Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 16
2.1. Введение: почему мы исследуем гипертермию? 16
2.1.1. Гипертермия и кровеносные сосуды 17
2.1.2. Гипертермия и иммунная система 18
2.1.3. Клеточный ответ на тепловой стресс 20
2.1.4. Гипертермия и сенсибилизация клеток к химио- и радиотерапии 21
2.1.5. Гипертермия в клинической практике 22
2.2. Комплексный характер клеточного ответа на тепловой стресс 25
2.2.1. Биомембраны 26
2.2.2. Цитоскелет 27
2.2.3. Субклеточные компартменты 27
2.3. Тепловой стресс и регуляция экспрессии генов 30
2.3.1. Белки теплового шока (HSPs) 31
2.3.2. Транскрипционные факторы теплового шока (HSFs) 32
2.3.3. Активация транскрипции при тепловом стрессе 36
2.3.4. Репрессия транскрипции при тепловом стрессе 40
2.4. Генотоксические эффекты теплового стресса 45
2.4.1. Система негомологичного соединения концов ДНК (NHEJ) и тепловой стресс 46
2.4.2. Гомологичная рекомбинация (HR) и тепловой стресс 49
2.4.3. Эксцизионная репарация ос но ваний (BER) и тепловой стресс 50
2.4.4. Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) и тепловой стресс 52
2.4.5. Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR) и тепловой стресс 53
2.4.6. Прямые повреждения ДНК, индуцир уемые тепловым стрессом 54
2.5. Последствия повреждающих эффектов теплового стресса 57
2.5.1. Клеточная смерть, индуцируемая тепловым стрессом 58
2.5.2. Аутофагия и тепловой стресс 59
2.5.3. Арест клеточного цикла и тепловой стресс 60
2.5.4. Преждевременное клеточное с тарение и тепловой стресс 61
3. Материалы и методы 65
3.1. Материалы 65
3.1.1. Клеточные линии 65
3.1.2. Антитела 65
3.1.3. Химические реактивы 66
3.2. Методы 68
3.2.1. Работы с культурами клеток 68
3.2.2. Анализ экспрессии генов 70
3.2.3. Микроскопические исследования 71
3.2.4. Методы анализа повреждений ДНК 74
3.2.5. Методы анализа ДНК-топоизомеразы I (топо1) 75
3.2.6. Другие методики 76
4. Результаты и обсуждение 77
4.1. Введение. Острый тепловой шок - модельная система для изучения клеточного ответа на стресс 77
4.1.1. Характеристика использо ванной в исследовании модели теплового стресса 79
4.1.2. Оптимизация условий строгой синхронизации раковых и нормальных клеток человека 81
4.2. Немедленный ответ клетки на стресс: роль клеточного ядра и эпигенетических факторов 83
4.2.1. Роль вариантного гистона H2AX в немедленном клеточном ответе на тепловой стресс 83
4.2.1.1. Тепловой стресс индуцирует фосфорилирование H2AX в клетках человека 85
4.2.1.2. Паттерн индуцированных тепловым стрессом фокусов H2AX зависит от стадии клеточного цикла 87
4.2.1.3. Тепловой стресс индуцирует образование ДЦР в клетках человека, находящихся на стадиях G1 и G2 клеточного цикла 89
4.2.1.4. Тепловой стресс индуцирует арест либо замедление репликации ДНК 92
4.2.1.5. Индуцированное тепловым стрессом фосфорилирование H2AX происходит при участии разных киназ 94
4.2.1.6. Фосфорилирование H2AX предотвращает коллапс репликативных вилок 96
4.2.2. Динамика ядерных белков в немедленном клеточном ответе на тепловой стресс 99
4.2.2.1. Динамика локализации теломерного белка TRF2 в условиях теплового стресса 100
103
4.2.2.2. Динамика локализации центромерного белка HP1 в условиях теплового стресса 103
Белок HP1 диссоциирует из прицентромерных участков интерфазных хромосом при тепловом стрессе 106
Диссоциация HP1 из прицентромерных участков не связана с деметилированием H3K9 108
Диссоциация HP1 не приводит к декомпактизации центромер 109
4.3. Отложенный ответ клетки на тепловой стресс: последствия комплексного повреждающего действия теплового стресса 112
4.3.1. Молекулярные механизмы индуцированного тепловым стрессом клеточного старения 113
4.3.1.1. Тепловой стресс индуцирует p21-зависимое клеточное старение 113
4.3.1.2. Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение только в клетках, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла 116
4.3.1.3. ДНК-топоизомераза I (топо1) является мишенью теплового стресса 120
4.3.1.4. Репликация ДНК необходима для запуска программы клеточного старения,
индуцированного тепловым стрессом и/или камптотецином 125
4.3.1.5. Тепловой стресс и CPT индуцируют персистирующие сигналы о повреждении ДНК в ранне-S-фазных кл етк а х 126
4.3.1.6. Столкновение репликативных вилок с топо1-зависимыми ОЦР приводит к активации персистирующего DDR и последующему преждевременному старению клеток 129
4.3.2. Комплексный характер гиперчувствительности клеток, находящихся в ранней S-фазе
клеточного цикла, к тепловому стрессу 134
4.3.2.1. Тепловой стресс индуцирует частичную ре-репликацию ДНК в клетках, находящихся в
ранней S-фазе клеточного цикла 135
з
4.3.2.2. Обратимость ареста пролиферации, ассоциированного с индуцированным тепловым стрессом клеточным старением 138
4.3.2.3. Тепловой стресс индуцирует амплификацию центросом в клетках, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла 142
4.3.2.4. Нарушение регуляции экспрессии факторов лицензирования репликации ДНК может являться причиной индуцированных тепловом стрессом ре-репликации ДНК и амплификации центросом 143
4.4. Новые подходы к индукции клеточного старения in vitro 146
4.4.1. Модель индукции клеточного старения, сформулированная на основе изучения отложенных эффектов теплового стресса. Использование низкомолекулярных соединений, повреждающих ДНК, для индукции клеточного старения 146
4.4.2. Оптогенетические подходы для индукции клеточного старения in vitro
4.4.2.1. Общая характеристика оптогенетических подходов для индукции преждевременного клеточного старения 150
4.4.2.2. Повреждения ДНК, индуцируемые генетически-кодируемыми фотосенсибилизаторами tKR и miniSOG 152
4.4.2.3. Клеточное старение, индуцированное с помощью генетически кодируемых фотосенсибилизаторов 155
5. Заключение 159
5.1. Динамика и механизмы образования повреждений днк при тепловом стрессе 160
5.2. Фосфорилирование вариантного гистона h2ax в ответе клетки на стресс 165
5.3. Вариабельность клеточного ответа на тепловой стресс, зависящая от стадии клеточного цикла 167
5.4. Клеточное старение, индуцируемое тепловым стрессом и другими повреждающими днк
Агентами 170
Выводы 174
Список литературы 176
Благодарности
- Клеточный ответ на тепловой стресс
- Химические реактивы
- Оптимизация условий строгой синхронизации раковых и нормальных клеток человека
- Отложенный ответ клетки на тепловой стресс: последствия комплексного повреждающего действия теплового стресса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Функционирование клетки основано на скоординированной работе множества метаболических и сигнальных процессов, в которых участвуют такие макромолекулы, как ДНК, РНК, белки и липиды. Промежуточные и побочные продукты этих процессов часто являются повреждающими факторами, мишенями которых, в свою очередь, являются эти макромолекулы. В данной работе мы будем говорить о влиянии повреждающих воздействий (стрессов) на целостность и генома, и его функции. В этой связи следует упомянуть о том, что помимо эндогенных известно много типов экзогенных воздействий, которые имеют генотоксический эффект. Например, генотоксичными могут быть физические факторы, такие, как изменение температуры окружающей среды, ультрафиолетовое излучение, ионизирующая радиация, или химические соединения, такие, как ингибиторы ферментов (ДНК-топоизомераз, факторов, участвующих в репарации), алкилирующие ДНК агенты, рибонуклеотиды при их избытке и т.д. Клеточный ответ на стресс, в целом, направлен на устранение возникших повреждений макромолекул и/или элиминацию самих макромолекул при невозможности их репарации. Эта простая формулировка включает в себя большое количество специфических процессов, направленных на устранение различных типов повреждений нуклеиновых кислот, белков и липидов. Часто для обеспечения этих процессов происходит не только активация и/или изменение локализации репарационных факторов, но и запускается экспрессия определенных генов. Большое значение приобретает изучение роли эпигенетических факторов в реакции клетки на стресс. Это связано, в частности, с тем, что, принимая во внимание эпигенетическую составляющую клеточного ответа на стресс, можно приблизиться к пониманию механизмов его вариативности.
Одним из наиболее изученных факторов клеточного стресса, который, к тому же, может служить общей моделью для изучения реакции эукариотической клетки на стресс, является тепловой шок (тепловой стресс, гипертермия)1. Он представляет собой воздействие, в ходе которого организм, клеточный конгломерат и/или популяция клеток в культуре подвергаются действию высоких, отличающихся от их нормальных условий роста, температур. Терапевтическое действие высоких температур известно уже несколько тысячелетий, однако научно обоснованное использование гипертермии в медицине восходит к началу XX века. Несмотря на то, что в течение
1В то время как термины «тепловой стресс» и «тепловой шок» являются полными синонимами, термин «гипертермия» в большей степени относится к клинической практике применения высоких температур. Несмотря на это, в настоящей работе я буду использовать все три термина как полные синонимы.
десятилетий гипертермию с разной степенью успешности пытались применять в качестве адъюванта при радио- и химиотерапии опухолей, именно в последние 5-7 лет наблюдается серьезный рост интереса к этому подходу. Это, в первую очередь, связано с появлением новых материалов и развитием технологий для локальной и региональной гипертермии. В связи с этим важное значение приобретает всестороннее понимание эффектов теплового стресса, приводящих к сенсибилизации клеток к радио- и химиотерапии. К моменту начала наших исследований было понятно, что гипертермия оказывает влияние на процессы, протекающие в ядре клетки, такие как транскрипция, репликация, репарация. Однако, даже в случае наиболее изученной в этом плане транскрипции, не говоря уже о репликации и репарации ДНК, экспериментальные данные были разрозненны и противоречивы. Важным вопросом, не решенным на момент начала наших исследований, был вопрос о возможности индукции тепловым стрессом одно- (ОЦР) и двухцепочечных разрывов ДНК (ДЦР). Комплексное исследование эффектов теплового стресса, так или иначе связанных с процессами, протекающими в клеточном ядре, может способствовать разработке обоснованных стратегий использования гипертермии в клинической практике. Помимо этого, важно отметить, что механизмы клеточного ответа на различные стрессы являются достаточно универсальными. Так, например, одно из ключевых событий в клеточном ответе на тепловой шок - активация транскрипционного фактора HSF1 - характерно также для других типов воздействий, нарушающих белковый гомеостаз, а также для злокачественной трансформации клеток. Еще более справедливым это утверждение является в отношении различных генотоксических стрессов. Во многих случаях, исследуя тепловой стресс, возможно сделать и более общие, относящиеся не только к гипертермии, выводы.
Цели и задачи исследования. Эта работа была направлена на исследование немедленных и отложенных во времени эффектов теплового стресса, так или иначе связанных с процессами, протекающими в клеточном ядре.
В ходе работы были поставлены и решены следующие задачи:
-
Исследовать возможность индукции тепловым стрессом ОЦР. Идентифицировать механизмы индукции таких повреждений ДНК.
-
Изучить возможность индукции тепловым стрессом ДЦР. Определить кинетику образования и репарации индуцируемых тепловым стрессом ДЦР, механизмы их образования, а также эпигенетические события, сопутствующие их формированию.
-
Исследовать эффекты теплового стресса на репликацию ДНК, а также функциональное значение эпигенетических событий, сопутствующих этим эффектам.
-
Изучить динамику локализации структурных белков хроматина HP 1а и TRF2 в условиях теплового стресса.
-
Выяснить, способен ли тепловой стресс индуцировать преждевременное старение клеток человека нормального и опухолевого происхождения. Идентифицировать молекулярный механизм индуцированного тепловым стрессом клеточного старения.
-
Определить факторы и механизмы предпочтительной чувствительности клеток, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла, к тепловому стрессу.
-
Разработать подход для светозависимой индукции преждевременного старения клеток.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе проведено комплексное исследование эффектов теплового стресса, так или иначе связанных с процессами, протекающими в ядре эукариотической клетки.
Детально исследованы механизмы генотоксического действия теплового стресса. Продемонстрировано, что тепловой стресс может приводить к образованию ОЦР путем подавления активности фермента ДНК-топоизомеразы І (топої). Впервые показано, что тепловой стресс приводит к немедленному возникновению ДЦР в клетках, находящихся в G1- или в2-фазах клеточного цикла. Эти ДЦР маркируются ATM-зависимым фосфорилированием гистона Н2АХ и эффективно репарируются. Кроме того, в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла, тепловой стресс приводит к отложенному во времени образованию сложнорепарируемых ДЦР, которые возникают вследствие столкновения репликативных вилок с индуцированными тепловым стрессом топої-зависимыми ОЦР.
Впервые показано, что в зависимости от своей силы тепловой стресс может приводить либо к торможению, либо к полному аресту репликации ДНК. Впервые продемонстрировано, что фосфорилирование вариантного гистона Н2АХ, ассоциированное с индуцированным тепловым стрессом замедлением/арестом репликации ДНК, предотвращает немедленное образование ДЦР в S-фазе клеточного цикла при остром тепловом шоке.
Впервые охарактеризована динамика локализации структурных белков хроматина НР1а и TRF2 в условиях теплового стресса. Показано, что при тепловом стрессе белок HP la диссоциирует из центромер, а белок TRF2 - из теломер, что, однако, не влияет на структурную целостность
центромерного гетерохроматина и не приводит к активации репаративных систем на концах хромосом.
Установлено, что тепловой стресс способен индуцировать преждевременное старение нормальных и раковых клеток человека. Продемонстрировано, что фенотип клеточного старения развивается только в клетках, находившихся в ранней S-фазе в момент теплового стресса. Идентифицирован молекулярный механизм индуцированного тепловым стрессом преждевременного клеточного старения. Кроме того, показано, что в ранней S-фазе клеточного цикла тепловой стресс может индуцировать частичную ре-репликацию ДНК и амплификацию центросом, причиной чего может являться нарушение регуляции экспрессии факторов лицензирования репликации ДНК. На основании полученных данных сформулирована и верифицирована модель индукции преждевременного старения клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, согласно которой для развития клеточного старения достаточно образования небольшого количества ОЦР любого происхождения. На основании сформулированной нами модели разработан подход для светозависимой индукции преждевременного старения клеток с использованием генетически кодируемых фотосенсибилизаторов.
С практической точки зрения, данные, касающиеся генотоксического действия теплового стресса, важны для лучшего понимания клинически значимых эффектов гипертермии и разработки новых подходов для применения гипертермии в медицинской практике. Результаты, свидетельствующие о возможности индукции преждевременного старения клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, сверхмалыми концентрациями повреждающих ДНК низкомолекулярных соединений, могут быть востребованы при разработке новых и модификации существующих химиотерапевтических подходов и протоколов. Разработанный нами подход для светоиндуцируемой активации программы преждевременного клеточного старения может быть использован для исследования различных аспектов этого процесса.
Личный вклад автора. Экспериментальные данные были получены автором, либо под его непосредственным руководством. Автор осуществлял планирование экспериментов, выбор методов, анализ, обобщение и подготовку результатов к публикации.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах и представлены автором на российских и международных симпозиумах и конференциях: EMBO conference «The DNA damage response in cell physiology and
disease» (2015, Greece), EMBO conference on Nuclear Structure and Dynamics (2013, France), EMBO conference on Chromatin and Epigenetics (2013, Germany), VII International meeting «From Molecular to Cellular Events in Human Pathologies» (2014, Latvia), International conference for young scientists «Molecular Control of Gene Expression» (2015, Russia), XVII Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (2014, Россия), Международная конференция «Хромосома 2012» (2012, Россия).
По теме диссертации опубликовано 22 печатных работы - 15 статей в рецензируемых научных журналах и 7 тезисов докладов на конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение») и выводов. Работа изложена на 214 страницах, содержит 55 рисунков. Список литературы включает 456 источников.
Клеточный ответ на тепловой стресс
Лечебные свойства высоких температур были известны еще 5000 лет назад. Первое упоминание использования тепла в медицинских целях датируется 27-ым веком до н.э.: раскаленные лезвия или палочки использовали в Древнем Египте для удаления рака груди. Существуют свидетельства использования тепла в терапевтических целях в древнем Китае и Индии. Гиппократ также использовал гипертермию для лечения рака груди. Однако, в Древней Греции знали и о других терапевтических свойствах умеренной гипертермии, характерной для лихорадки/жара. Есть данные о том, что на протяжении веков в Древней Греции и в Римской Империи использовали умеренную гипертермию для лечения целого спектра заболеваний (Hurwitz&Stauffer, 2014; van den Tempel et al., 2016). В XIX веке использование гипертермии получило определенные доказательные основания. В частности, многими врачами было отмечено, что размер опухоли уменьшается после перенесенной пациентом фебрильной и/или пиретической лихорадки, наблюдающихся при малярии и рожистой болезни (erysipelas). Работавший во второй половине XIX века немецкий хирург Ф. Фелайзен даже заражал больных раком пациентов бактериями, вызывающими рожистую болезнь, чтобы удалить опухоль. Для тех же целей американский хирург и исследователь рака У.Б. Коли использовал токсин, названный в последствие в его честь (van den Tempel et al., 2016). Примерно в то же время для лечения рака стали использовать и радиотерапию, а в 1910-1912 г.г. были даже опубликованы результаты клинического исследования совместного использования радиации и гипертермии (Muller, 1910, 1912). Сто пациентов с различными видами злокачественных новообразований лечили с использованием радиации и диатермии – глубокого локального прогревания тканей с помощью электрического тока. У 32 пациентов произошла полная регрессия, еще у 32 – наблюдалось временное улучшение (Muller, 1912). В 1935 году было опубликовано клиническое исследование совместного использования гипертермии и рентгеновского излучения, результатом которого стало существенное улучшение, наблюдаемое у 29 из 32 больных раком пациентов (Warren, 1935). Эти и другие клинические исследования послужили толчком для изучения всех аспектов действия гипертермии на организм и отдельные клетки. В настоящее время тепловой стресс используется для сенсибилизации клеток не только при радиотерапии, но и при химиотерапии. На чем основано сенсибилизирующее действие гипертермии и почему нам стоит продолжать исследования этого вопроса я попробую рассказать в этой главе.
Одним из первых обнаруженных физиологических изменений, вызываемых гипертермией, стало ее влияние на сосудистую систему. Тепловой стресс приводит к увеличению кровотока в нагреваемой области, а также увеличивает проницаемость сосудов (Reinhold&Endrich, 1986; Song et al., 2005). Считается, что большинство физиологических эффектов гипертермии являются следствием ее воздействия на опухолевый кровоток (Jain et al., 1979; Patterson&Strang, 1979). Сразу после воздействия гипертермией опухолевый кровоток увеличивается, однако степень усиления и продолжительность такого эффекта в большой степени зависят от использованной температуры и типа новообразования (Reinhold&Endrich, 1986; van den Tempel et al., 2016). Примитивная организация кровеносных сосудов опухоли делает их более проницаемыми по сравнению с нормальными сосудами. Таким образом, при индуцированном тепловым стрессом усилении кровотока в опухоли жидкость может просачиваться из сосудов во внеклеточное пространство (Vaupel et al., 1990). Образовавшийся отек может привести к возрастанию внутритканевого давления жидкости и, как следствие, к сжатию сосудов и ухудшению кровоснабжения (Maeta et al, 1989; Muller-Klieser&Vaupel, 1984). Помимо этого, при температурах, превышающих 44.5С, происходит гибель эндотелиальных клеток, что приводит к повреждению сосудов и кровотечениям, еще более ухудшающих кровоснабжение опухоли (Fajardo et al, 1985; Reinhold&Endrich, 1986). После нормализации температуры кровоток, обычно, восстанавливается, однако, он продолжает падать в опухолях, в которых тепловой стресс индуцировал повреждение сосудов (Muller-Klieser&Vaupel, 1984; Song et al, 1987).
Примитивность сосудистой системы опухоли часто приводит к тому, что при росте новообразования появляются участки с пониженным содержанием кислорода и питательных веществ, высоким уровнем молочной кислоты и внеклеточным ацидозом (Dewhirst et al, 2008). В зависимости от использованной температуры, гипертермия может по-разному сказываться на параметрах микроокружения клеток в опухоли. Так, индуцированные высокотемпературной гипертермией повреждения кровеносной системы опухоли могут привести к еще большему ухудшению доставки кислорода и питательных веществ в опухоль, что выражается в накоплении молочной кислоты, увеличении кислотности, гипоксии (Lee et al, 1986; Otte et al, 1982; Vaupel et al, 1990). Наблюдающееся при умеренной гипертермии увеличение кровоснабжения усиливает доставку кислорода в опухоль и, соответственно, увеличивает его потребление (Iwata et al, 1996; Lepock et al, 1987; Otte et al, 1982; Song et al, 2009), что, как это ни странно, может теоретически также привести к гипоксии опухолевой ткани.
Химические реактивы
Если активации экспрессии стресс-индуцируемых генов никогда не вызывала особых вопросов, то утверждение о глобальной репрессии транскрипции, происходящей при тепловом стрессе, до недавнего времени было не столь однозначно. Попытка разобраться, на чем основано такое мнение, приведет нас к нескольким достаточно старым экспериментальным работам (Caizergues-Ferrer et al., 1980; Findly&Pederson, 1981; Gilmour&Lis, 1985; O Brien&Lis, 1993). Более того, почти все исследования, свидетельствующие о глобальном падении уровня транскрипции в клетке при тепловом шоке, проведены с использованием клеток Drosophila (Findly&Pederson, 1981; Gilmour&Lis, 1985; O Brien&Lis, 1993). Это важно учитывать, поскольку предполагаемые механизмы транскрипционной репрессии в клетках Drosophila и млекопитающих могут существенно отличаться (Li et al., 2015; Teves&Henikoff, 2011, 2013). Гораздо меньше экспериментальных данных, демонстрирующих глобальное падение транскрипционной активности в клетках млекопитающих (Caizergues-Ferrer et al., 1980; Hieda et al., 2005). Было показано, что тепловой стресс ингибирует синтез рРНК и пре-мРНК, но не сказывается на продукции «низкомолекулярной РНК» (транскрипты РНК-полимеразы III) (Caizergues-Ferrer et al., 1980). В той же работе было продемонстрировано, что in vitro все РНК-полимеразы в разной степени, но сохраняют после теплового стресса свою активность (Caizergues-Ferrer et al., 1980). В нескольких независимых исследованиях, проведенных с помощью технологии ДНК-чипов, было показано, что при тепловом стрессе клеток млекопитающих подавляется (более чем в 2 раза) экспрессия всего нескольких сотен генов (Furusawa et al., 2011; Murray et al., 2004; Sonna et al., 2002; Tabuchi et al., 2008; Zhou et al., 2007). Количество и спектр генов, экспрессия которых подавляется при тепловом стрессе, также зависят от типа клеток и температуры. Согласно нескольким исследованиям списки генов, экспрессия которых падает при тепловом стрессе, достоверно обогащены факторами, связанными с регуляцией экспрессии генов, клеточным циклом, клеточной смертью (Furusawa et al., 2011; Tabuchi et al., 2008). На сегодняшний день, можно говорить о том, что работа Дж. Лиса внесла ясность и в этот вопрос. Как уже говорилось в предыдущей главе, при тепловом стрессе происходит прогрессивное уменьшение уровня экспрессии около 8 тысяч генов (Mahat et al., 2016). Хотя на основании полученных данных Дж. Лисом и соавторами было выдвинуто предположение о том, что основным механизмом репрессии транскрипции при тепловом стрессе является подавление перехода паузированной рядом с промотором РНК-полимеразы к продуктивной элонгации, до конца не ясен механизм такого ингибирования, а также не понятно, единственный ли это способ репрессии, реализуемый при тепловом стрессе.
На сегодняшний день наиболее изучен механизм репрессии при тепловом стрессе транскрипции РНК-полимераза II – зависимых генов, связанный с функционированием двух некодирующих РНК – транскриптов коротких диспергированных повторов (SINE, short interspersed elements (Kramerov&Vassetzky, 2011)) мыши и человека. Давно было замечено, что зависимая от РНК-полимеразы III экспрессия коротких некодирующих РНК не только не падает при тепловом стрессе (Caizergues-Ferrer et al., 1980), но в некоторых случаях быстро и значительно возрастает. В частности, в ответ на тепловой стресс увеличивается транскрипция B1 и B2 SINE мыши, и Alu-повторов человека (Fornace&Mitchell, 1986; Li et al., 1999; Liu et al., 1995). Важно отметить, что активация при тепловом стрессе экспрессии B1 и B2 SINE носит специфический характер, так как продукция других зависимых от РНК-полимеразы III РНК не увеличивается (Liu et al., 1995). В лаборатории Дж. Гудрич и Дж. Кугель было определено функциональное значение такого повышения экспрессии SINE, и открыт и исследован механизм SINE-41 зависимой транскрипционной репрессии (Kugel&Goodrich, 2012; Ponicsan et al., 2010). Было, в частности, показано, что В2 и Alu РНК напрямую связываются с РНК-полимеразой II, образуя кинетически стабильные комплексы, и тем самым подавляют транскрипцию некоторых белок-кодирующих генов (рис. 2.6) (Allen et al., 2004; Espinoza et al., 2007; Mariner et al., 2008). В подвергнутых тепловому стрессу клетках млекопитающих эти РНК обнаруживаются в комплексе с РНК-полимеразой на
Оптимизация условий строгой синхронизации раковых и нормальных клеток человека
В работе были использованы следующие антитела: кроличьи поликлональные и мышиные моноклональные антитела против гистона H2AX (Active Motif, Abcam и Upstate/Millipore); кроличьи поликлональные и мышиные моноклональные антитела против 5-бромдезоксиуридина (Rockland и Chemicon/Millipore); кроличьи поликлональные антитела против циклина B1 (Santa-Cruz), гистона H3 (Abcam), гистона H3K9me3 (Active Motif), ДНК-топоизомеразы I (Abcam), белков 53BP1 (Santa-Cruz Biotechnologies), GM 130 (Cell Signaling) и p21 (Cell Signaling); мышиные моноклональные
5Исчерпывающее описание всех использованных методик можно найти в научных статьях, опубликованных по теме диссертации. антитела против HP1 (Abcam), Rad51 (Abcam), ламина В1 (Abcam), TRF2 (были любезно предоставлены М.П. Светловой, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург); человеческие аутоиммунные антитела против белка CENP-A (были любезно предоставлены О.В. Зацепиной, Институт биоорганической химии РАН, Москва). В иммуноцитохимических экспериментах первичные антитела выявляли вторичными антителами против мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированными с Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 555 (Molecular Probes), а также антителами против иммуноглобулинов человека, конъюгированными с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC). Для проведения Вестерн-блот-анализа использовали вторичные антитела против мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham/GE Healthcare).
Реактивы общего назначения: NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, CoCl2, CuSO4, ZnSO4, NaHCO3, Na2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4, ЭДТА, ЭГТА, глицин, глицерин, какодилат Na, HEPES, PIPES, трис, додецилсульфат Na, дезоксихолат Na, мочевина, борная кислота, ледяная уксусная кислота, соляная кислота, этанол, метанол, хлороформ, бромистый этидий, йодистый пропидий, SYBR Green I, Тритон X-100, Tween 20, сахароза, параформальдегид, дитиотриэтол (ДТТ), -меркаптоэтанол, диметилсульфоксид (ДМСО), бычий сывороточный альбумин (БСА), агароза (Sigma), легкоплавкая агароза (Sigma), коктейль ингибиторов протеаз (Fermentas, Pierce), коктейль ингибиторов фосфатаз (Sigma), фенилметилсульфонилфторид (Sigma), ингибитор рибонуклеаз (Fermentas); 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT, Sigma); трипановый синий; 5-бромо-2-дезоксиуридин (BrdU, Sigma), 5-этинил-2-дезоксиуридин (EdU, Invitrogen), дробленная ДНК спермы лосося, Cot-1 фракция ДНК человека, тРНК, 5-флуороурацил (5-66 FU, Sigma-Aldrich), 4,6-диамино-2-фенилидол (DAPI), реактив для заключения препаратов «Dako fluorescent mounting medium» (Dako/Invitrogen), акриламид, N,N,-метилен-бис-акриламид (Serva), реагент Брэдфорд (Sigma-Aldrich).
Низкомолекулярные генотоксические агенты и ингибиторы: афидиколин (Sigma-Aldrich), гидроксимочевина (Sigma-Aldrich), камптотецин (Sigma-Aldrich), этопозид (VP16) (Sigma), кофеин (Sigma-Aldrich), ингибитор ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) NU7026 (Tocris Bioscience), ингибитор ATM KU55933 (Tocris Bioscience), ингибитор протеосомной активности MG132 (Sigma-Aldrich), -аманитин (Sigma-Aldrich), перекись водорода (Merck), тимидин (Sigma-Aldrich).
Реактивы для культивирования клеток: модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM, Панэко) с 10% фетальной сыворотки теленка (FBS) (HyClone/GE Healthcare); раствор Версена и раствор трипсина (Панэко); фетальная сыворотка теленка (HyClone/ GE Healthcare); антибиотики ампициллин, стрептомицин и гентамицин; пируват натрия; глутамат натрия (Sigma-Aldrich), фактор роста фибробластов.
Ферменты: пепсин (Sigma-Aldrich), дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I, Sigma-Aldrich), рибонуклеаза А (Fermentas), протеиназа К (Sigma-Aldrich), Taq-полимераза (Sibenzyme), обратная транскриптаза ВЛММ (Fermentas), ДНК-полимераза I E.coli (Fermentas); терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) (Fermentas).
Наборы: набор для иммунодетекции вестерн-блотов (Pierce), набор для флуоресцентной детекции включения EdU в ДНК «Click-iT EdU Imaging kit» (Invitrogen), наборы малых интерферирующих РНК (миРНК) для подавления экспрессии DNA-PKcs, ATM, ATR и топо1 (Santa-Cruz Biotechnologies), реагент для выделения РНК «TRIzol» (Invitrogen), реагент для выделения ДНК «DNAzol» (Invitrogen), реактив для трансфекции миРНК Turbofect (Fermentas), наборы для определения трипсин- и химотрипсин подобных активностей протеосомы Proteasome-Glo (Promega), набор для выделения и очистки плазмидной ДНК QIAGEN Plasmid Midi Kit (Sigma-Aldrich). Растворы: PBS, 7 мМ Na2HP04, 1.5 мМ КШРСч, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1; CSK, 10 мМ PIPES pH 7.0, 1% параформальдегид, 2.5% Тритон Х-100, 100 мМ NaCl, 0.3 М сахароза, 1.5 мМ MgCh. Последовательности использованных в работе олигонуклеотидов приведены в соответствующих научных статьях, опубликованных по теме диссертации.
Отложенный ответ клетки на тепловой стресс: последствия комплексного повреждающего действия теплового стресса
Хотя тепловой стресс часто рассматривают только как физический стресс-фактор, действующий на структуру белков, становится все более очевидно, что это некоторое упрощение. Действительно, есть сигнальные каскады, которые активируются при гипертермии и которые напрямую связаны с количеством неправильно свернутых белков в клетке. К таковым, например, относится способ активации HSF1 и связанное с этим увеличение экспрессии HSPs (Anckar&Sistonen, 2011). В то же время, очевидно, что есть индуцируемые гипертермией процессы, которые не зависят от ее протеотоксического эффекта. В качестве примера можно привести репрессию транскрипции, происходящую при тепловом стрессе и опосредованную действием РНК, кодируемой SINE-элементами (Allen et al., 2004; Mariner et al., 2008). Кроме того, есть данные о том, что гипертермия может не только нарушать структуру белков, но также и влиять на их внутриклеточную локализацию (Vanderwaal et al., 2009; Wang et al., 2001). Так, для двух ядрышковых белков – нуклеолина и нуклеофосмина – было показано, что в условиях гипертермии они транслоцируются из ядрышка в нуклеоплазму (Vanderwaal et al., 2009; Wang et al., 2001). Роль индуцированной тепловым стрессом транслокации нуклеолина была изучена: оказалось, что в нуклеоплазме он может связываться с белком RPA и, таким образом, предположительно, ингибировать репликацию ДНК (Wang et al., 2001). В этой главе речь пойдет о двух других структурных белках хроматина, центромерном белке HP1 и белке теломер TRF2, изменение локализации которых при тепловом стрессе было обнаружено нами.
Динамика локализации теломерного белка TRF2 в условиях теплового стресса Теломеры - это защитные нуклеопротеиновые комплексы на концах хромосом, которые представляюет собой t-петли, дополнительно стабилизированную белковым шелтериновым комплексом (Armanios&Blackburn, 2012; de Lange, 2004, 2005). Теломеры в клетках человека могут также содержать и нешелтериновые белки, такие, например, как ReqQ-хеликазы, танкиразы, PARP2, ERCC1/XPF и др. (Dantzer et al, 2004; de Lange, 2005; Machwe et al, 2004; Smith&de Lange, 2000; Zhu et al, 2003). В отличие от перечисленных выше белков, функции факторов, входящих в состав шелтеринового комплекса, ограничены поддержанием целостности теломер, а их локализация в ядре почти всегда строго теломерная (Diotti&Loayza, 2011). Из шести шелтериновых белков только TRF1, TRF2 и РОТІ способны напрямую связываться с теломерными повторами, при этом считается, что роль TRF2 в поддержании структуры теломер наиболее принципиальна (Okamoto et al, 2013). Так, известно, что что укорочение теломер, ведущее к невозможности привлечения TRF2, а также уменьшение уровня экспрессии и/или изменение локализации TRF2 приводит к снятию защиты с теломер, распознаванию концов хромосом в качестве ДЦР и запуску клеточного ответа на повреждение ДНК (DDR, DNA damage response) (Denchi&de Lange, 2007; Takai et al, 2003). Такой DDR, включающий обычно фосфорилирование H2AX и привлечение таких факторов, как 53ВР1 и MDC1, ведет к репарации этих мнимых ДЦР, результатом чего является слияние концов хромосом (van Steensel et al, 1998). Мы проанализировали, что происходит с белком TRF2 в условиях теплового стресса, а также попытались выяснить не связано ли обнаруженное нами фосфорилирование Н2АХ, происходящее при тепловом стрессе, с разворачиванием теломерной петли.
Исследование стабильности шелтеринового комплекса (и, соответственно, теломер) в условиях теплового стресса (45.5С, 30 мин) мы начали с определения динамики локализации фактора TRF2. Специфичность антител против TRF2 была проверена с помощью иммуноокрашивания препарата митотических хромосом (рис. 4.15A). Мы продемонстрировали, что как в раковых (MCF7), так и в нормальных (эмбриональные фибробласты человека) клетках тепловой стресс приводит к диссоциации основного пула TRF2 из теломер и его перераспределению в нуклеоплазму (рис. 4.15B). Интересно, что эта диссоциация не связана с масштабной деградацией TRF2 (рис. 4.15C). На основании полученных данных можно было предположить, что в условиях теплового стресса, индуцирующего диссоциацию TRF2, должен происходить
Динамика локализации белка TRF2 в условиях теплового стресса. (A) Непрямой иммунофлуоресцентный анализ человеческого TRF2 на метафазных пластинках контрольных (необработанных) клеток MCF7. Во вкладке показаны увеличенные хромосомы. (B) Локализация TRF2 в ядрах контрольных и подвергнутых тепловому стрессу (45.5С, 30 мин) клеток MCF7 и нормальных фибробластов человека (HF). ДНК окрашивали с помощью DAPI. М.п. 15мкм. (C) Вестерн-блот-анализ количества TRF2 в контрольных клетках MCF7 и в клетках, подвергнутых действию теплового стресса (45.5С, 30 мин). В качестве контроля нанесения использован ламин В1. запуск DDR, локализованного на концах хромосом (теломерах). Чтобы проверить это, мы иммуноокрашивали клетки MCF7, подвергнутые действию гипертермии, антителами против двух наиболее важных участников DDR, 53ВР1 и Н2АХ. Известно, что в норме клетки содержат 1-3 крупных фокусов 53ВР1, которые маркируют персистирующие ДЦР (рис. 4.16А и (Harrigan et al, 2011; Lukas et al, 2011)). Мы показали, что в результате действия теплового стресса (45.5С, 30 мин) такие фокусы полностью исчезают и при этом не появляется других фокусов 53ВР1, в частности, маркирующих теломеры (рис. 4.16А). Для того чтобы определить не связано ли индуцированное тепловым стрессом фосфорилирование Н2АХ с дестабилизацией теломер мы провели две серии экспериментов. Во-первых, мы иммуноокрасили клетки MCF7, подвергнутые действию гипертермии, антителами против TRF2 и Н2АХ, и не обнаружили существенной колокализации этих факторов (рис. 4.16В). Здесь надо отметить, что в этом эксперименте были использованы более мягкие условия теплового стресса (45.5С, 10 мин), при которых фокусы Н2АХ уже собраны, а TRF2 еще не полностью диссоциировал. Полученные данные были также подтверждены в эксперименте с использованием обычных условий гипертермии (45.5С, 30 мин), в котором Н2АХ выявлялся с помощью специфических антител, а теломеры метились с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (рис. 4.16С). Таким образом, можно заключить, что индуцированная тепловым стрессом диссоциация белка TRF2 не приводит к запуску DDR на концах хромосом, а индуцированное гипертермией фосфорилирование Н2АХ не связано с повреждением теломер.