаждали центрифугированием на максимальной скорости в течение 10 мин, супернатант количественно отбирали, осадок растворяли в 50 мкл буфера ТЕ, добавляли 150 мкл РНКазыA в буфере ТЕ (10 мкг/мл) и инкубировали при 37С в течение двух часов. Повторно осаждали ДНК в этаноле и центрифугировали. Осадок ДНК промывали дважды 70% этанолом, высушивали и растворяли в 100 мкл 10mM Tris-HCl с pH 8,0
Дрожжевые клетки, продуцирующие Dam-метилазу либо гибридные белки Dam-Rpn4, растили в жидкой среде до OD600=1. Из полученной культуры выделяли геномную ДНК как описано ранее. Далее 1 мкг геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Mbo в концентрации 0.75 ед/мкл в течение ночи при 37С. Обработанную ДНК амплифицировали в ПЦР в реальном времени с праймерами, фланкирующими исследуемый GATC сайт. Референтной последовательностью служил фрагмент гена RPT6, не содержащий сайтов GATC. Реакцию проводили в трех повторностях на приборе АНК-32 (Синтол). Реакционная смесь содержала 25 нг геномной ДНК, праймеры в количестве 10 pm каждый, и реакционный буфер, содержащий флуоресцентный краситель SYBR Green . Вычисление порогового цикла и эффективности реакции производилось при помощи программного обеспечения, поставляемого вместе с прибором. Дальнейшую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel по формуле: R = g (c(t) реф - сад оп)9 где – усредненная эффективность реакции, С(t) реф -усредненный пороговый цикл реакции амплификации референтной последовательности, C(t) оп - усредненный пороговый цикл реакции амплификации исследуемого участка, содержащего GATC сайт. Рассчитываемое по этой формуле значение R прямо пропорционально степени метилирования данного GATC сайта. Кроме того, R не зависит от наличия примесей в препарате ДНК, используемого в ПЦР.
Относительный уровень сигнала рассчитывали по следующей формуле: R rel = R(Dam-Rpn4)/ R(Dam), где R(Dam-Rpn4) - значение R, описывающее степень метилирования определенного GATC сайта химерным белком, а R(Dam) -значение R, описывающее степень метилирования того же сайта GATC свободной метилазой. Стандартное отклонение для R rel вычисляли по формуле: A/Б = [(D(A)+M 2(A)] [(D(1/Б)+M 2(1/Б)] - M 2(A) M 2(1/Б), где M -математическое ожидание, D - дисперсия.
Активность галактозидазы определяли как описано в [Osipov и др., 2011]. Ночную дрожжевую культуру разводили до OD600 = 0.2, подращивали 2 часа и добавляли MMS до концентрации 0,05%. Через 4 часа клетки осаждали и лизировали путем встряхивания со стеклянными шариками в течение 3х минут в Z-буфере с добавлением 10% глицерина. Лизат центрифугировали, отбирали супернатант и инкубировали с ONPG (ortho-nitrophenyl--galactoside) до развития желтой окраски. Реакцию останавливали добавлением раствора 1M Na2CO3. Активность фермента рассчитывали по формуле А=OD420 1,4/(0,0045 tmin Vml C), где tmin – время развития окраски, Vml – объем клеточного лизата в реакции, С = (OD224-OD233)/0,0496 , величина, характеризующая общее количество белка в препарате.
К контрольной культуре MMS не добавляли и клетки осаждали через 4 часа по достижении OD600 = 1, затем анализировали аналогичным образом.
Клетки лизировали со стеклянными шариками в буфере лизиса А, лизаты осветляли центрифугированием. Общее количество белка определяли по формуле С = (OD224-OD233)/0,0496. Аликвоты клеточных лизатов, содержащие 50 мкг тотального белка инкубировали с синтетическим флуорогенным субстратом протеасомы suc-LLVY-AMC (20 мкМ) в течение 1 часа при 30С. Реакцию останавливали добавлением SDS до 1% и измеряли интенсивность флуоресценции в образцах. Для того, чтобы вычесть неспецифическую протеазную активность, препараты параллельно инкубировали со специфическим ингибитором протеасомы лактацистином (20 мкМ в течение 30 мин) и нормировали общую протеазную активность на сигнал в пробе с лактацистином.
Накопление полиубиквитинированных белков в клетках дрожжей в условиях теплового шока оценивали методом вестерн-блот анализа с моноклональными антителами против убиквитина. Ночную культуру дрожжей разводили и подращивали до лог-фазы (OD600=0,5), затем переносили на 39С и растили в течение 2х часов. Клетки собирали центрифугированием, лизировали инкубацией с 0,1 М NaOH c последующим кипячением в течение 10 мин в буфере для образцов.
Препараты разделяли в 7% ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с последующим окрашиванием первичными мышиными антителами против убиквитина и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена.
Подбор условий рестрикции ДНК, выбор контролей и анализ привлечения Rpn4 к промоторным областям генов
В базе данных YEASTRACT [Abdulrehman и др., 2011] мы выбрали ряд генов, относящиеся к системам репарации ДНК, и потенциально регулируемые с участием Rpn4. Это гены, кодирующие белки-участники основных путей репарации (см.таблицу 4) -NTG1, APN1, POL31, RAD10, RAD23, RAD50, RAD51, RAD52, MAG1. Участие Rpn4 в регуляции этих генов показано либо данными по связыванию в полногеномных исследованиях по иммунопреципитации хроматина, либо по изменению экспрессии в различных условиях. Кроме того, в промоторных областях этих генов содержится какая либо из форм сайт связывания Rpn4. В эксперименте по измерению уровня мРНК выбранных генов в штамме с делецией гена RPN4 по сравнению с диким типом в норме и при стрессе ДНК-повреждающим агентом метанметилсульфонатом мы обнаружили, что экспрессия только трех из них зависит от Rpn4 – RAD23, MAG1 и RAD52 (рисунок 17), для остальных генов значительной разницы в экспрессии между штаммами дикого типа и rpn4- не было (рисунок 18). Интересно, что эти три гена представляют три различные пути репарации ДНК – MAG1 кодирует 3-метиладенин ДНК-гликозилазу, которая выщепляет поврежденные основания в ДНК при эксцизионной репарации оснований, продукт гена RA D23 участвует в эксцизионной репарации нуклеотидов, а RAD52 кодирует белок, осуществляющий обмен цепей в процессе рекомбинации ДНК при репарации двухцепочечных разрывов (см.таблицу 4). Кроме того, ген MAG1 разделяет двунаправленный промотор с геном DDI1, который также вовлечен в репарацию ДНК [Liu, Xiao, 1997].
Мы измерили относительный уровень мРНК этих трех генов в штамме YP L и обнаружили, что, по аналогии с геном RPT5, относительный уровень мРНК повышен по сравнению с диким типом как в норме, так и при стрессе (рисунок 17). На основании этих данных мы можем предположить, что стабилизация Rpn4 в результате нарушения активности протеасомы приводит к увеличению количества его мишеней, в частности, упомянутых трех генов, и активации как минимум трех различных путей репарации ДНК, следствием чего является устойчивость клеток к ДНК-повреждающему стрессу. Рисунок 17. В штамме YPL наблюдается повышенный уровень экспрессии генов MAG1 (А), RAD23 (Б), RAD52 (В), относящихся к различным путям репарации ДНК. В качестве референтного гена использован ген актина.
Для подтверждения гипотезы об участии Rpn4 в регуляции RAD52 мы также измерили эффективность гомологичной рекомбинации (репарации двуцепочечных разрывов) по способности восстанавливать линеаризованную плазмиду, содержащую селективный маркер, в штамме дикого типа, YPL, и штаммах с делециями генов RPN4 и RAD52 (рисунок 19А, Б). Штамм с делецией RAD52 закономерно проявил очень низкий уровень рекомбинации, так как белок Rad52p необходим в этом процессе [Symington, 2002]. Штамм с делецией Rpn4 также отличается значительно сниженным уровнем рекомбинации, предположительно из-за сниженной экспрессии RAD52. В штамме YPL уровень репарации двухцепочечных разрывов оказался в два раза выше, чем в диком типе. Таким образом, мы показали, что в клетках дрожжей с нарушенной протеолитической функцией протеасомы активирована система репарации двухцепочечных разрывов в ДНК.
Рисунок 19. Штамм YPL проявляет повышенную способность к репарации линеаризованной плазмиды, содержащей селективный маркер. А. Схема метода оценки эффективности репарации двухцепочечных разрывов ДНК в дрожжах. Плазмиду, содержащую селективный маркер, обрабатывают рестриктазами и трансформируют дрожжевые клетки продуктом реакции, затем высевают на селективную среду. Количество выживших клеток по сравнению с контролем (непорезанной плазмидой) отражает способность штамма репарировать двуцепочечные разрывы. Б. В штамме YPL эффективность репарации двуцепочечных разрывов повышена, в то время как в штаммах с делециями генов RA D52 и RPN4 – существенно снижена по сравнению с диким типом. Разброс данных отражает стандартное отклонение для трех повторностей эксперимента.
Двунаправленный промотор MAG1-DDI1 содержит два потенциальных сайта связывания для Rpn4 MACE (GGTGGCGA), которые кроме того, по данным литературы, служат сайтами связывания для транскрипционного фактора Pdr3 [Zhu, Xiao, 2004]. Мы оценили активность промотора с делециями последовательностей MACE как вместе, так и по отдельности, в составе репортерной конструкции с -галактозидазой, в штамме дикого типа и штамме с делецией гена PDR3.
Для эксперимента был получен ряд генетических конструкций, кодирующих репортер под контролем двунаправленного промотора MAG1-DDI1 дикого типа, либо с делециями сайтов MACE. Схематическое изображение промотора с положениями сайтов относительно старт-кодона гена MAG1 дано на рисунке 20А. Сайт, расположенный ближе к старту гена MAG1, был обозначен, как «проксимальный» (MACEp), а следующий как «дистальный» (MACEd). Чтобы получить плазмиду pMAG1-lacZ, участок геномной ДНК в позициях от -300 до +201 относительно старт-кодона гена MAG1 амплифицировали и клонировали по HindIII-BamHI вместо промоторной области гена RPT5 в полученную ранее плазмиду pRPT5-lacZ. Аналогично была получена плазмида pDDI1-lacZ, но амплифицировали участок от -300 до +201 относительно старт-кодона гена DDI1. Делеции сайтов вводили при помощи двустадийного ПЦР-мутагенеза. Активность галактозидазы в составе плазмиды pMAG1-lacZ оказалась очень низкой, поэтому, так как общая картина активации генов оказалась похожей, для наглядности данные представлены для плазмиды pDDI1-lacZ.
Согласно полученным данным, основной вклад в регуляцию генов MAG1-DDI1 вносит последовательность, лежащая ближе к старт-кодону гена MAG1 (MACEp), так как активность галактозидазы для конструкции с делецией этого сайта снижается до уровня активности конструкции с делецией обоих сайтов (больше, чем в два раза), в то время как делеция второго сайта (MACEd) снижает активность незначительно (рисунок 20Б).
Конструирование штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов MAG1-DDI1, RA D23 и RAD52
В данной работе мы показали, что нарушение протеолитической функции протеасомы разными способами – как путем снижения экспрессии одной из субъединиц 20S субкомплекса, так и под действием ингибитора, приводит к повышению устойчивости к генотоксическому стрессу, вызванному веществами с различным механизмом действия. Генотоксический стресс приводит в первую очередь к повреждению ДНК и активации различных путей репарации. Несмотря на то что для определенного типа повреждения ДНК существует предпочтительный механизм репарации, в реальности в клетке происходит активация сразу нескольких путей [Lee и др., 2005]. Кроме того, практически любое повреждение ДНК сопровождается генерацией активных форм кислорода, приводящей к развитию клеточного ответа на окислительный стресс. Таким образом, для развития устойчивости к генотоксическому стрессу необходим комплексный транскрипционный ответ, включающий различные механизмы защиты.
Роль убиквитин-протеасомной системы в клеточном ответе на стресс нельзя недооценивать. Убиквитин-протеасомная система вносит значительный вклад как на уровне регуляции белков убиквитином, так и обеспечивая протеолиз участников процессов репарации, и утилизируя поврежденные в результате неблагоприятного воздействия белки. Однако деградация некоторых компонентов может оказывать негативное влияние на восстановление клеточных систем после повреждения. Поэтому, какое действие окажет нарушение функций УПС, в частности, ее протеолитической функции, на устойчивость к стрессу, не очевидно. Сведения, имеющиеся на этот счет в литературе, противоречивы.
В работе [Wang и др., 2008] было показано, что нарушение Rpn4-зависимой регуляции одной из субъединиц протеолитического субкомплекса протеасомы приводит к чувствительности штамма к метанметилсульфонату. В своей работе мы обнаружили противоположный эффект при нарушении Rpn4-зависимой регуляции субъединицы PRE1. Полученный штамм YPL устойчив не только к MMS, но и к широкому спектру ДНК-повреждающих агентов. Более того, снижение активности протеасомы с использованием ингибиторов приводит к аналогичному фенотипу. В данном случае расхождение данных можно объяснить разницей условий культивирования штаммов – по видимому, при росте на минимальной среде, как в упомянутой работе, чувствительность клеток к стрессу обостряется. Молекулярный механизм этого явления неясен, но предположительно в данных условиях активируется т.н. клеточный ответ на недостаток питательных веществ (nutritional stress response) [Ferretti, Larocca, Favre, 2012]. С этой точки зрения, культивация штаммов на богатой среде YPD, как в нашей работе и ряде других [Cunha и др., 2013; Tallec Le и др., 2007], является более адекватным условием исследования чувствительности к стрессу.
В работе [Ben-Aroya и др., 2010] делокализация протеасомы из ядра в цитоплазму привела к геномной нестабильности и нарушению процессов репарации. Однако, ингибирование протеасомы в той же работе не приводило к проявлению подобного фенотипа. По-видимому, относительно небольшое снижение протеолитической функции протеасомы (в два раза, как в нашей работе) благоприятно влияет на способность клетки восстанавливать повреждения ДНК за счет стабилизации некоторых белков, в то время как полное удаление протеасомы из ядра приводит к нарушению баланса ключевых факторов, поддерживающих стабильность генома, что и приводит к появлению мутаторного фенотипа.
В своей работе мы описали механизм, как именно снижение активности протеасомы приводит к развитию устойчивости к генотоксическому стрессу в результате стабилизации одного из ключевых факторов антистрессового ответа – фактора транскрипции Rpn4. Rpn4 одновременно является активатором протеасомных генов и субстратом протеасомы с очень коротким временем полужизни. Нарушение протеолитической функции 20S субкомплекса приводит к увеличению его количества в клетке, что приводит к усилению активации других мишеней Rpn4 – генов репарации ДНК и ответа на окислительный стресс. Мы показали, что в штамме YPL повышена экспрессия Rpn4-зависимых генов MAG1, RAD23 и RAD52, кодирующих белки-участники трех различных путей репарации ДНК – эксцизионной репарации оснований, нуклеотидов и репарации путем гомологичной рекомбинации. Ген RAD52 был впервые идентифицирован как мишень Rpn4. Кроме того, в штамме YPL оказался повышен уровень репарации двуцепочечных разрывов, предположительно за счет увеличения количества Rad52. Не исключено, что к этому эффекту приводит стабилизация каких-то других субстратов протеасомы, задействованных в репарации двуцепочечных разрывов.
Мы проверили вклад сайтов связывания Rpn4 в регуляцию генов MAG1 и RAD52, а также некоторых других генов антистрессового ответа. Были получены штаммы с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов MAG1, RAD23 и RAD52 по отдельности, а также штамм RMdM с двойной мутацией в промоторах генов MAG1 и RAD23. Этот штамм оказался чувствителен к ряду ДНК-повреждающих агентов, что позволяет предположить механизм развития гиперчувствительности штамма с делецией RPN4 к этим агентам. По – видимому, высокая чувствительность штамма rpn4- определяется суммарным эффектом от сниженной активности множества его мишеней.
Штамм с нарушенной регуляцией RAD52, так же, как и штамм с делецией гена, оказался полностью нежизнеспособен в условиях стресса ДНК-повреждающими агентами. По-видимому, гомологичная рекомбинация, ключевым участником которой является Rad52, необходима для репарации повреждений ДНК, вызванных агентами с разным механизмом действия. Эти данные позволяют уточнить механизм токсического действия и развития устойчивости к таким агентам как MMS, 4-NQO и зеоцин (блеомицин), использованных в нашей работе. Несмотря на то что первые два агента преимущественно вносят модификации в ДНК, устранение которых требует активации эксцизионной репарации оснований или нуклеотидов, их действие приводит также к значительному накоплению двуцепочечных разрывов. Напротив, зеоцин считается индуктором образования двуцепочечных разрывов, однако вовлеченность генов MAG1 и RAD23 в устойчивость к этому агенту указывает на то, что он приводит к модификациям ДНК, вероятно, окислительного характера.
Итак, ингибирование протеасомы разными способами в клетках дрожжей приводит к повышению устойчивости клеток к различным ДНК-повреждающим агентам, многие из которых являются противоопухолевыми препаратами. Однако в терапии опухолей ингибиторы протеасомы (бортезомиб) нередко применяют в сочетании с подобными препаратами [Dou, Zonder, 2014]. Есть данные, что в клетках млекопитающих нарушение функций протеасомы приводит к обратному эффекту – снижению уровня гомологичной рекомбинации и повышению чувствительности клеток к генотоксическому стрессу [Kristensen и др., 2010; Murakawa и др., 2007]. Такое расхождение вполне объяснимо, если принять во внимание описанный нами Rpn4-опосредованный механизм развития устойчивости. В клетках высших эукариот нет Rpn4. Более того, несмотря на высокую консервативность генов группы RAD52 у дрожжей и человека, механизм гомологичной рекомбинации у них несколько отличается. Если в дрожжах Saccharomyces и
Schizosaccharomyces Rad52 является ключевым белком, осуществляющим гомологичную рекомбинацию, то в клетках млекопитающих он выполняет минорную роль, а его функции берет на себя Brca2, которого у дрожжей нет [Mehta, Haber, 2014]. Кроме того, в клетках млекопитающих большую роль в репарации двуцепочечных разрывов играет NHEJ (негомологичное соединение концов). Таким образом, механизмы устойчивости к ДНК-повреждающим агентам, и роль протеасомы в них в клетках дрожжей и млекопитающих разные. Поэтому, несмотря на то, что дрожжи являются очень удобной моделью для изучения клеточного ответа на различные препараты [Matuo и др., 2012], следует интерпретировать данные этих исследований с оглядкой на различие физиологии различных организмов, в частности, процессов репарации ДНК.