Введение к работе
Актуальность проблемы. Трансляция является завершающей стадией реализации генетической информации. Среди основных этапов ансляции ( инициация, элонгация и терминация) инициация отличается окностью составляющих ее элементарных актов и механизмов регуляции, о определяет ее лимитирующее значение в биосинтезе белка.
Большая группа рибовирусов растений содержат РНК положительной лярности в качестве носителя генетической информации . Изучение обенности инициации трансляции этих вирусов дает обильную формацию как о молекулярных механизмах контроля трансляции кариотических мРНК, так и о механизмах взаимодействия вирусов с еткой.
В наше время проблема разработки эффективных средств борьбы с
русными болезнями растений, наносящими огромный ущерб сельскому
зяйству, приобрела большую актуальность.Поэтому исследование
ханизмов экспрессии генетической информации вирусов растений имеют
только теоретическое, но и практическое значение.
Цель и задачи исследования. Многие экспериментальные данные азывают на роль 5'- и 3'-нетранслируемых областей мРНК в регуляции ансляции.
5'-нетранслируемые лидерные последовательности (НТП) ряда русных РНК являются цис-действующими элементами и способны иливать трансляцию чужеродных эукариотических или прокариотических НК как in vitro, так и in и і но. Механизм этого усиления до сих пор ясен. Субгеяомные РНК (сгРНК) вирусов растений ( матрицы для руктурного белка) активно транслируются in viva и tn uttT-o. Как авило^ эти сгРНК имеют достаточно короткие 5'-концевые НТП и эдставляют собой удобную модель с точки зрения изучения их роли
как трансляционных ашсансеров. В литературе имеются противоречивые данные о возможности участия 5'- НТО сгРНК вирусов растений і усилении трансляции чужеродных генов. Так Б^НТП сгРНК вирус! мозаики люцерны (ВМЛ) является активным трансляционным энхансером, тогда как 5'-лидерная последовательность РНК4 вируса мозаики кострі (ВМК) не способна выполнять такую роль ( Jobling and Gehrke,1987) Целью настоящей работы явилось изучение возможной роли Б'-НШ сгРН гена белка оболочки тобамовируса зеленой крапчатой мозаики огурца' ( ВЗКМО ) как трансляционного анхансера. Мы поставили перед собо: следующие задачи:
- создать ДНК-конструкции, содержащие репортерный ген
неомицикфосфотрансферазы I (NPTI) под контролем 5'- НТП сгРНК ВЗКМО
и ее производных;
- получить соответствующие мРНК с помощью транскрипции in vltv
и исследовать эффективность их трансляции в бесклеточно
белонсинтезирующей системе из лизатов ретикулоцитов кролика (ЛТ
для выяснения возможных трансляционных энхансерных свойств втог
лидера и выявления структурных элементов, определяющих ЭТИ СВОЙСТВЕ
Ряд РНК вирусов растений, в частности, РНК ВМК и вирус табачной мозаики (ВТМ) не содержат поли(А) последовательности ї 3'-конце молекулы: 3'-конец РНК этих вирусов организован в слокщ вторичную и третичную структуру, похожую на структуру транспортам РНК - (тРНК-подобные структуры). Роль З'-НТП в регуляции транслящ вирусных РНК до сих пор не изучена, несмотря на наличие данных важности их роли в трансляции tn vivo ( Gallie et al.,1990,1991,) * Примечание: В работе, для удобства изложения используется и обо: начение ОВЗ ( огуречный вирус 3 ), применявшийся раньше в качест) синонима ВЗКМО.
vitro dimmer et al.,1993-,Ryabova et al.,1993). Чтобы изучить ияние тРНК-подобных структур РНК ВТМ и ВМК на трансляцию мерных мРНК in uttro, мы решали следующие задачи:
- получить функционально активные фрагменты, содержащие
НК-подобные структуры РНК ВМК и ВТМ, методом адресованного
зрезания РНК РНКазой Н E.ooli;
получить мРНК транскрипцией in vitro ДНК-конструкций, сущих разные репортврные гены под контролем различных лидерных следовательностей;
- с помощью РНК лигазк фага Т4 присоединить полученные
ЯК-подобные структуры к транскриптам и изучить роль зтих
руктур в трансляции химерных мРНК в ЛР.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе эрвке показано, что 5'-НТП сгРНК ВЗКМО длиной 13нт стимулирует шсляцию чужеродного гена NPTI в ЛР , т.е. является трансляционным сансером. Особенности его первичной структуры, а такяе возможное элементарное взаимодействие мевду олигопиримидиновым кластером в -НТП с последовательностью иа 3'-конце las рРНК не определяют его [ансерные свойства. Слабая структурированность лидера играет сную роль в регуляции эффективности трансляции.
Сочетанием нетрадиционного метода адресованного разрезания РНК Іазой Н в присутствии комплементарных олигодезонсирибонуклеотидов последующим сшиванием РНК лигазой фага Т4, были получены :эпированные химерные мРНК, содержащие ген NPTI под контролем ;ных Б'-лидеров и тРНК- подобные структуры РНК ВТМ или ВМК на конце. При трансляции в Л? зфїективность трансляции этих мРНК личивалась в 2-3 раза по сравнению с трансляцией некэпированной К, не содержащей тРНК-подобной структуры. Стимуляция трансляции в
результате влияния тРНК-подобной структуры сравнима с эффектом, вызываемым голиаденилированием этих мРНК. Весьма существено, чтс З'-НТП РНК ВТМ не стимулирует трансляции кэп-содержащих мРНК. Наин исследования показывают, что З'-НТП РНК ВТМ и ВМК увеличивают эффективность трансляции некэпированных мРНК, а не толькс обеспечивают ее стабильность.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседанш кафедры вирусологии Биологического факультета. Материалы исследования были представлены на Всесоюзной конференцш "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификацш растениеводства и кормопроизводства"(Алма-Ата,19Э0).
Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования результаты, обсуждение, список литературы. Общий объем диссертацщ составляет /ЇЗ&іТ?- в том числе чЗ рисунков. Список цитируемое литературы содержит jcStfi публикаций.