Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Ген RIL 14
1.2. RIL как представитель PDZ/LIM-доменных белков 15
1.2.1 Особенности PDZ-доменов и PDZ-доменных белков 16
1.2.2. Особенности LIM-доменов и ЫМ-доменных белков 18
1.3. Репертуар взаимодействий белка RIL 20
1.4. Взаимосвязь RIL с процессами злокачественной трансформации клеток
1.4.1. Корреляция уровня экспрессии RIL со статусом рецепторов прогестерона и эстрогена 23
1.4.2. Корреляция уровня экспрессии RIL со степенью дифференцировки клеток опухоли 24
1.4.3. Корреляция уровня экспрессии RIL с другими параметрами РМЖ 25
1.4.4. Корреляция уровня экспрессии RIL с подтипом РМЖ в рамках модели РСК 28
1.4.5 Значение c-Src и RIL в развитии и характеристике рака молочной железы 1.5. Экспрессия c-Src как клиническая характеристика рака молочной железы 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Работа с культурами эукариотических клеток 41
2.1.1. Клеточные линии, использованные в работе 41
2.1.2. Условия культивирования 43
2.1.3. Пересев адгезионных культур 43
2.1.4. Замораживание и размораживание эукариотических клеток 44
2.1.5. Оценка скорости пролиферации клеток 44
2.1.6. Оценка миграционной активности клеток 45
2.2. Молекулярно-биологические методы 45
2.2.1. Выделение тотальной РНК из клеток 45
2.2.2. Определение концентрации РНК/ДНК в растворе 47
2.2.3. Электрофоретическое разделение РНК/ДНК в агарозном геле 47
2.2.4. Обратная транскрипция 48
2.2.5 Анализ уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 48
2.3. Работа с плазмидной ДНК и клонирование 53
2.3.1. Получение химически компетентных клеток Е.coli 53
2.3.2. Трансформация химически компетентных клеток Е.coli 53
2.3.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 54
2.3.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 54
2.3.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 55
2.3.6. Лигирование ДНК 55
2.3.7. Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе 56
2.3.8. Трансфекция 59
2.3.9. Упаковка лентивирусных частиц 59
2.3.10. Очистка вирионов и трансдукция 60
2.4. Методы выделения и анализа белков 61
2.4.1. Анализ содержания белков в исследуемых клетках методом Вестерн-блоттинг 61
2.4.2. Определение активности киназы с-Src 64
2.4.3. Иммунофлуоресцентный анализ 65
2.5. Селекция модифицированных аптамеров к CD47 методом Cell-SELEX 67
2.5.1 Случайные ДНК-библиотеки и праймеры 67
2.5.2 Процедура SELEX на клетках 68
2.5.3 Определение связывающей способности одноцепочечных ДНК-аптамеров обогащенного пула после каждого раунда 69
2.5.4 Селекция клонов и секвенирование 69
2.5.5 Сравнение последовательностей и анализ вторичных структур аптамеров 69
2.5.6 Результаты проведения раундов селекции 70
2.6. Статистический анализ полученных данных 71
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 73
3.1. Анализ уровня экспрессии RIL в ряду линий рака молочной железы 73
3.2. Подавление и повышение экспрессии RIL в ряду линий РМЖ 75
3.3. Анализ миграционной активности RIL (+) и RIL (-) линий РМЖ 78
3.4. Анализ гипотезы PDLIM4-опосредованной инактивации Src киназ 80
3.5. Секвенирование транскриптомов трансгенных линий и анализ полученных результатов 84
3.6. Анализ взаимосвязи RIL с моделью CD-74 – опосредованного развития РМЖ 88
3.7. Анализ корреляции экспрессии RIL с CD44 и CD47 93
3.8. Анализ внутриклеточной локализации RIL 95
Заключение 98
Выводы
- Взаимосвязь RIL с процессами злокачественной трансформации клеток
- Оценка миграционной активности клеток
- Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе
- Секвенирование транскриптомов трансгенных линий и анализ полученных результатов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний в мире, наиболее частая форма рака среди женщин. По оценкам экспертов ВОЗ каждый год в мире диагностируется от 800 тыс. до 1 млн. новых случаев РМЖ. Несмотря на глобальный характер этого заболевания, многие аспекты этиологии и патогенеза РМЖ остаются неясными. Сложность изучения обусловлена тем, что РМЖ объединяет группу гистологически и биохимически гетерогенных опухолей, отличающихся по инвазивности, клиническому течению и механизмам формирования. Непрерывно увеличивающийся объем данных свидетельствует о том, что развитие отдельных подтипов РМЖ характеризуется альтернативными сигнальными каскадами, в разной степени меняющими транскрипционный профиль клетки. В связи с этим, большой интерес представляет поиск и изучение молекулярных маркеров, ассоциированных с отдельными механизмами развития РМЖ. Одним из генов, вовлеченных в процессы малигнизации клеток, является ген RIL.
RIL (reversion-induced LIM-domain containing), впоследствии получивший название PDLIM4, был впервые описан в 1995 году, как кандидат на роль онкосупрессора. У человека ген PDLIM4/RIL локализован на 5-й хромосоме в области 5q31.1, часто делетируемой в ряду онкологических заболеваний. Помимо делеций, ген RIL может подвергаться эпигенетической супрессии, обнаруживаемой при злокачественной трансформации клеток. Особую роль RIL может играть при развитии рака молочной железы: ряд данных косвенно указывает на корреляцию некоторых клинических параметров этого заболевания, таких как размер, плоидность или степень дифференцировки клеток, с нарушениями экспрессии RIL. Несмотря на имеющиеся доказательства взаимосвязи данного гена с этим и другими типами рака, процессы развития опухолей, в которых он принимает участие, остаются неизвестными. На изучение RIL-зависимых молекулярных механизмов формирования рака молочной железы и были направлены представленные исследования.
Научная новизна работы
В работе проведен системный анализ участия RIL в процессе развития рака молочной железы. Показана высокая гетерогенность линий РМЖ по уровню экспрессии RIL. В ходе изучения теории RIL опосредованной инактивации c-Src-киназы проведена оценка корреляции уровня экспрессии RIL с активностью c-Src в клетках отдельных линий РМЖ. Получен ряд линий РМЖ с искусственно подавленной и повышенной экспрессией RIL. Проведен анализ влияния нарушения уровня RIL на изменение транскриптома клеток РМЖ. Выявлен ряд генов, демонстрирующих прямую и обратную корреляцию с уровнем экспрессии RIL. Предложена и экспериментально подтверждена модель взаимосвязи RIL с CD74 опосредованной концепцией развития РМЖ, объясняющая корреляцию повышения уровня экспрессии RIL с увеличением злокачественности клеток. Впервые обнаружена ядерная локализация RIL в ряду линий РМЖ.
Цели и задачи исследования
Основной целью проводимого исследования было зучение оли PDLIM4/RIL в процессе развития рака молочной железы.
Поставленные задачи
-
Провести анализ уровня экспрессии RIL в клетках различных линий РМЖ.
-
Провести оценку модели RIL опосредованной инактивации c-Src киназы в клетках различных линий РМЖ.
-
Получить панель линий РМЖ с искусственно подавленным и повышенным уровнем экспрессии RIL.
-
Оценить влияние уровня экспрессии RIL на морфологические и функциональные особенности клеток опухолей молочной железы.
-
Провести анализ влияния подавления и повышения уровня экспрессии RIL на изменение транскриптома клеток РМЖ.
-
Исследовать взаимосвязь RIL с моделью CD74 опосредованного развития РМЖ.
-
Проверить корреляцию уровня внутриклеточного RIL с интенсивностью экспрессии маркеров стволовых клеток CD44 и CD47.
-
Оценить внутриклеточную локализацию RIL в клетках различных линий РМЖ.
Степень достоверности и апробация диссертации
Достоверность полученных результатов обеспечена использованием в работе комплекса методических подходов: современных высокочувствительных молекулярно-биологических, биохимических и иммунологических методов исследования, тщательным учетом и подробной оценкой результатов с использованием адекватных методов статистической обработки данных.
Материалы диссертации были представлены на международной конференции Наука Будущего (20-23 сентября 2016, Казань), на XI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (16-19 марта 2016, Москва), на международной конференции Будущее Биомедицины (2-7 сентября, Вадивосток) и совместном коллоквиуме Группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки и Лаборатории пролиферации клеток в Институте Молекулярной Биологии имени В.А.Энгельгардта (май 2017).
Структура и объем работы
Взаимосвязь RIL с процессами злокачественной трансформации клеток
Одной из наименее изученной функций LIM-доменных белков является их способность к перемещению между компартментами клетки [33]. Среди LIM белков, ассоциированных с цитоскелетом и первоначально описанных в качестве цитоплазматических молекул, многие, к примеру, зиксин, FHL, CRP или ряд членов ALP семейства впоследствии были обнаружены в ядре клетки [22, 33]. В то время как в составе некоторых из них, к примеру зиксина или FHL2, были обнаружены сигналы ядерного экспорта и импорта, механизмы перемещения остальных оказываются до сих пор не изученными.
Хорошо известно, что внутриклеточная локализация белка во многом определяет его функционирование. Было показано, что LIM белки способны изменять локализацию своих артнеров, транспортируя их различные компартменты клетки. Способность LIM белков перемещаться между ядром и цитоплазмой позволяет им, в частности, контролировать активность факторов транскрипции и принимать участие в механизмах регуляции экспрессии генов. Двойная локализация LIM белков позволяет также осуществлять контроль их собственной активности: белки, выполняющие роль ядерных факторов, могут быть инактивированы перемещением цитоплазму, о время как внутриядерный транспорт цитоплазматических LIM-доменных белков позволяет изолировать их от цитоплазматических мишеней [22, 33].
Начало функциональному изучению RIL было положено момента выявления его взаимодействия с протеинтирозинфосфатазой мыши PTP-BL. Было показано, что С-концевой участок RIL способен связываться с PDZ-доменом PTP-BL; в стабилизации образующегося комплекса также оказался задействован LIM-домен RIL. В ходе проведенного исследования была показана возможность in vitro и in vivo фосфорилирования LIM-домена RIL по остатку тирозина Y274 и его in vitro дефосфорилирования фосфатазным доменом PTP-BL [36, 37]. Полученные данные в дальнейшем легли в основу концепции RIL-зависимой инактивации с-Src, в рамках которой RIL, взаимодействуя с протеинфосфатазой PTP-BL человека, способствует дефосфорилированию с-Src и переходу ее в неактивное состояние (более подробно этот процесс описан в следующих разделах) [38].
Следующим идентифицированным белком, ассоциированным с RIL, оказался TRIP6 (thyroid hormone receptor interacting protein 6) - 476-аминокислотный белок из семейства зиксина. Было установлено, что взаимодействие происходит между PDZ-доменом RIL и LIM-доменами TRIP. Интересно, что также, как и RIL, TRIP способен взаимодействовать с PTP-BL фосфатазой: в клетках линии А431 для всех трех белков даже была показана колокализация в субмембранной области, богатой фибриллярным актином [37, 39].
Важным результатом исследования взаимодействия RIL и TRIP6 стало обнаружение возможности гомодимеризации RIL. Было показано, что аналогично связыванию LIM-домена TRIP6, PDZ-домен RIL способен взаимодействовать с собственным ЫМ-доменом [37].
Наиболее хорошо изученной функцией RIL является го участие регуляции структуры и динамики актинового цитоскелета. Аналогично другим представителям семейства ALP/Enigma, к примеру, белкам ALP и CLP-36, RIL посредством своего PDZ-домена может взаимодействовать с -актинином, тем самым облегчая его связывание с актиновыми филаментами. Взаимодействие с -актинином позволяет RIL принимать участие в таких процессах как стабилизация Z-дисков поперечнополосатых мышц, поддержание структуры фокальных контактов, а также формирование актиновых стресс-фибрилл [40, 41].
Еще одной функцией RIL, связанной с -актинином, является его участие в транспорте и правильной локализации АМРА-рецепторов в нейронах мозга. АМРА-рецептор — ионотропный рецептор глутамата, который передаёт быстрые возбуждающие сигналы в синапсах нервной системы позвоночных [42]. Одна из субъединиц глутаматного рецептора GluR-A может взаимодействовать с LIM-доменом RIL, который, взаимодействуя с -актинином посредством PDZ-домена, обеспечивает заякоривание рецепторов на мембране клетки. Было установлено, что гиперэксп рессия этого белка в нейронах первичной культуры г иппокампа приводит к значительному обогащению глутаматных рецепторов в области синапсов и усилению AMPA-зависимых синаптических токов [43].
С момента идентификации гена RIL в качестве потенциального онкосупрессора в 1995 году был накоплен ряд данных, свидетельствующих о нарушениях его экспрессии на генетическом и эпигенетическом уровнях в опухолях различных типов [17, 19-21]. Особую роль RIL может играть при развитии рака молочной железы: ряд данных косвенно указывает на корреляцию некоторых клинических параметров этого заболевания, таких как размер, плоидность или степень дифференцировки клеток, с нарушениями экспрессии RIL. Несмотря на имеющиеся доказательства взаимосвязи нарушений экспрессии данного гена с этим и другими типами рака , механизмы развития опухолей, в которых принимает участие RIL, остаются неизвестными.
На начальном этапе исследования участия RIL в процессах канцерогенеза представлялось возможным проанализировать имеющиеся на сегодняшний день данные о взаимосвязи нарушений экспрессии RIL с клиническими параметрами РМЖ, такими как статус гормональных рецепторов, тип опухоли , индекс плоидности, количество клеток в S-фазе и других.
Оценка миграционной активности клеток
Для измерения миграционной активности клеток использовали 24-луночные трансмиграционные камеры с диаметром пор 8 микрон (Corning). В верхнюю часть трансмиграционной камеры вносили по 100000 клеток в 200 мл ростовой среды без сыворотки. В нижнюю часть камеры добавляли 750 мл ростовой среды. Проводили инкубацию в течение 18 часов на при 37С во влажной атмосфере, насыщенной 5% СО2. По завершении инкубации в верхней и нижней частях каждой из камер среду заменяли на раствор трипсина, после чего помещали плашки в шейкер (PST-60L BioSan) на 10 минут для обеспечения полного открепления клеток как с верхней, так и с нижней поверхностей мембраны. Суспензию клеток из нижней и верхней камер отбирали в отдельные пробирки, осаждали центрифугированием. Осадок клеток ресуспендировали в 100 мл CellTiter-Glo Reagent (Promega) или же в 100 мкл CyQUANT (Thermo Fisher). Суспензию переносили в лунки 96-луночного планшета (Helicon); измерение люминисценции одили на автоматическом планшетном фотометре/флуориметре/люминометре (Triad LT, Dynex). Миграционную активность клеток оценивали как отношение количества клеток на нижней стороне мембраны трансмиграционной камеры к количеству немигрировавших клеток, оставшихся на верхней стороне мембраны. Предложенная методика позволяла нивелировать вклад погрешности рассеиваниява клеток, снижающий точность результатов при учете исключительно мигрировавших клеток.
Выделение тотальной РНК из клеток проводили по протоколу, прилагаемому к коммерческому препарату Trizol (Invitrogen, 15596) (Chomczynski et al, 1987).
На первой стадии клетки анализируемой линии промывали раствором PBS, а затем лизировали путем добавления предварительно охлажденного реактива Trizol (4 М гуанидин изотиоцианат; 2 М ацетат натрия, pH 4,0; 0,25% саркозил; 50% фенол) из расчета 1мл реактива на 10 см культуральной поверхности. Полученную суспензию перемещали в чистые микроцентрифужные пробирки и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. К суспензии клеток добавляли хлороформ (Химмед) из расчета 0,2 мл раствора на 1 мл Trizol, добавленного на предыдущем этапе; вортексировали микроцентрифужные пробирки и инкубировали течение трех минут ри комнатной температуре. Центрифугировали пробы при 12000g в течение пятнадцати минут при 4 С. Аккуратно отбирали верхнюю водную фракцию, содержавшую целевую РНК, чистую микроцентрифужную робирку, не допуская ее перемешивания с нижней органической фазой (фенол/хлороформ), содержащей белки и короткие фрагменты ДНК, а также с промежуточной фазой, состоящей из белков и длинных фрагментов ДНК. К отобранной фракции добавляли изопропанол (Химмед) в количестве 0,5 мл на 1 мл исходного Trizol, перемешивали на вортексе и инкубировали в течение десяти минут при комнатной температуре. Центрифугировали пробы при 12000g в течение десяти мин при 2-4 С; супернатант удаляли. К осадку добавляли этанол в количестве 1 мл на 1 мл добавленного ранее Trizol. Центрифугировали в течение пяти минут при 7500 g; супернатант удаляли. Подсушивали осадок, оставляя открытую микроцентрифужную пробирку на столе до полного испарения спирта. Осадок растворяли в 30 мкл деионизованной, обработанной диэтилпирокарботатом воды, не содержащей эндо- и экзодезоксирибонуклеаз, рибонуклеаз и фосфатаз (Thermo Fisher). Полученные образцы хранили при -70 С 2.2.2. Определение концентрации РНК/ДНК в растворе
Для измерения концентрации РНК и ДНК использовали приборы NanoDropOneC (Thermo Fisher) и Qubit3 Fluorometer (Invitrogen) согласно протоколам, рекомендованным производителями. Помимо измерения концентрации используемые приборы позволяли контролировать качество анализируемых образцов, измеряя отношение оптического поглощения при длинах волн 230, 260 и 280 нм и, тем самым, обеспечивая возможность оценки степени загрязнения препарата. Нормальными считали значения A260/280 = 1,85 - 2,05; A260/230 = 1.8 - 2.2.
Электрофорез в агарозном геле проводили в камерах для горизонтального электрофореза (International Biotechnologies Inc). Разделение нуклеиновых кислот проводили в 2% (для небольших, менее 700 п.н. фрагментов) или 1% (в случае крупных фрагментов ДНК) агарозном геле. Для приготовления геля использовали универсальную агарозу I типа (Helicon), растворяемую в ТАЕ буфере (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА, pH 8,5).
Образцы для электрофореза готовили с использованием 4х-кратного коммерческого буфера для нанесения (DNA Gel Loading Dye, Thermo Fisher). Для визуализации нуклеиновых кислот в каждую из проб вносили SYBR Gold (10000x, Thermo Fisher). В качестве стандарта использовали набор маркеров GeneRuler 1 kb DNA Ladder (250-10000 п.н.) или 100 bp DNA Ladder (при разделении небольших фрагментов ДНК) фирмы Thermo Fisher.
Электрофоретическое разделение фрагментов проводили при 70-120 В, генерируемых источником постоянного тока (Electrophoresis Constant ECPS 3000/150 Power Supply, Pharmacia) в течение 20-60 минут. Идентификацию полос РНК/ДНК проводили с помощью cветодиодного трансиллюминатора синего света (Safe Imager, Invitrogen).
В ходе анализа получаемых электрофореграмм проводили определение качества образцов РНК, оценивая соотношение интенсивности полос, соответствующих 28S и 18S РНК. Для дальнейшего изучения использовали образцы, для которых интенсивность 28S полосы оказывалась примерно в три раза выше, чем яркость 18S полосы, что свидетельствовало о низкой степени деградации РНК.
Для синтеза первичной цепи кДНК на РНК матрице использовали набор реактивов MMLV RT kit (Евроген), содержащий обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей (MMLV ревертаза).
В микроцентрифужные пробирки вносили по 1 мкл oligo(dT)2o праймера, 1 - 5 мкг РНК и 1мкл смеси олигонуклеотидов (10 мМ дАТФ, дГТФ, дЦТФ, и дТТФ); доводили общий объем реакционной смеси до 13 мкл, используя воду, очищенную от РНКаз. Смесь аккуратно перемешивали, инкубировали в термостате (1DB-120, ВюЬап) при 65 С в течение 5 минут. Далее в пробу добавляли 2 мкл пятикратного буфера для синтеза первой цепи (250 мМ Трис-НС1, 250 мМ КС1, 20 мМ MgCb, 50 мМ DTT, рН 8,3), 0.5 мкл ингибитора РНКаз (RiboLock, 20 U/мкл), 1 мкл смеси дезоксинуклеотидов (10 мМ), 0.5 мкл MMLV (200 U/мкл); аккуратно перемешивали. Пробы помещали в термостат и инкубировали в течение 60 минут при 50 С, а затем в течение 15 минут при 70 С - для инактивации реакции. Хранение полученной кДНК осуществляли при -20 С
Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе
Для обеспечения высокого уровня экспрессии RIL была проведена лентивирусная трансфекция выбранных клеток вектором pLM-CMV-FLAG-RIL, содержащим экспрессор трансгенного белка, регулируемый промотором цитомегаловируса. В качестве контроля, соответствующие линии трансфецировали аналогичным вектором, в котором ген RIL был заменен на ген красного флуоресцентного белка tagRFP.
Подавление экспрессии RIL было основано на феномене РНК интерференции. В ходе работы был использован вектор, содержащий последовательность, кодирующую двухцепочечную шпилечную структуру РНК, в процессе РНК интерференции преобразуемую в малые интерферирующие РНК, комплементарные RIL, подавляющие экспрессию этого белка в клетках . В качестве контроля был использован аналогичный вектор, кодирующий последовательность шпилечной РНК к белку E6 вируса папилломы человека. Генетические конструкции были введены в клетки отобранных линий в ходе лентивирусной трансфекции; список всех трансгенных линий приведен в таблице 7.
В результате проведенной работы уровень RIL был успешно ревертирован во всех линиях РМЖ, использованных в ходе эксперимента; результаты РВ-ПЦР анализа и иммуноферментного анализа экспрессии RIL в соответствующих линиях представлены на рисунке 16. Рисунок 16. Результаты изменения уровня экспрессии RIL в клетках некоторых линий РМЖ; А, В – результаты РВ-ПЦР анализа эффективности подавления (А) и повышения (В) уровня экспрессии RIL; каждое значение получено в 3х повторах, p 0,01; Б, Г – соответствующие данные иммуноферментного анализа
Полученные трансгенные линии использовали в качестве модельного объекта для дальнейших исследований. 3.3. Анализ миграционной активности RIL (+) и RIL (-) линий РМЖ
Для оценки влияния RIL на миграционную активность клеток РМЖ было проведено сравнение интенсивности миграции линий с искусственно подавленным и повышенным уровнем RIL. Миграционную активность оценивали в ходе опыта с использованием трансмиграционных камер; результаты представлены на рисунке 17.
Сравнение миграционной активности RIL (+) и RIL (-) линий РМЖ (представлены данные для НСС1395 Е6 и НСС1395 siRIL, T-47D FlagRIL и T-47D RFP, MDA-MB-436 Е6 и MDA-MB-436 siRIL, ВТ-549 FlagRIL и ВТ-549 RFP, MDA-MB-231 Е6 и MDA-MB-231 siRIL линий); каждое значение получено в Зх повторах, р 0,01
Согласно полученным данным, высокий уровень RIL оказывается ассоциирован с повышением миграционной активности клеток в четырех из пяти проанализированных линий. Данный эффект прослеживается как при подавлении, так и при искусственном повышении уровня RIL: в первом случае миграционная активность клеток падает (MDA-MB-231 siRIL, MDA-MB-436 siRIL, HCC1395 siRIL), во втором, соответственно, возрастает (BT-549 FlagRIL). Единственной линией, для которой прослеживается противоположная зависимость оказывается T-47D. Стоит отметить, что клетки линии T-47D tagRFP, используемой в качестве контроля, характеризуются наиболее низким уровнем экспрессии RIL среди всех линий анализируемой панели, в то время как в клетках с введенным экспрессором -47D FlagRIL уровень RIL оказывается максимален. Можно предположить, что столь значительное изменение количества внутриклеточного белка может негативно сказываться на функционировании клеток, что объясняло бы снижение их миграционной актинвости.
Анализ уровня экспрессии RIL в кле тках различных линий РМЖ, проведенный ранее, позволил поставить под сомнение рассмотрение RIL исключительно в роли гена-онкосупрессора. Результаты опыта по оценке влияния уровня экспрессии RIL на скорость миграции клеток позволяют окончательно признать несостоятельность этой концепции. В рамках проведенного эксперимента RIL проявляет себя в качестве онкогена, стимулирующего миграционную активность клеток, что in vivo приводило бы к увеличению интенсивности метастазирования опухоли и ухудшению прогноза заболевания. Стоит обратить внимание на тот факт, что все линии, для которых прослеживается прямая зависимость миграционной активности клеток от уровня экспрессии RIL, относятся к одному - тройному негативному субтипу РМЖ, в то время как линия T-47D, для которой наблюдается обратная закономерность, относится к люминальному А типу. Можно предположить, что механизмы развития отдельных субтипов РМЖ в разной степени затрагивают RIL: в то время как в рамках одного субтипа RIL может играть роль онкогена, в другом он будет выполнять функцию онкосупрессора
Единственной существующей теорией, объясняющей механизм онкосупрессорной роли RIL, является концепция RIL-опосредованной инактивации киназы с-Src, согласно которой, повышение внутриклеточного уровня RIL приводит к снижению активности с-Src, и, как следствие, к ослаблению ее онкогенного потенциала [38]. Для оценки этой модели представлялось целесообразным сопоставить уровень экспрессии RIL, характерный для различных линий РМЖ, с долей с-Src, находящейся в этих клетках в активной форме.
В ходе исследования были использованы шесть различных линий РМЖ; уровень экспрессии RIL в отобранных клетках определяли в ходе ПЦР-РВ по методу TaqMan; оценку уровня активности с-Src проводили в ходе иммуноферментного анализа с использованием антител к тотальной Src и к активной форме фермента, фосфорилированной по остатку тирозина 419. Полученные данные представлены на рисунке 18.
Секвенирование транскриптомов трансгенных линий и анализ полученных результатов
Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток T-47D FlagRIL; А - анализ экспрессии RIL и CD74: Al - RIL (окрашен зеленым) и CD74 (окрашен красным), А2 - RIL-специфичное окрашивание, А3 - CD74 -специфичное окрашивание; В - анализ экспрессии RIL и Scribble: Bl - RIL (окрашен зеленым) и Scribble (окрашен красным), В2 - RIL - специфичное окрашивание, ВЗ - Scribble-специфичное окрашивание; ядра окрашены DAPI (синий)
Следующим этапом проведенной работы стала оценка взаимосвязи между RIL и Scribble. Активная форма Scribble в норме расположена на базальной мембране клеток, что оказывается необходимым для обеспечения его способности ингибировать G1-S переход. В ходе взаимодействия Scribble с CD74 происходит изменение статуса фосфорилирования специфических сайтов С -концевого участка Scribble, приводящее к снижению функциональной активности дефосфорилированного белка и перемещению его из участков межклеточных контактов в цитоплазму, в итоге стимулирующее приобретение клеткой мезенхимального фенотипа [105]. Таким образом, для анализа взаимосвязи уровня экспрессии RIL с активностью Scribble оказалось возможным проследить внутриклеточную локализацию Scribble в RIL (+) и RIL (-) клетках.
Результаты иммунофлуоресцентного анализа, представленные на рисунке 21 на примере линии T-47D, позволяют заметить, что в RIL-дефицитных клетках Scribble преимущественно локализован на периферии в местах межклеточных контактов, что свидетельствует о функциональной активности белка. В то же время, в клетках, характеризующихся высоким уровнем экспрессии RIL, можно наблюдать делокализацию Scribble из участков межклеточных контактов, что говорит о потере его активности. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что высокий уровень экспрессии RIL может быть ассоциирован с инактивацией Scribble, что согласуется с предложенной концепцией RIL – зависимого процесса формирования РМЖ.
Заключительным этапом работы стала оценка корреляции экспрессии RIL и E-кадгерина – ключевого звена предлагаемой модели, утрата которого, приводит к эпителиально-мезенхимальному переходу и развитию рака. В ходе работы было проведено сопоставление результатов иммуноферментного анализа экспрессии Е-кадгерина в клетках ряда линий РМЖ с экспрессией в них белка RIL; полученные результаты представлены на рисунке 23. Рисунок 23. Результаты Western-blot анализа корреляции экспрессии RIL с интенсивностью экспрессии E-кадгерина в ряду линий РМЖ
Можно видеть, что для каждой из восьми линий РМЖ, использованных в ходе анализа, обнаруживается обратная корреляция экспрессии изучаемых белков: высокий уровень Е-кадгерина оказывается характерен для RIL-дефицитных линий, в то время как в клетках RIL (+) линий экспрессия Е-кадгерина оказывается подавленной, то полностью огласуется предложенным механизмом взаимосвязи RIL с CD74 - опосредованным развитием РМЖ.
Описанная концепция является первой моделью, позволяющей провести параллель между повышением вня экспрессии внутриклеточного RIL и увеличением злокачественности клеток. Приведенные данные позволяют объяснить, почему для целого ряда наиболее злокачественных линий РМЖ, таких как MDA-MB-231, MDA-MB 438 или HCC38, характерно повышение уровня экспрессии RIL. В рамках данной концепции оказывается возможным интерпретировать результаты опытов по анализу влияния уровня экспрессии RIL на миграционную активность клеток и уровень активности с-Src (разделы 3.3 и 3.4), где в ряду исследуемых иний РМЖ высокая экспрессия RIL оказывалась ассоциирована с более выраженной агрессивностью клеток. Несмотря на установление корреляции количества эндогенного RIL с уровнем экспрессии CD74, Scribble и -кадгерина, возможность внутриклеточного взаимодействия этих белков и механизмы этих процессов остаются неясными. Принимая во внимание участие ЫМ-доменных белков в регуляции генетической экспрессии, наиболее вероятным сценарием служит способность RIL взаимодействовать с транскрипционными факторами, вовлеченными в контроль экспрессии CD74, увеличение уровня которого в результате риводит нарушению функционирования Scribble и кадгерина, как это описано в работе G. Metodieva et al. 2013 [105]. Основываясь на данных предыдущих исследований, можно также предположить, что описанные белки являются компонентами одних и тех же сигнальных каскадов, задействованных в процессах развития РМЖ. Известно, в частности, что CD74, действуя в качестве клеточного рецептора для MIF - фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, способен активировать сигнальный путь ERK (Ras-ERK, MAPK/ERK) - один из ключевых и наиболее хорошо изученных сигнальных путей МАРК (англ. mitogen-activated protein kinase) [107]. Предыдущие результаты исследования роли RIL в процессе развития РМЖ также свидетельствовали его взаимосвязи с отдельными компонентами МАРК-сигнального пути [108]. Обращая внимание на обнаруженную тенденцию к колокализации RIL и CD74 (рисунок 22А), нельзя также исключать возможность непосредственного взаимодействия этих белков.
Большой интерес вызывает взаимосвязь концепции С074-зависимого развития рака с моделью RIL-опосредованной инактивации Src, в рамках которых RIL проявляет свойства онкогена и онкосупрессора, соответственно. Можно предположить, что, являясь адаптерным скэффолд-белком и принимая участие в разноплановых внутриклеточных каскадах реакций, RIL может оказываться вовлечен в оба процесса, в одних и тех же клетках и регулируя уровень экспрессии CD74, и участвуя в инактивации Src. В клетках опухолей различных типов эти процессы могут быть выражены в разной степени, что объясняло бы отсутствие однозначной корреляции уровня экспрессии RIL с прогнозом развития заболевания и злокачественностью клеток.
Параллельным направлением исследований стал поиск корреляции уровня экспрессии RIL с рядом маркеров раковых стволовых клеток, ассоциированных с активной экспрессией CD74. Среди проанализированных белков особый интерес представлял рецептор CD44, участвующий регуляции процессов пролиферации, миграции и дифференцировки клеток; другим маркером, ассоциированным негативным прогнозом РМЖ, изученным ходе проведенной работы, был CD47 - поверхностный клеточный гликопротеин, характеризующийся способностью предотвращать уничтожение клеток макрофагами и NK-киллерами. Результаты анализа корреляции интенсивности экспрессии RIL с уровнем CD44 и CD47 в клетках некоторых линий рака молочной железы представлены на рисунке 24. RIL(-) RIL(+)