Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1 РНК-полимеразы и транскрипция РНК-полимеразой III 13
1.1.1 Основной комплекс транскрипции РНК-полимеразы III 13
1.1.2 Известные транскрипционные факторы, участвующие в регуляции транскрипции мяРНК 16
1.1.3 Транскрипционные факторы, ассоциированные с генами мяРНК 18
1.2 Транскрипция РНК-полимеразой II 19
1.2.1 Коактиваторный комплекс SAGA 20
1.2.1.1 Структурный модуль TAF комплексов SAGA и TFIID 21
1.2.1.2 Гистон ацетилтрансферазный модуль (HAT) комплексов SAGA, ADA и ATAC 22
1.2.1.3 TRA1/TRRAP - общая субъединица для комплексов SAGA и NUA4/TIP60 24
1.2.1.4 Субъединицы SAGA комплекса - участники процесса сплайсинга 25
1.2.1.5 Варианты деубиквитинирующего модуля (DUB) гистонов SAGA комплекса 25
1.3 Краткий обзор формирования компетентной к экспорту мРНК 31
1.3.1 Транскрипционно-ассоциированное формирование мРНП частицы 31
1.3.2 Сплайсинг-связанное формирование мРНП 34
1.3.3 Компактизация мРНП во время процессинга 34
1.3.4 Механизм защиты от экспорта дефектных мРНК 35
1.4 Общий обзор формирования мРНП частицы 36
1.4.1 Формирование 5 CAP 36
1.4.2 Состав TREX комплекса 37
1.4.3 Функция TREX комплекса 41
1.4.4 Prp19 45
1.4.5 Клеточная функция Prp19 48
1.5 Экспорт РНК 54
1.5.1 Экспорт рРНК 57
1.5.2 Экспорт тРНК 57
1.5.3 Экспорт длинных некодирующих РНК (днРНК) 59
1.5.4 Экспорт микроРНК 59
1.5.5 Экспорт мРНК 60
1.5.5.1 Формирование комплекса NXF1-зависимого экспорта мРНК 60
1.5.5.2 Формирование комплекса Crm1-зависимого экспорта мРНК 64
1.5.6 TREX-2 65
2. Материалы и методы 74
2.1 Реактивы 74
2.2 Базы данных, программное обеспечение 74
2.3 Среды для выращивания бактерий и культуры клеток D. melanogaster 74
2.3.1 Жидкая среда для выращивания бактерий 74
2.3.2 Питательная твердая агаризованная среда для выращивания бактерий 74
2.3.3 Среда для культуры клеток D. melanogaster 74
2.4 Биохимические методы 75
2.4.1 Работа с бактериями 75
2.4.2 Работа с S2 клетками D. melanogaster 77
2.4.3 Работа с ДНК 79
2.4.4 Работа с белками 83
2.4.5 Работа с РНК 88
2.4.6 Иммуноокрашивание 92
2.4.7 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 93
2.5 Генетические линии 97
2.6 Генетические скрещивания, фенотипический анализ мутантов 98
3. Результаты 99
3.1 Роль Sgf11- и ENY2-содержащего комплекса SAGA в Pol III зависимой транскрипции 99
3.1.1 SAGA присутствует на генах малой ядерной РНК (мяРНК) и взаимодействует с комплексом PBP, основным регулятором транскрипции мяРНК 100
Получение антител к белкам комплекса SAGA 100
Колокализация Sgf11 и PBP комплексов на политенных хромосомах, выделенных из слюнных желез D. melanogaster 101
Взаимодействие белков SAGA комплекса с комплексом транскрипции генов мяРНК, PBP 104
3.1.2 SAGA присутствует на промоторах Pol III-зависимых генов и взаимодействует с аппаратом транскрипции РНК-полимеразы III 105
Колокализация SAGA и комплекса базальной транскрипции РНК-полимеразы III на хромосомах, выделенных из слюнных желез D. melanogaster 105
SAGA присутствует в промоторных областях генов, транскрибируемых РНК полимеразой III 106
Взаимодействие белков комплекса SAGA с комплексом базальной транскрипции РНК-полимеразы III 107
3.1.3 Комплекс SAGA участвует в транскрипции Pol III-зависимых генов 109
Мутации генов, кодирующих субъединицы SAGA, понижают уровень транскрипции генов-мишеней РНК-полимеразы III 109
Мутации генов, кодирующих субъединицы SAGA, влияют на привлечение фактора базальной транскрипции РНК-полимеразы III - Brf1 112
Мутации генов, кодирующих субъединицы SAGA, влияют на изменение статуса моноубиквитинилироания H2B 112
3.2 Роль транскрипционного фактора Sgf11 в Pol II-зависимой транскрипции 113
3.2.1 Белок Sgf11 присутствует в составе нескольких транскрипционных комплексов 113
3.2.2 Sgf11 ассоциирован с белком Cbp80, субъединицей CAP-связывающего комплекса 115
3.2.3 Cbp80 необходим для привлечения Sgf11 на промотор гена 117
Sgf11 привлекается в промоторную область гена теплового шока hsp70 после активации транскрипции 117
3.3 Участие транскрипционного фактора ENY2 в Pol II-зависимой транскрипции 120
3.3.1 Участие ENY2 и комплекса THO в элонгации транскрипции 121
3.3.1.1 ENY2 и комплекс THO D. melanogaster рекрутируется в кодирующую область hsp70 после активации транскрипции 121
3.3.1.2 ENY2 участвует в привлечении THO на ген hsp70 123
3.3.1.3 В процессе элонгации транскрипции ENY2 и комплекс THO взаимодействуют с новосинтезированной мРНК 124
3.3.1.4 Нокдаун ENY2, как и нокдаун субъединиц комплекса THO приводит к нарушению процессинга 3 -концов hsp70 мРНК 126
3.4 Роль Sgf11 и ENY2 и ассоциированных с ними белков в ядерном экспорте мРНК 129
3.4.1 Характеристика ENY2-содержащего комплекса TREX-2 129
3.4.1.1 У D. melanogaster существует несколько изоформ XMAS, основного белка комплекса TREX-2 129
3.4.1.2 Выделение ENY2-содержащего комплекса TREX-2 132
3.4.1.3 Выявление субъединиц ORC и TREX-2, участвующих во взаимодействии комплексов 134
3.4.1.4 Анализ взаимодействия Orc3 с Xmas-2 и ENY2 субъединицами комплекса TREX-2 136
3.4.1.5 Взаимодействие TREX-2 и ORC на генетическом уровне 138
3.4.1.6 ORC и TREX-2 колокализуются с комплексом ядерной поры 139
3.4.1.7 TREX-2 опосредует взаимодействие ORC с комплексом мРНП 141
3.4.1.8 ORC участвует в организации взаимодействия рецептора ядерной поры NXF1 с мРНП 144
3.4.1.9 Нокдаун субъединиц ORC нарушает ядерный экспорт мРНК 146
3.4.2 Роль Sgf11 в ядерном экспорте мРНК 149
3.4.2.1 Sgf11 ассоциирован с мРНП частицей 149
3.5 Анализ взаимодействия ENY2- и SGF11-содержащих комплексов с мРНК 151
4. Обсуждение 156
Выводы 164
Список сокращений 165
Список литературы 166
- Основной комплекс транскрипции РНК-полимеразы III
- Формирование комплекса NXF1-зависимого экспорта мРНК
- Колокализация Sgf11 и PBP комплексов на политенных хромосомах, выделенных из слюнных желез D. melanogaster
- Анализ взаимодействия ENY2- и SGF11-содержащих комплексов с мРНК
Основной комплекс транскрипции РНК-полимеразы III
Для транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой III необходим транскрипционный фактор IIIB (TFIIIB), который рекрутирует РНК-полимеразу III к её генам-мишеням. TFIIIB состоит из трех субъединиц, каждая из которых необходима для функций TFIIIB in vitro: TBP (TATA-binding protein), BDP1 – большой SANT-домен-содержащий белок и TFIIB-related factors BRF1 или BRF2. Было показано, что BRF1 входит в состав TFIIIB в том случае, если мишенями для РНК-полимеразы III являются гены с промоторным элементом, расположенным внутри области транскрипции, такие, как тРНК, в то время как в генах с промоторами, расположенными выше от сайта инициации, таких как гены U6 мяРНК, в состав TFIIIB входит BRF2 (Schramm and Hernandez 2002). Однако, надо отметить, что у D. melanogaster существует только Brf1, а Brf2 нет, поэтому Brf1 D. melanogaster входит в состав всех комплексов TFIIIB. У человека совпадения между мишенями BRF1 и BRF2 не бывает. Большинство Pol III-транскрибируемых генов, например тРНК, имеют внутренние промоторы, где ключевые промоторные элементы состоят из двух блоков последовательностей (А и В), расположенных внутри области транскрипции. А и В блоки распознаются транскрипционным фактором IIIC (TFIIIC). TFIIIC рекрутирует TFIIIB, который в свою очередь состоит из субъединиц BRF1, BDP1, TBP. Меньшая часть Pol III-транскрибируемых генов, например гены U6 мяРНК, имеют промотор, располагающийся выше от области транскрипции. Эти промоторы содержат TATA-box и PSE элемент. С последовательностью TATA-box связывается TBP, а с PSE связывается комплекс PBP (SNAP) (Рис. 1) (White 2011).
Малые ядерные РНК – мяРНК, являются некодирующими молекулами РНК, которые экспрессируются на высоком уровне в эукариотических клетках, каждая из них является продуктом своей собственной независимой транскрипционной единицы. мяРНК вовлечены во множество необходимых клеточных функций, таких как пре-мРНК сплайсинг, рРНК процессинг и формирование 3 конца гистоновой мРНК (Sharp 1994)(Kass et al. 1990; Bond et al. 1991). У животных, большинство мяРНК (U1-5, U7 и другие) синтезируются РНК-полимеразой II, в то время как другие малые РНК (U6, 7SK, tRNA, H1 и MRP) синтезируются РНК-полимеразой III (Hung and Stumph 2011).
Несмотря на синтез различными полимеразами, гены, кодирующие все мяРНК имеют очень похожую структуру. У животных, промоторы мяРНК характеризуются элементом DSE, и уникальным и необходимым промоторным элементом, названным proximal sequence element (PSE), у D. melanogaster этот элемент называется PSEA (Zamrod et al. 1993).
PSE всех генов мяРНК распознается и связывается одними и теми же эволюционно консервативными транскрипционными факторами, комплексом PBP - PSE-binding protein комплекс (другое его название - SNAP). Взаимодействие комплекса PBP с PSE инициирует привлечение Pol II- или Pol III-специфичных факторов транскрипции мяРНК (Schramm et al. 2000; Sadowski et al. 1993; Teichmann et al. 2000; Das et al. 2005; Cabart and Murphy 2001, 2002).
Клетки позвоночных и D. melanogaster являются основными модельными объектами, на которых изучают транскрипцию мяРНК высших эукариот. Промоторы мяРНК D. melanogaster обладают большей степенью консерватизма (как в последовательности, так и в расположении промоторных элементов), чем это показано у других организмов, в частности, у позвоночных (Jawdekar and Henry 2008)(Hernandez et al. 2007). Поэтому, молекулярные взаимодействия, которые участвуют в активации генов мяРНК и специфичность действия РНК полимеразы изучаются у D. melanogaster, а не на других моделях.
Сравнение ДНК последовательностей различных генов малых ядерных РНК у D. melanogaster выявило консервативные блоки последовательностей (промоторных элементов), располагающихся выше от старта транскрипции генов мяРНК (Beck et al. 1984; Das et al. 1987; Lo and Mount 1990; Saba et al. 1986). Функциональность этих консервативных элементов была последовательно показана in vitro и in vivo (Рис. 2).
У генов мяРНК D. melanogaster, транскрибируемых Pol II существует промоторный элемент – PSEB, находящийся на расстоянии 8 п.н. ниже от PSEA. Гены мяРНК, транскрибируемые Pol III, содержат последовательность TATA-box вместо PSEB. PSEA (PSE) D. melanogaster является общим промоторным элементом для всех типов мяРНК. Это последовательность длиной 21 п.н., располагающаяся внутри более обширной специфической области, находящейся на расстоянии 40-65 п.н. выше от сайта старта транскрипции. PSEA D. melanogaster является наиболее важной частью промоторов, необходимой для специфичности сайта старта транскрипции и промоторной активности мяРНК (Zamrod and Stumph 1990; Jensen et al. 1998; Lai et al. 2005).
Сравнение последовательностей PSEA мяРНК, транскрибируемых Pol II, и PSEA мяРНК, транскрибируемых Pol III, выявило как сходные, так и различающиеся части последовательности. 5 часть PSEA очень консервативна среди PSEA промоторов генов, транскрибируемых обеими полимеразами. В то же время PSEA значительно отличаются друг от друга своими 3 частями, особенно нуклеотидными позициями в положениях 19 и 20, обозначенных как Xs в консенсусной последовательности PSEA (Jensen et al. 1998; Hernandez et al. 2007) (Рис. 3).
Интересно, что различия в 3 части PSEA играют ключевую роль в определении специфичности РНК-полимераз в генах мяРНК D. melanogaster. Замещение только трёх нуклеотидных пар в PSEA U1, на специфичные для U6 полностью меняет специфичность РНК-полимераз с Pol II на Pol III, даже в отсутствии TATA-box последовательности (Jensen et al. 1998).
Формирование комплекса NXF1-зависимого экспорта мРНК
NXF1 для повышения сродства к своим РНК-мишеням использует адаптерные белки. Основной партнёр NXF1, белок NXT1, с которым он формирует гетеродимер. Самый известный адаптерный белок NXF1 - Yra1, РНК-связывающий белок комплекса TREX, который непосредственно связывается с аргинин-глицин богатой областью N-концевого домена Mex67. Связывание мРНК дрожжей TREX транскрипционно-зависимо, в то время как TREX человека рекрутируется на мРНК сплайсинг-зависимым способом (Strasser et al. 2002; Masuda et al. 2005; Reed and Cheng 2005). И у дрожжей и у человека известны другие адаптеры - три SR белка, которые участвуют в привлечении Nxf1 к сплайсированной мРНК (Katahira et al. 2009; Lei et al. 2011). Неизвестно, регулируют ли различные адаптеры экспорт специфичного набора мРНК.
Интересно, что Mex67 S. pombe не является необходимым для экспорта мРНК, а оверэкспрессия spMex67 ингибирует экспорт мРНК (Yoon et al. 2000). Функции spMex67p у S. pombe выполняет белок Rae1 (Brown et al. 1995). Функции белка Nxt1 до сих пор неясны. Показано, что Nxt1 стимулирует связывание Nxf1-РНК комплекса с нуклеопорином p62, а мутанты по Nxf1, неспособные связывать Nxt1, не могут экспортировать мРНК у человека (Lvesque et al. 2001). Было показано, что Nxt1 необходим для экспрессии специфичных для семенников транскриптов у D. melanogaster (Caporilli et al. 2013). Также предполагается, что Nxt1 вовлечен в Crm1-опосредованный экспорт. Nxt1 может связывать ГТФазу Ran и вызывать экспорт тРНК, Crm1-зависимых мяРНК, и белков in vitro (Black et al. 2001; Ossareh-Nazari et al. 2000). Эти результаты показывают, что Nxt1 может поддерживать экспорт мРНК как через Nxf1-, так и через Crm1-зависимый экспортные пути.
И hTap-p15, и yMex67-Mtr2 являются РНК-связывающими белками, но in vitro они связывают РНК неспецифично и не способны отличить различные РНК сами (Segref et al. 1997; Santos-Rosa et al. 1998; Katahira et al. 1999). Эти функции в этом процессе выполняют другие мРНК-связывающие белки. Консервативный комплекс TREX, который состоит из подкомплекса THO, Uap56 (Sub2 у дрожжей) и Aly/REF (Yra1 у дрожжей) играет важную роль в распознавании мРНК рецeптором Nxf1/Nxt1 (Kohler and Hurt 2007; Reed and Cheng 2005; Katahira 2015). РНК-связывающие компоненты TREX комплекса, включая Yra1 дрожжей и Aly/REF человека, напрямую связывают гетеродимеры рецептора экспорта, тем самым функционируя в качестве адаптеров (Strasser and Hurt 2000; Rodrigues et al. 2001). У дрожжей также были найдены другие адаптерные белки: серин-аргинин богатые белки (SR): Nlp3, Gbp2, Hrb1 (последние два также ассоциированы с комплексом TREX) (Hurt et al. 2004) и мРНК-связывающий белок Nab2, которые также взаимодействуют с Mex67-Mtr2 (Iglesias et al. 2010; Gilbert and Guthrie 2004; Batisse et al. 2009; Hackmann et al. 2014). Считают, что в клетках млекопитающих SR белки 9G8 и SRp20 выполняют сходную функцию (Huang et al. 2003; Katahira et al. 2009; Chang et al. 2013; Hautbergue et al. 2009).
Привлечение адаптерных белков к мРНП частице сопряжено с транскрипцией и процессингом, позволяющим мРНП частицам быть готовыми к экспорту через ядерную пору. Так, транскрипция Pol II является ключевым шагом, определяющим правильный путь экспорта. Кроме того, длина РНК является другой важной детерминантой, которая отличает мРНК от U мяРНК, оба вида которых транскрибируются РНК-полимеразой II у многоклеточных (Ohno et al. 2002; Ohno 2012). Тетрамер белка (hnRNP) С, который является распространенным ядерным мРНК-связывающим белком, играет основную роль в процессе выбора пути экспорта (Ohno et al. 2002; Ohno 2012; Kim et al. 2010; Mayer et al. 2010; Bataille et al. 2012).
Регуляция экспорта осуществляется на всех этапах. Рецептор экспорта мРНК после распознавания напрямую связывает мРНК. Этот этап регулируется посттрансляционными модификациями адаптерных белков. Затем рецептор транспорта осуществляет транслокацию связанной с ним мРНК через NPC, взаимодействуя с FG-повторами нуклеопоринов (Katahira et al. 1999; Wiegand et al. 2002). После транслокации в цитоплазму, рецептор транспорта диссоциирует от комплекса экспорта, предотвращая возвращение мРНК в ядро. Этот последний шаг осуществляется факторами, такими как Gle1 и Dbp5, которые ассоциированы с NPC (Alczar-Romn et al. 2006; Noble et al. 2011; Adams et al. 2014).
Структура и функция мРНК-специфичного гетеродимера рецептора экспорта Tap и Mex67 имеют сходную доменную организацию, и имеют РНК-распознающий мотив (RRM), следующий за ним лейцин-богатый повтор (LRR), NTF2L домен и убиквитин-связывающий домен (UBA), которые соединяются с помощью гибкого линкера (Рис. 13) (Valkov et al. 2012).
Mex67 и Tap взаимодействуют NTF2L доменом, с небольшими белками Mtr2 и p15, соответственно (Santos-Rosa et al. 1998; Katahira et al. 1999). Структурные исследования показали, что эта гетеродимеризация с небольшими белками-партнерами является ключевой для поддержания целостности NTF2L домена (Fribourg and Conti 2003; Fribourg et al. 2001).
NTF2L и UBA домены каждый содержат один сайт связывания FG-повтора. Хотя эти домены структурно неродственные, они связывают FG-повтор, используя механизм, сходный с используемым семейством рецепторов транспорта импортинов/кариоферинов (Stutz and Izaurralde 2003). Эти два связывающих FG-повтор сайта необходимы для Tap-зависимого экспорта мРНК. Интересно, что производные Tap, содержащие две копии и NTF2L, и UBA доменов, экспортируют мРНК менее эффективно, чем дикий тип белка, что показывает, что эти домены не являются функционально равными и могут иметь дополнительные функции (Braun et al. 2002).
Согласно результатам, полученным in vivo и in vitro, Tap-p15 и Mex67-Mtr2 напрямую взаимодействуют с РНК. Хотя собственная РНК-связывающая активность рецепторов экспорта мРНК очень слабая, ретровирусы D-типа, такие как Mason-Pfizer Monkey Virus (MPMV) и Simian Retrovirus type 1 (SRV-1), эволюционировали с образованием специфичного Tap-p15 для экспорта несплайсированной вирусной мРНК (Pasquinelli et al. 1997; Saavedra et al. 1997).
Найдена цис-действующая последовательность РНК - конститутивный транспортный элемент (CTE), с которой Tap-p15 связывается с высокой аффинностью (Kang et al. 1999; Grter et al. 1998). Считается, что N-концевая часть Tap, содержащая RRM и LRR домены, структурно и биохимически похожие на U2B и U1A гетеродимеры сплайсосомы, отвечают за связывание CTE. Действительно, структурный анализ этих двух доменов показал, что они взаимодействуют с CTE с большим сродством (Teplova et al. 2011; Liker et al. 2000). Однако, было также показано, что NTF2L домен функционирует как дополнительный РНК-связывающий домен, который становится доступным после гетеродимеризации белка с p15 (Katahira et al. 2015). Точечные мутации некоторых аминокислотных оснований в NTF2L домене Tap, локализующихся на другой стороне связывающей FG-повтор поверхности домена, серьезно снижали экспортную активность CTE. Эти данные показывают, что связывание NTF2L домена является функционально важным для CTE-опосредованного экспорта мРНК. Так, три домена Tap (RRM, LRR и NTF2L), участвуют в распознавании РНК. РНК-связывающая активность Mex67 почкующихся дрожжей и C. thermophilium также осуществляется при участии тех же доменов, что свидетельствует о том, что этот механизм, по которому рецепторы экспорта мРНК распознают свою мРНК, является эволюционно консервативным (Katahira et al. 2015)(Aibara et al. 2015b). Интересно, что РНК- и FG-повтор-связывающие домены организованы на противоположных поверхностях в гетеродимере Tap-p15, что позволяет ему эффективно взаимодействовать с двукратно симметричной структурой CTE-РНК и FG-повтор-содержащими нуклеопоринами. Вероятно, формирование симметричной РНК-связывающей поверхности может вызывать связывание FG-повтора и ускорять транслокацию CTE-содержащей мРНК через NPC(Aibara et al. 2015a).
Колокализация Sgf11 и PBP комплексов на политенных хромосомах, выделенных из слюнных желез D. melanogaster
С использованием антител к белку Sgf11 (в данном случае маркер локализации SAGA), и к белку Pbp45 (маркеру комплекса PBP) было проведено совместное иммуноокрашивание политенных хромосом из слюнных желез D. melanogaster (Рис. 20).
Совместное иммуноокрашивание было выполнено согласно протоколу, описанному в главе «Материалы и методы». Белки Pbp45 и Sgf11 колокализуются во многих активно транскрибирующихся сайтах политенных хромосом (34AB, 96 A, C, 23A и др.). Также на многих сайтах эти факторы были обнаружены независимо друг от друга (82Е, 60F и др.) (Рис. 20 А, Б, В, Г). Важным результатом было то, что оба белка, Sgf11 и Pbp45, колокализовались в сайтах, где расположены последовательности U1-U6 мяРНК генов (Рис. 20). Таким образом, данные результаты показывают, что в сайтах локализации генов мяРНК присутствует компонент SAGA, белок Sgf11.
Интересно, что изучение Pbp45 на политенных хромосомах показало, что Pbp45 присутствует не только на локусах мяРНК, но и на других активных участках транскрипции (в междисковых областях), что указывает на его гораздо более широкую роль в регуляции транскрипции, которая не ограничивается только контролем транскрипции генов мяРНК, как считалось ранее. Аналогичные данные ранее были получены при полногеномном секвенировании hSNAPC1, гомолога человека Pbp45 (Baillat et al. 2012). Таким образом, было впервые показано, что dPbp45, подобно hSNAPC1 ассоциирован не только с сайтами генов мяРНК, но и с другими сайтами активной транскрипции РНК-полимеразы II. Интересно, что в большинстве сайтов Pbp45 колокализуется с Sgf11.
Анализ взаимодействия ENY2- и SGF11-содержащих комплексов с мРНК
В проведенных исследованиях было показано, что ENY2 и Sgf11 являются компонентами или взаимодействуют с различными комплексами, участвующими в последовательных этапах транскрипции и формировании мРНП частицы. Мы показали, что Sgf11 участвует в самом начальном этапе формирования мРНП частицы, и привлекается на новосинтезированную мРНК вместе с Cbp80. ENY2-содержащие комплексы THO и TREX-2 необходимы для элонгации и экспорта мРНК. Многие факторы, составляющие мРНП частицу привлекаются на мРНК в процессе транскрипции. Они могут привлекаться на мРНК непосредственно, или через взаимодействие с другими комплексами. Готовая мРНП частица представляет собой достаточно плотно организованную структуру, состоящую из мРНК и ассоциированных с ней белковых комплексов. В организации мРНП участвуют как РНК-белковые, так и белок-белковые взаимодействия.
Мы исследовали взаимодействия белок-РНК ENY2 и Sgf11 внутри мРНП частицы гена tubulin 56D.
Для изучения взаимодействия белковых факторов с мРНК используется метод соосаждения белков с РНК (RNA affinity selection assay). Мы применили данный метод для изучения ассоциации описанных нами комплексов и белков с различными фрагментами мРНК. В качестве модельной мРНК была выбрана мРНК tubulin56D, поскольку ранее нами было показано, что субъединицы комплекса TREX-2 взаимодействуют с мРНК гена tubulin56D в реакциях RIP.
Последовательность ДНК, соответствующая кДНК гена tubulin56D, была поделена на восемь фрагментов (первый фрагмент соответствовал 5 некодирующей области, следующие 4 кодирующей, и 6-8 – 3 некодирующей области РНК гена tubulin56D) и клонирована в вектор pSK, содержащий Т3 и Т7 промоторы (схема представлена Рис. 55 А).
С фрагментов была синтезирована РНК, меченная биотином (14-С-UTP-biotin) с использованием Т3 и Т7 РНК полимераз. Синтезированную РНК инкубировали в ядерном экстракте, полученном из S2 клеток D. melanogaster. Далее, выделяли биотинилированные фрагменты РНК и ассоциированные с ней белки на стрептавидин агарозе и детектировали белки методом Вестерн блот анализа.
Результаты эксперимента показали, что что белок Cbp80 взаимодействует как с 5 -концевым фрагментом (1), так и с фрагментом, соответствующим центральному кодирующему участку мРНК tubulin56D (3). Взаимодействие с 5 -концом мРНК соответствует литературным данным, так как известно, что комплекс CBC (CAP-связывающий комплекс) привлекаются на новосинтезированную пре-мРНК в самом начале транскрипции. Однако, взаимодействие CBC с другими фрагментами РНК не было показано. Соотнося наши и уже известные данные, можно предположить, что взаимодействие Cbp80 с фрагментом 3 в середине мРНК скорее всего обусловлено тем, что участок 3 мРНК tubulin56D сближен с 5 -концом мРНК в составе мРНП частицы.
В литературе существуют разные точки зрения на взаимодействие комплекса THO с мРНК. Так, считается, что комплекс THO взаимодействуют с 5 - концевым участком мРНК (Singh et al. 2015), хотя это и противоречит основной функции комплекса THO в элонгации транскрипции. В наших экспериментах субъединица THO, Thoc5, связывалась со всеми фрагментами tubulin56D с некоторым преимуществом с первым, третьими пятым фрагментом (Рис. 55 Б). Эти данные подтверждают участие THO в элонгации транскрипции и соотносятся с другой моделью взаимодействия THO с мРНК, которая предполагает, что с мРНК несколько комплексов THO, ассоциированы с разными участками молекулы мРНК (Katahira 2015).
В наших экспериментах рецептор экспорта Nxf1 взаимодействовал с фрагментами 1, 1а, 3, 5. Поскольку этот белок привлекается на мРНП частицу через комплекс THO, распределение его взаимодействия ожидаемо совпало с Thoc5.
Xmas-2, PCID2, маркирующие комплекс TREX-2 связывались с несколькими фрагментами (3-5 фрагменты). Таким образом, комплекс TREX-2 взаимодействует с фрагментом, соответствующим центральной части ее кодирующей области. Комплекс TREX-2 может рекрутироваться на данную область в процессе синтеза мРНК или взаимодействовать с уже зрелой мРНП частицей.
Далее было исследовано взаимодействие изучаемых комплексов между собой в реакциях коиммунопреципитации из лизата S2 клеток D. melanogaster. Для реакций иммунопреципитации использовали антитела к белкам Thoc5 (THO комплекс), Cbp80 (комплекс CBC), PCID2 (TREX-2) и Nxf1 (Рис. 56).
Наиболее интенсивное взаимодействие в экспериментах по коиммунопреципитации было выявлено между белками PCID2, субъединицей TREX-2, и Cbp80, что указывает на их возможное прямое взаимодействие. Для подтверждения такого взаимодействия между TREX-2 и Cbp80 были проведены эксперименты по коиммунопреципитации с рекомбинантными белками Xmas-2 и Cbp80, слитыми с FLAG- и HA-эпитопами соответственно (Рис. 56 Б). Эти белки также взаимодействовали друг с другом, подтверждая ассоциацию между TREX-2 и Cbp80.
Интересно, что Sgf11, также взаимодействовал с Xmas-2 причем это именно Sgf11, не входящий в состав SAGA комплекса, так как взаимодействие между Xmas-2 и Nonstop отсутствовало (данные не приводятся).
Мы также исследовали взаимодействие комплекса TREX-2 со сплайсосомой, которая является важным компонентом сборки и экспорта мРНП частицы. Ранее было показано, что белки сплайсосомы участвуют в привлечении THO на мРНК и формируют состав мРНП частицы. Поэтому были исследованы взаимодействия белков сплайсосомы с субъединицами комплексов TREX-2 и ORC (Рис. 56 Г). Оказалось, что PCID2, субъединица TREX-2 соосаждается антителами к белкам Mud2, Prp19, Fandango, компонентами сплайсосомы из ядерного экстракта из эмбрионов D. melanogaster (Рис. 56 В). Иммунопреципитация антителами к Orc5 служила положительным контролем взаимодействия с PCID2. Таким образом, было показано взаимодействие белков TREX-2 комплекса с белками формирования и экспорта мРНП частицы. Таким образом, наши данные еще раз подтверждают, что изучаемые белки и комплексы входят в состав мРНП частицы. Комплекс CBC ассоциирован с 5 - концом мРНК, в то время как комплекс THO ассоциирован с мРНК по всей длине молекулы. Комплекс TREX-2 ассоциирован со центральным районом мРНК. Ранее было показано, что TREX-2 взаимодействует с уже зрелой мРНК, можно предположить, что его взаимодействие с РНП частицей опосредовано другими белками, например белками сплайсосомы. Это взаимодействие не является постоянным и выявляется только на определенном этапе. Возможно, это взаимодействие происходит при ко-транскрипционном формировании мРНП частицы. Возможно, однако, что это сближение происходит уже вблизи ядерной поры при сближении готовой к экспорту мРНП частицы.