Содержание к диссертации
Введение
Глава1. Обзор литературы 8
1.1. Трансляция и структура рибосомы 8
1.2. Конформационная подвижность рибосомы 13
1.3. Конформационная подвижность рибосомы в ходе элонгации трансляции. 19
1.4. Терминация и рециклинг. 35
1.5. Деацилированная тРНК в Е-сайте . 44
1.6. Заключение. 49
Глава2. Материалы и методы 50
2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 50
2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 50
2.3. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе 50
2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК 50
2.5. Трансформация E. coli плазмидной ДНК 51
2.6. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 52
2.7. Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК при помощи автоматической системы Applied Biosystems ABI 310 52
2.8. АДФ-рибозилирование eEF2 52
2.9. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ 53
2.10. Электрофорез белков в нативном 10% ПААГ 53
2.11. Получение посттранлокационных комплексов рибосом 53
2.11.1. Получение мРНК 53
2.11.2. Выделение рибосом 53
2.11.3. Выделение факторов трансляции (нативных и рекомбинантных) 54
2.11.4. Аминоацилирование тРНК 54
2.11.5. Сборка ПОСТ комплекса 55
2.12. Проверка ПОСТ комплексов с помощью тоу-принт анализа 55
2.13. Тоу-принт анализ ПОСТ комплексов в присутствии различных лигандов 56
2.14. Анализ гидролиза пептидил-тРНК 56
2.15. Трансляция in vitro в лизате ретикулоцитов кролика 56
2.16. RelE анализ 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Деацилированная тРНК стабилизирует эукариотические терминационные комплексы 57
3.2. Детерминанты, определяющие стабилизирующую активность деацилированной тРНК, расположены в её акцепторной ветви 64
3.3. Механизм стабилизации стабилизации eRF1 деацилированной тРНК и её роль в регуляции трансляции эукариот 67
3.4. Обратная транслокация эукариотических рибосом происходит в присутствии eEF2 и деацилированной тРНК 69
3.5. Условия, необходимые для обратной трналокации 75
3.6. АДФ-рибозилирование eEF2 ингибирует обратную транслокацию 78
3.7. Механизм обратной транслокации эукариот и её роль в понимании работы рибосомы 80
Заключение: роль конформационной подвижности рибосомы в регуляции трансляции эукариот 83
Выводы 85
Список цитируемой литературы 86
- Конформационная подвижность рибосомы
- Деацилированная тРНК в Е-сайте
- Деацилированная тРНК стабилизирует эукариотические терминационные комплексы
- Механизм обратной транслокации эукариот и её роль в понимании работы рибосомы
Конформационная подвижность рибосомы
В ходе трансляции рибосома претерпевает значительные конформационные изменения, которые необходимы для декодирования кодонов мРНК при инициации, перемещения тРНК-мРНК комплексов при элонгации, для терминации трансляции и рециклинга (Wilson and Cate, 2012). Крупномасштабные конформационные перестройки включают межсубъединичное вращение (Frank and Agrawal, 2000) (Рис. 4Б), изменение положения L1 и L7/12 выростов большой субъединицы (Yamamoto et al., 2014), а также внутридоменные перестройки малой субъединицы (Korostelev et al., 2008a). Сначала у эукариот (Рис. 4Г) (Behrmann et al., 2015; Budkevich et al., 2014; Khatter et al., 2015), а потом и у бактерий (Agirrezabala et al., 2017; J. Zhang et al., 2015) был открыт еще один тип подвижности – поворот (rolling) малой субъединицы относительно её длинной оси. Среди внутридоменных перестроек малой субъединицы различают сближение её головного и плечевого доменов малой субъединицы (Ogle et al., 2002) (Рис. 4А), а также закручивание головы малой субъединицы (head swivelling) относительно её тела (Ratje et al., 2010) (Рис. 4В).
Конформационные перестройки малой субъединицы рибосомы. (А) Доменное смыкание при декодировании. (Б) Вращение малой субъединицы отсносительно большой. (В) Вращение головы малой субъединицы. (Г) Поворот малой субъединицы эукариотической рибосомы вокруг длинной оси. С изменениями по (Ogle et al., 2002) (А), (Zhou et al., 2013) (Б), (Yamamoto et al., 2014) (В) и (Budkevich et al., 2014) (Г).
Целостность рибосомы при конформационных изменениях поддерживается благодаря множеству лабильных связей внутри и между субъединицами, так называемым рибосомным мостам (bridges) (Рис. 5), набор которых динамично меняется для каждого типа движения. А
Рассмотрим подробнее некоторые конформационные перестройки рибосомы. При вращении субъединиц друг относительно друга точкой поворота является мост В3 (Рис. 6А) (Dunkle et al., 2011). Он включает взаимодействие оснований A1418 и A1483 спирали h44 малой субъединицы с малой бороздкой спирали H71 большой. Вблизи оснований A1418 и A1483 находятся G-A пары рРНК, координирующие ион магния, они вносят вклад в ассоциацию субъединиц у всех организмов (Dunkle et al., 2011). Максимальному смещению при повороте субъединиц подвергаются рибосомные мосты, расположенные на периферии относительно оси вращения, например, B1a и B1b (Рис. 6). Эти мосты в основном образованы в результате электростатического взаимодействия заряженных аминокислот, и при изменении положения субъединиц, заряженные остатки находят себе новых партнеров для связывания. Такой тип контакта называется неограниченным и стабилизирует начальное и конечное состояния вращения, но дестабилизирует промежуточное, за счет взаимного отталкивания одноименных зарядов (Рис. 6А-В). Мутации в белках S13 и L5, составляющих мост B1b, или делеция S13 приводят к увеличению скорости транслокации и к уменьшению её точности. Тот же эффект дают мутации в спирали H38, входящей в мост B1a, что подчеркивает важность данных рибосомных мостов для регуляции вращения рибосомных субъединиц (Cukras and Green, 2005; Frank et al., 2007). Другие периферические мосты, такие как B4, сохраняют партнеров по контакту на большой и малой субъединице и вносят вклад в стабильность ассоциации рибосомных субъединиц при их повороте (Bock et al., 2015; Dunkle et al., 2011). Такой тип контакта называется ограниченным (Рис. 6. А, Б, Г). В мосте B4 постоянный контакт поддерживается за счет изменения конформации спирали H38, которая следует за своим партнером по связи, белком S15, в ходе вращения рибосомных субъединиц (Рис. 6Г).
Типы межсубъединичных контактов рибосомы. (А) Схема, показывающая ограниченные и неограниченные контакты. (Б) Карта рибосомных контактов по степени ограниченности. (В) Неограниченный контакт на примере рибосомного моста B1b. (Г) ограниченный контакт на примере моста B4. С изменениями по (Bock et al., 2015). Мост B2a, образованный спиралью H69 большой субъединицы и h44 малой, вносит значительный вклад в ассоциацию рибосомных субъединиц, а также играет важную роль при декодировании кодонов мРНК, инициации трансляции и рециклинге рибосомных комплексов (Bock et al., 2015; Dunkle et al., 2011). В обычном и закрученном состоянии рибосомы, основание A1913 спирали H69 погружено в малую бороздку спирали h44, однако при вращении субъедииц вершина h44 смещается, что приводит к деформации и сжатию этой спирали (Рис. 7А). Антибиотики туберактиномицинового ряда, такие как виомицин и капреомицин, а также аминогликозиды, такие как неомицин и паромомицин, связываются вблизи моста B2a (Borovinskaya et al., 2007; Feldman et al., 2010; Stanley et al., 2010) и модулируют как силу связывания тРНК в А-сайте, так и способность рибосомы претерпевать межсубъединичное вращение.
Структурные изменения при вращении рибосомных субъединиц также затрагивают спираль H68 большой субъединицы. При повороте малой субъединицы, эта спираль открепляется от основания A702, которое образует стекинг взаимодействие с А-А площадкой недалеко от вершины Н68, и движется в направлении акцепторного стебля тРНК, где взаимодействует с его малой бороздкой. Считается, что этот контакт стабилизирует Р/Е-состояние тРНК (Рис. 7Б) (Dunkle et al., 2011).
Поворот головы малой субъединицы происходит вокруг спирали h28 малой рибосомной РНК и связан с перестройкой рибосомных мостов B1a и B1b, в частности, взаимодействиями белков S13, L5 и спирали H38 (Dunkle et al., 2011).
Эукариотическая рибосома обладает дополнительными связями между субъединицами, в основном образованными между специфическими для эукариот рибосомными белками и выростами рРНК на периферии субъединиц (например, мосты eB12, eB13, Рис. 5Б). Поразительным исключением является мост eB14, образованный белком L41e, который погружается в специальный карман 18S рРНК. Этот мост находится недалеко от точки межсубъединичного вращения рибосомы. Примечательно, что аналогичный карман в рРНК малой субъединицы есть и у прокариот, однако в нем не связывается никакой белок (Ben-Shem et al., 2011; Wilson and Cate, 2012).
Конформационные перестройки эукариотической рибосомы имеют свои особенности. Прежде всего, из-за дополнителной массы в районе центрального протуберанца большой субъединицы, малая субъединица отклоняется от большой, что приводит к изменению наклона оси межсубъединичного вращения и изменению положения спирали H69 по сравнению с прокариотической рибосомой (Svidritskiy et al., 2014) (Рис. 8А, Б). Большому смещению при повороте подвержены периферические мосты eB12 и eB13, образованные сегментом расширения es6E и белками eL19 и eL24, соответственно, однако они сохраняют места своих контактов за счет подвижных линкеров в белковых партнерах малой субъединицы (Behrmann et al., 2015). Центральный мост eB14 сохраняет свое положение при вращении субъединиц, и, вероятно, укрепляет точку поворота двух субъединиц (Behrmann et al., 2015).
Деацилированная тРНК в Е-сайте
Третий тРНК-связывающий участок рибосомы – Е (exit)-сайт - был открыт в середине 1960-х годов и охарактеризован, как участок выхода деацилированной тРНК из Р-сайта после реакции транспептидации (Noll, 1966; WETTSTEIN and NOLL, 1965). Впоследствии было показано наличие Е-сайта в рибосомах всех организмов (Rheinberger et al., 1981; Saruyama and Nierhaus, 1986; Triana-Alonso et al., 1995).
На рисунке 23 представлены контакты деацилированной тРНК в Е-сайте, полученные на основании структурных исследований прокариотической рибосомы.
Контакты деацилированной тРНК в Е-сайте рибосомы (А). (Б) Кодон-антикодоновое взаимодействие в Е-сайте. По (Yusupov et al., 2001) (А) и (Feng et al., 2013) (Б).
Контакты деацилированной тРНК с малой субъединицей включают спираль h28, h23, h24 малой рибосомной РНК, а также белки S7 и S11 (Korostelev et al., 2006; Wilson and Nierhaus, 2006; Yusupov et al., 2001). Долгое время велись споры о кодон антикодоновом взаимодействии в Е-сайте малой субъединицы (Wilson and Nierhaus, 2006). Было показано, что его нарушение важно для программируемого сдвига рамки считывания при биосинтезе терминационного фактора RF2 (Mrquez et al., 2004). С другой стороны, эксперименты по связыванию показывали, что это взаимодействие вносит небольшой вклад в аффинность деацилированной тРНК к Е-сайту (Lill and Wintermeyer, 1987), а структурные исследования демонстрировали лабильность антикодоновой петли и отсутствие комплементарных контактов с основаниями триплета мРНК (Behrmann et al., 2015; Budkevich et al., 2011; Jenner et al., 2007, 2010; Khatter et al., 2015). Тем не менее, было показано, что в структуре аутентичного рибосомного комплекса, в котором деацилированная тРНК поступает в Е-сайт из Р-сайта в ходе транслокации, действительно наблюдается комплементарное взаимодействие первых двух оснований антикодона (Рис. 23Б) (Feng et al., 2013). В результате контакта с триплетом мРНК, антикодоновая петля разрывает связь со спиралью h28 (Feng et al., 2013), что, возможно, объясняет небольшой вклад кодон-антикодонового взаимодействия в сродство к Е-сайту.
На большой субъединице деацилированная тРНК имеет несколько контактов. Её локтевая часть взаимодействует с L1-выростом рибосомы, причем, как, собственно, с самим белком L1, так и с рРНК, образующей площадку для этого белка (стекингом оснований G19-C56 тРНК с остатками G2112-A2169 23S РНК) (Рис. 23А). Как было указано выше, L1-вырост относится к подвижным частям рибосомы: в ходе транслокации этот вырост принимает «закрытую» конформацию, взаимодействуя с деацилированной тРНК в Р/Е-состоянии (Рис. 24). Это взаимодействие сохраняется и когда деацилированная тРНК полностью находится в Е-сайте: считается, что движение L-1 выроста стабилизирует гибридное состояние тРНК, а также помогает эвакуации деацилированной тРНК из рибосомы (Trabuco et al., 2010). L1-вырост у про- и эукариот имеет некоторые отличия в структуре и контактах с рибосомой: у эукариот в этом выросте отсутсвует спираль Н78, которая у бактерий взаимодействует с белком S11 малой субъединицы (Petrov et al., 2014). Отсутствие этого контакта приводит к изменению позиции тРНК в Е-сайте эукариот.
Контакты с большой субъединицей также включают взаимодействие акцепторного стебля тРНК со спиралью H68 (основаниями 70-71) и белком L28 (Рис. 23А) (Korostelev et al., 2006; Yusupov et al., 2001). Взаимодействие со спиралью H68 имеет важное фукциональное значение – метилирование рибозы 71 основания тРНК в Р-сайте блокирует взаимодействие с Н68 и транслокацию (Feinberg and Joseph, 2001). Этот эффект объясняется неспособностью модифицированной тРНК в Р-сайте принять Р/Е-конформацию (Korostelev et al., 2006) (которая, как мы видели выше, стабилизируется спиралью Н68, придвигающейся к тРНК при взаимном вращении рибосомных субъединиц (Рис. 7Б)).
Наконец, главной детерминантой деацилированной тРНК, которая определяет её сродство к Е-сайту, является её деацилированный ССА-конец (Feinberg and Joseph, 2001; Lill et al., 1988). Несмотря на это, участки связывания деацилированного конца сильно отличаются у бактерий с одной стороны и архей и эукариот, с другой (Schmeing et al., 2003; Svidritskiy et al., 2014) (Рис. 25).
Участки связывания ССА-конца в Е-сайте (А) эукариот, (Б) бактерий, (В) архей. С изменениями по (Svidritskiy et al., 2014). Так, в бактериальной рибосоме ССА-конец взаимодействует со спиралью Н82 и белком L28. Два цитозина ССА тринуклеотида формируют стопку оснований, находящихся в стекинг-взаимодействии. У эукариот и архей ССА-конец взаимодействует с Н82 и с белком L44e, который структурно отличается от L28. В отличии от бактерий, нуклеотид С75 у них не вступает в стекинг с С74, а вместо этого взаимодействует с белком L44e (Schmeing et al., 2003; Svidritskiy et al., 2014). Консервативность способа узнавания деацилированного ССА-конца подтверждает филогенетическое родство архей и эукариот.
Другим важным отличием между бактериями и эукариотами является положение деацилированной тРНК в Е-сайте: несмотря на аналогичное расположение тРНК-связывающих участков в про- и эукариотических рибосомах, локтевая часть L-образной структуры деацилированной тРНК в Е-сайте находится на 15 ангстрем ближе к тРНК из Р-сайта, что объясняется различиями во взаимодействии выроста L1 и тРНК у про- и эукариот (Budkevich et al., 2011; Svidritskiy et al., 2014). Сама деацилированная тРНК в Е-сайте эукариотической рибосомы изогнута по сравнению с Е-сайтом прокариотической (Рис. 26) (Svidritskiy et al., 2014).
Положение деацилированной тРНК в Е-сайте эукариотической рибосомы. Серым показано положение в бактериальной. По (Svidritskiy et al., 2014).
На функциональном уровне было показано участие деацилированной тРНК в образовании гибридных конформаций тРНК при транслокации (Lill et al., 1989), в поддержании правильной рамки считывания (Devaraj et al., 2009; Mrquez et al., 2004), а также в негативном аллостерическом влиянии на связывание тРНК в А-сайте (Nierhaus, 2006). Тем не менее, перечисленные функции, особенно последняя (Chen et al., 2011; Nierhaus and Pech, 2012; Semenkov et al., 1996), изучены не достаточно глубоко. Было показано, что деацилированная тРНК, занимает Е-сайт прокариотической рибосомы при физиологических условиях (Nierhaus, 2006), а недавно была продемонстрирована стабильная занятость Е-сайта деацилированной тРНК в активно транслирующих рибосомах человека (Behrmann et al., 2015). Современное кинетическое исследование с использованием smFRET показало, что деацилированная тРНК в Е-сайте способна затормаживать элонгацию трансляции, если в рибосоме помимо неё присутствуют еще и А- и Р-тРНК (Choi and Puglisi, 2017). Важно отметить, что Е-сайт является не только местом «выхода», но и «входа» для таких факторов как EF-P (eIF5A у эукариот, aIF5A у архей), увеличивающего эффективность биосинтеза полипролиновых участков (Katoh et al., 2016; Schmidt et al., 2015), бактериального фактора EttA, АТФ-азы ABC-типа, взаимодействующего с тРНК в Р-сайте и приводящего к гибернации рибосомы (Chen et al., 2014). Эти данные указывают на потенциальную важность деацилированной тРНК в Е-сайте для регуляции трансляции.
Деацилированная тРНК стабилизирует эукариотические терминационные комплексы
Ранее была показана способность деацилированной тРНК стабилизировать фактор терминации eRF1 человека на рибосоме (Skabkin et al., 2013). Однако, механизм этой стабилизации не был описан.
Для исследования этого эффекта, в реконструированной системе трансляции на модельной мРНК, кодирующей тетрапептид MVHL, собирали рибосомные ПОСТ комплексы, содержащие стоп-кодон в А-сайте. При сборке ПОСТ комплексы образовывались, когда рибосомы достигали в ходе элонгации стоп-кодона в конце кодирующей последовательности, при этом факторы терминации и рециклинга отсутствовали в реакционной смеси. Далее препарат очищали от компонентов трансляции с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы. В ходе этого процесса также происходила эвакуация деацилированной тРНК из Е-сайта (Skabkin et al., 2013). Положение рибосом на мРНК детектировали с помощью тоу-принт анализа с флуоресцентными праймерами, с нуклеотидным разрешением (Рис. 27А). Очищенные рибосомные комплексы содержали вакантный Е-сайт с гистидиновым кодоном CAU, Р-сайт, занятый MVHL-тРНК, и вакантный А-сайт, в котором находился стоп-кодон UAA. При добавлении к рибосомным комплексам фактора терминации eRF1 человека наблюдали увеличение пика соответствующего 2-нуклеотидному сдвигу рибосомы, характерного для связывания N-домена eRF1 со стоп-кодоном. Как отмечалось в обзоре литературы, этот сдвиг обусловлен способом распознавания eRF1 стоп-кодона, ведущим к размещению в А-сайте четырех нуклеотидов мРНК, вместо трех в отсутствии eRF1.
В качестве модельной деацилированной тРНК использовали тРНКГис, которая занимает Е-сайт рибосомы в ходе обычной элонгации MVHL-пептида. Добавление деацилированной тРНКГис к рибосомным комплексам и eRF1 приводило к увеличению пика, характеризующего связывание eRF1 со стоп-кодоном, как было показано ранее (Skabkin et al., 2013) (Рис. 27Б) (здесь и далее диаграммы профилей тоу-принт сигнала соотносятся с мРНК так, что 5 -конец матрицы располагается слева, а 3 -конец справа). Стабилизирующий эффект тРНКГис был еще более выражен, когда в реакционной смеси присутствовали оба терминационных фактора, eRF1 и eRF3 (Рис. 27Б).
Известно, что замена оснований в консервативной GGQ-петле eRF1 приводит к нарушению способности гидролиза пептидил-тРНК фактором, но не влияет на его стоп-кодон связывающую активность (Frolova et al., 1999). Мы обнаружили, что деацилированная тРНКГис стабилизировала мутант eRF1(AGQ) аналогично eRF1 дикого типа (Рис. 27Б).
Известно, что слабо/негидролизуемые аналоги ГТФ также приводят к стабилизации eRF1 и eRF1(AGQ) на рибосоме, если в реакционной смеси присутствует eRF3 (Alkalaeva et al., 2006). В данных условиях eRF3, замороженный в активной ГТФ-форме, удерживает eRF1 и прочно связывается с рибосомой (Рис. 27Б). Находясь в комплексе с eRF3 и негидролизуемым аналогом ГТФ, eRF1 не способен катализировать гидролиз пептидил-тРНК, так как его М-домен с GGQ-петлей связан eRF3. Одновременное использование eRF1(AGQ) и негидролизуемых аналогов в присутствии eRF3 позволило заключить, что стимуляция терминации трансляции деацилированной тРНК происходит до гидролиза пептидил-тРНК (Рис. 27Б). Рис. 27. Стабилизация фактора терминации человека eRF1 на рибосоме деацилированной тРНК. (А) Схема эксперимента. (Б) Тоу-принт анализ терминационных комплексов образованных взаимодействием рибосом с eRF1, eRF1(AGQ) и eRF3 с ГДФАФ в присутствии/отсутствии деацилированной тРНКГис. О.е.ф., относительные единицы флуоресценции, нт, нуклеотиды. Выборка включает минимум три эксперимента. Планки погрешностей соотвествуют стандартному отклонению среднего. Так как положение каталитического М-домена eRF1 значительно меняется в комплексах с рибосомой в присутствии и отсутствии eRF3(GMPPNP) (Taylor et al., 2012) (Рис. 19Б), стабилизирующий эффект тРНКГис вероятно проявлялся через N-домен eRF1, в обоих случаях связанный со стоп-кодоном. Для проверки этой гипотезы в ходе тоу-принт анализа в реакцию добавляли изолированный N-домен eRF1, либо в комбинации с двумя другими доменами, в присутствии деацилированной тРНК (Рис. 28). Оказалось, что деацилированная тРНК стабилизирует изолированный N-домен.
Деацилированная тРНК стабилизирует N-домен eRF1. Тоу-принт анализ терминационных комплексов, образованных взаимодействием рибосом с eRF1, доменами eRF1 в присутствии/отсутствии деацилированной тРНКГис О.е.ф., относительные единицы флуоресценции, нт, нуклеотиды. Выборка включает минимум три эксперимента. Планки погрешностей соотвествуют стандартному отклонению среднего.
Для изучения влияния деацилированной тРНК на гидролиз пептидил-тРНК собирали ПОСТ комплексы, несущие радиоактивно-меченный метионин в составе MVHL-тРНК в Р-сайте. Деацилированная тРНК увеличивала эффективность гидролиза пептидил-тРНК фактором eRF1, но значительно меньше, чем eRF3. Это означает, что стабилизирующий эффект тРНКГис не распространялся на М-домен eRF1, участвующий в гидролизе и подтверждает преимущественную стабилизацию N-домена eRF1 в рибосоме, показанную ранее (Рис. 28, 29). Рис. 29. Деацилированная тРНК слабо влияет на гидролиз пептидил-тРНК eRF1. Анализ гидролиза eRF1 радиоактивно-меченной MVHL-тРНК в рибосоме в присутствии/отсутствии деацилированной тРНК и eRF3. Выборка включает минимум три эксперимента. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению среднего.
Кроме тРНКГис на модельном ПОСТ комплексе было протестировано более 10 других деацилированных тРНК. Было обнаружено, что разные тРНК имели различную стабилизирующую активность, и, что важно, она не была связана с антикодоном тРНК (таблица 1). Так например, тРНКАла с антикодоном CGC имела такую же активность в терминации трансляции, как и тРНКГис с антикодоном CAU. С другой стороны, элонгационная тРНКМет и бактериальная инициаторная тРНКiМет, обладая одним и тем же антикодоном CAU, очень сильно различались в способности удерживать eRF1. Эти данные показали, что для стабилизации eRF1 не требуется кодон-антикодонового связывания деацилированной тРНК с мРНК в Е-сайте рибосомы. Различия в стабилизирующем эффекте скорее всего определялись аффинностью деацилированной тРНК к Е-сайту. Ранее было показано, что эта аффинность может отличаться в десятки раз у разных тРНК (Lill and Wintermeyer, 1987; Robertson and Wintermeyer, 1987). Интересно отметить, что кодон-антикодоновое взаимодействие вносит минимальный вклад в сродство к Е-сайту. Таблица 1. eRF1-стабилизирующая активность деацилированной тРНК не зависит от последовательности антикодона.
Таким образом, мы продемонстрировали, что деацилированная тРНК способна стабилизировать eRF1 в А-сайте рибосомы, находясь при этом в Е-сайте, не затрагивая гидролиз пептидил-тРНК. Распознавание антикодона тРНК также не является обязательным для её действия. При этом, главную роль в стабилизации со стороны eRF1 играет N-домен фактора. Каким образом деацилированная тРНК в Е-сайте могла влиять на удаленный от неё eRF1, находящийся в А-сайте? Структурные данные выявили способность деацилированной тРНК к стабилизации незакрученной конформации рибосом в ПРЕ состоянии, когда в Р-сайте также находится деацилированная тРНК (Budkevich et al., 2011). Считается, что в основе этой стабилизации лежит конкуренция за Е-сайт большой субъединицы между деацилированными акцепторными концами тРНК из Е- и Р-сайтов (Budkevich et al., 2011). Конкуренция приводит к тому, что деацилированная тРНК в Р-сайте не может занять гибридное состояние Р/Е, ассоциированное с вращением рибосомных субъединиц. В свою очередь, факторы терминации первого класса, и eRF1 в том числе, также связываются с рибосомой в неповернутой конформации. Следовательно, стабилизация деацилированной тРНК неповернутой конформации рибосомы должна приводить к повышению сродства eRF1 к рибосоме (Рис. 30А). Следует отметить, что подобный механизм стабилизации возможен только для eRF1 дикого типа, следствием работы которого является появление деацилированной тРНК в Р-сайте, но не для мутанта eRF1(AGQ), неспособного к гидролизу пептидил-тРНК.
Помимо деацилированной тРНК, среди факторов, способных блокировать межсубъединичное вращение рибосомы, был обнаружен антибиотик циклогексимид (Budkevich et al., 2011). Это соединение связывается в Е-сайте большой субъединицы и способно конкурировать за него с ССА-концом тРНК из Р-сайта (Рис. 30А).
Влияние циклогексимида на терминационные комплексы. (А) Схема действия деацилированной тРНК и циклогексимида на межсубъединичное вращение рибосомы. (Б) Тоу-принт анализ терминационных комплексов, образованных взаимодействием рибосом с eRF1, eRF1(AGQ) и eRF3 в присутствии/отсутствии циклогексимида. О.е.ф., относительные единицы флуоресценции, нт, нуклеотиды. Выборка включает минимум три эксперимента. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению среднего. В наших экспериментах циклогексимид также стабилизировал eRF1 на рибосоме, однако, в отличие от деацилированной тРНК, он не был способен к стабилизации мутанта eRF1(AGQ) (Рис. 30Б). Таким образом, циклогексимид оказался чувствительным к гидролизу пептидил-тРНК в Р-сайте. А это значит, что хотя деацилированная тРНК способна стабилизировать eRF1 на рибосоме за счет придания ей конформации неповернутых субъединиц, она также обладает и дополнительным механизмом удержания eRF1, включающим передачу сигнала между А- и Е-сайтами рибосомы.
Механизм обратной транслокации эукариот и её роль в понимании работы рибосомы
На основании полученных результатов была предложена следующая модель обратной транслокации у эукариот (Рис. 40). Связывание eEF2 стабилизирует закрученную конформацию головы малой субъединицы и гибридное ap/P состояние пептидил-тРНК в Р-сайте. Стабилизация происходит посредством взаимодействия IV домена белка с тРНК и декодирующим центром малой субъединицы. Деацилированная тРНК в Е-сайте занимает pe/E-состояние. Далее, eEF2 диссоциирует, либо компактизуется, что позволяет голове малой субъединицы вернуться в исходное состояние. тРНК-мРНК комплексы приобретают гибридные конформации P/E и A/P, которые затем могут превратиться в классические P/P и A/A. Другая деацилированная тРНК способна связаться с освободившимся Е-сайтом, стабилизируя ПРЕ состояние рибосомы и препятствуя прямой транслокации.
Нами было показано, что реакция транслокации с ПОСТ рибосомами требует большой избыток eEF2. При более низких, физиологических, концентрациях белок может продуктивно взаимодействовать только с ПРЕ-рибосомами (J. Chen et al., 2013). Рассматривая модель обратной транслокации в противоположном направлении можно предположить (Рис. 39), что диссоциация деацилированной тРНК из Е-сайта ПРЕ рибосомы должна облегчать прямую транслокацию. Это предположение подтверждается структурным исследованием (Behrmann et al., 2015), которое показало, что диссоциация происходит под влиянием eEF2, который стабилизирует повернутое состояние рибосомных субъединиц, несовместимое с деацилированной тРНК в Е-сайте. Другое исследование, проведенное с помощью биохимических методов, подтвердило диссоциацию деацилированной тРНК из рибосомы до перехода последней в ПОСТ конформацию (Wasserman et al., 2016). Пустой Е-сайт позволяет деацилированной тРНК в Р-сайте приобрести гибридную P/E конформацию в ходе прямой транслокации.
Мы предполагаем, что направленность транслокации определяется на стадии связывания eEF2 из-за его более высокого сродства к ПРЕ рибосоме и индуцируемой диссоциации деацилированной тРНК из Е-сайта. Следующая за связыванием eEF2 стадия универсальна для транслокации в любом направлении. На этой стадии eEF2 облегчает переход через главный энергетический барьер транслокации, а именно, передвижение антикодоновых концов тРНК в соседние сайты рибосомы. Используя гигромицин Б и АДФ-рибозилированный фактор, нами была продемонстрирована важность такой стабилизации для обратной транслокации в эукариотических ПОСТ комплексах.
В контексте полученных результатов интересно рассмотреть обратно транслоцирующую активность фактора EF-4. Этот белок не способен индуцировать кручение головы малой субъединицы, так как его CTD-домен не взаимодействует с декодирующим центром. Таким образом, EF-4 катализирует обратную транслокацию не прямо, не связывая промежуточное состояние – закрученную голову малой субъединицы, а стабилизируя конечное (претранслокационное) состояние, в отличие от eEF2, который увеличивает эффективность перемещения тРНК внутри рибосомы в обе стороны, работая как настоящий фермент. Эти доводы согласуются с предположением, что главная роль EF-4 в клетке может быть не связана с обратной транслокацией. Принимая во внимание низкую скорость прямой транслокации в присутствии негидролизуемых аналогов ГТФ (J. Chen et al., 2013) вместе с возможностью обратной реакции, показанной в данной работе, можно заключить, что гидролиз ГТФ фактором eEF2 требуется для того, чтобы диссоциировать фактор от рибосомы и интермедиата транлоскации, позволив промежуточному состоянию развиться в том или ином направлении. Поэтому гидролиз ГТФ обеспечивает высокую скорость реакции транслокации в живой клетке.
В сумме, полученные данные показывают, что рибосомная конформация, стабилизируемая eEF2, представляет из себя универсальный интермедиат в перемещении тРНК-мРНК комплексов между тРНК-связывающими сайтами рибосомы. eEF2, действуя как настоящая транслоказа, катализирует процесс в обоих направлениях, оперируя на обратимой рибосомальной молекулярной машине.