Введение к работе
Актуальность исследования. Проолеыа профилактики гриппа остается до настоящего времени все еще окончательно не решенной, хотя в последние годы появились определенные достижения в этой области. Основной трудностью, лимитирующей создание и использование эффективных гриппозных вакцин, считается выраженная антигенная изменчивость вируса гриппа. Однако, причиной этого могут быть и другие особенности, присущие возбудителю гриппозной инфекции.
Анализ литературы свидетельствует о том, что репродукция вируса гриппа, являющаяся пусковым механизмом развития гриппозной инфекции, происходит на фоне выраженного угнетения защитных сил организма. Установлено, что для большинства штаммов вируса гриппа в структуре гемагглютинина характерно наличие консенсус-последовательности, близкой по структуре к участкам поверхностных белков вирусов иммунодефицита человека, которая, вероятно, и обусловливает иммунодепрессивные эффекты вируса гриппа /Туль-тяев А.П. и др., 1938/. Наблюдается угнетение выработки интерферона, интерлейкина-2 и всего каскада защитных механизмов неспецифической резистентности и клеточного иммунитета, основными эффекторами которых являются ЕК, а также Т-киллеры, К-клетки, обеспечиваыцие антителозависимую цитотоксичность, макрофаги и
ПОЛИМОрфНОЯДерНЫе ЛеЙКОЦИТЫ / James I.., Hitchi А. Л., 1964;
de Kartino м. et ai., 1985; Трушнская Г.Н. и др., 1988;
Grigorian 5.3., Ershov F.I. , 1991/. ЭТО ПОЗВОЛЯЄТ ПрИДГЛ К
заключению, что одними из основных звеньев патогенеза гриппозной инфекции являются вызываемые вирусами гриппа интерферон-дефицитный синдром и состояние иммунодефицита клеточного типа.
Вирус гриппа способствует выработке гуморальных антител, но в силу выраженной антигенной изменчивости вируса они не оказывают защитного действия при появлении нового штамма, в отличие от факторов клеточного типоспецифического иммунитета
/ Taylor P.M., Askonas В.А., 1986; Ada G. L., 1988/.
В ответ на внедрение вируса гриппа в организме начинают вырабатываться биорегуляторы и гомеостатические агенты - интерферона, способствуодие восстановлению нарушенного гомеостаза. Иммуномодулирущее действие интерферонов эндогенного или экзогенного происхождения имеет противоположную вирусу гриппа на-
правленность и сводится к активизации, в основном, вышеперечисленных КлеТОЧНЫХ факторов иммунитета / Beladi J. Е. et Jl. ,1983; Ilcrbcrmcin й. В., 1986; Cacti С, Hubcr С, 1988/. Это ДОЄГ
основания полагать, что одним из важнейших свойств интерферона является его антидепрессивный эффект.
Однако, способность вируса грипда угнетать функциональное состояние систем интерферона и иммунитета, с одной стороны, и егс выраженная антигенная изменчивость, в связи с чем антитела не могут нейтрализовать вновь доявлявдийся штамм - с другой, помогают вирусу преодолевать иммунный барьер организма и вызывать возникновение новых эпидемий- Есть основания полагать, что с сочетанием этлх двух особенностей вируса гриппа связана и низкая профилактическая эффективность современных гриппозных вакцин, а также возможность ее повышения у животных с помощью некоторых интерферс индупдругщих веществ (глюкан) /Шварцман Я.С. и др./.
Наряду с этим есть данные о том, что вирусу не всегда удаєте ся спровоцировать возникновение интерфероадефицитного и иммуно-дефицитаого синдромов. В таких случаях гриппозная инфекция не развивается. Врожденная интерферонзависимая резистентность к вирусу Гриппа Связана С ГеНОМ MX / Towbin к. et ai., 1992/. Описана также невосприимчивость к гриппозной инфекции, связанная с наличием у таких людей противогриппозного клеточного иммунитета / Lazar н., Wright Р. Р., 1980/.
Все это свидетельствует о необходимости разработки нового подхода к проблеме профилактики гриппа, основанного на регуляции систем ингерферова и иммунитета модулирующими препаратами с целы обеспечения невосприимчивости ко всем антигенным вариантам вируса гриппа, что представляет одну из наиболее актуальных проблем борьбы с гриппозной инфекцией.
Разработка новых методов профилактики гриппа является базовой задачей для совершенствования профилактики не только этого заболевания, но в будущем и для разработки новых методов профилактики широкого круга вирусных заболеваний человека.
Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в по вышении эффективности профилактики гриппозной инфекции с помощью отобранных модулирующих препаратов, обладавдих свойством защищат системы интерферона и иммунитета от депрессивного действия вирус гриппа, а также усиливать выработку интерферона и формирование типоспецифяческого клеточного иммунитета.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
I. Отобрать в процессе скрининга соединения, обладапцие антерферониндуцирущмм, иммуности^лируюцим и противовирусным действием при гриппозной инфекции среди препаратов растительного и микробного происхождения, а также полученных путем синтеза.
И. Изучить интерферониндуцирувдее, иммуностимулирующее и противовирусное действие при гриппозной инфекции нових фитопрепаратов, полученных на основе растений семейства аралиевых.
3. Разработать способы снижения заболеваемости гриппом
с помощью отобранных препаратов, оказывающих стимулирующее воздействие на системы интерферона и иммунитета.
-
Доказать в условиях эксперимента, что с помощьа комплексного использования иммуномодуляторов и гриппозных вакцин можно добиться стимуляции противогриппозной защиты, не зависящей от антигенной изменчивости вируса гриппа.
-
Предложить и апробировать в исследованиях на людях способы профилактики гриппозной инфекции, не зависящие от антигенной изменчивости вируса гриппа, основанные на целенаправленном управлении вакцинальным иммунитетом с помощьа иммуномодуляторов.
-
Разработать новую лекарственную форму человеческого ре-комбинантного альфа-2 интерферона - мази, и, используя предложенную технологию, создать ряд высокоэффективных иммуностимулирующих препаратов местно-рєзорбтивного действия.
Научная новизна и значимость работы. В результате исследований разработана новая концепция оптимизации профилактики гриппа, основанная на управлении функциональным состоянием систем интерферона и иммунитета с помощьи отобранных иммуномодуляторов, обладающих свойством защищать эти системы от депрессивного воздействия вируса гриппа и усиливать выработку интерферона и формирование противогриппозного клеточного иммунитета широкого спектра действия.
Впервые обнаружено наличие интерферошндуцируицего, иммуно-стимулирувдего и противогриппозного действия у ряда соединений растительного, микробного и синтетического происхождения, в том числе у некоторых офицяналышх препаратов, используемых в медицинской практике по другим назначениям (расширение показаний для применения) и проведено их сравнительное изучение, как в условиях эксперимента, так и в клинических наблюдениях (препараты кеньиеня,
экстракт элеутерококка, сапарал, настойка китайского лимонника, мефєнаминовая кислота, германайорганачеакие соединения и др.). Установлена и изучена возможность регуляции систем интерферона и иммунитета с помощью отобрашшх наиболее эффективных препаратов
Впервые обнаружено противовирусное действие при экспериментальном гриппе нового типа индукторов интерферона, разработанных на основе нового вида лекарственного растительного сырья, содержащего помимо биологически активных веществ растительного происхождения синтетические соединения, обладающие интерферониндуцнрую щим действием.
Впервые получен профилактический эффект, не зависящий от антигенной изменчивости вируса гриппа, при использовании гриппозных вакцин в сочетании с индукторами интерферона типа гамма, разрешенными для применения в медицинской практике, что позволяет использовать одну и ту же вакцину для защиты людей от гриппозной инфекции, вызываемой любым штаммом вируса гриппа типа А.
Разработан способ получения новой лекарственной формы человеческого рскомбинантного альфа-2 интерферона - мазей, и создан ряд оригинальных препаратов интерферона ыестно-резорбтавного действия.
Изучено влияние одного из важнейших иммунорегуляторов ин-терлейкина-2 на митоген-индуцированную продукцию гамма-интерферона, С-реактивного белка и интенсивность реакции бласттрансфор-мации лимфоцитов, и разработаны показания для назначения иммуномо-дуляторов с целью создания противогриппозного вакцинального иммунитета широкого спектра действия, а также разработаны тесты, га-рантируодие безопасность использования этих препаратов.
Практическая ценность, внедрение подученных результатов.
Сравнительное изучение интерфероншодцируыцего, иммуномоду-лирупцего и противовирусного действия свыше 100 природных и синтетических соединений позволило отобрать .клинически перспективные препараты, оказывающие регу лиру идее воздействие на системы интерферона и иммунитета: фитопрепараты, полученные на основе растениі семейства аралиевых и культур их тканей, в том числе обогащенные соединениями германия, дипиридамол, цродигиозан, германийоргани-ческие соединения, левамизол, мефенаминовую кислоту, амиксин.
Разработаны схемы использования ряда отобранных препаратов с целью защиты от гриппа и других 0P3.
Совместно с Химико-фармацевтическим институтом (Оанкт-Петер-
бург) виявленії оригинальные индукторы интерферона я иммуноаоду-ллторы, полученные на основе культур тісаней растений семейства аралиевых и разработаны рекомендации по их применению. Получено авторское свидетельство на изобретение >* I4I2295 от 22.03.1966 г. - "Штамм культивируемых клеток растений Panax finnon,- с. л, :..с,>, используемый для получения биологически активных веществ и как иммуномодулятор" совместно с Мининой С.А., Слепян Л.И., Михайловой Н.В. и др. Проведены доклинические испытания одного из этих препаратов ("Биоженьшеня") при экспериментальном гриппе, что дослужило основой для проведения клинических испытаний и в дальнейшем для получения разрешения Минздрава РФ на его производство и использование у людей. В 1988 году начато производство препарата производственно-экспериментальным заводом "Санитас" (Латагя). В СНГ "Биоженьшень" выпускается биохимическим заводом в г.Киришл Ленинградской области.
Наряду с этим проведены исследования по усилению интерферон-индуцирущего и противовирусного действия нового фитопрепарата с помощью германийорганического соединения LX (З і что позволило соз.оать более эффективный модулирующий препарат "Биоженьшень-13" (или "Панаксел"). Проведены его доклинические испытания при экспериментальном гриппе, на основании чего получено разрешение на проведение клинических испытаний. В 1993 году Фармакологическим комитетом Минздрава РФ разрешен ограниченный промышленный выпуск препарата "Панаксел".
Результаты изучения интерфероникду пирующего и иж.іу но модулирующего действия отобранных фитопрепаратов была использованы при разработке биологически активных добавок к пище, нормализующих функциональное состояние иммунной системы и способствующих оздоровлению всего организма. Среда них "Биопан" и "Панасорб" проділи клинические испытания и имеют гигиенические сертификаты. Биологически активные пищевые добавки а также указанные выие лекарственные фитопрепараты созданы на базе Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.
Наряду с этим разработан ряд высокоактивных препаратов человеческого рекомбйнаитного альфа-2 интерферона местно-резорбтивно-го действия. С их помощью удается достичь высоких концентраций интерферона непосредственно в очаге поражения и вокруг него, следствием чего является их выраженное противовирусное, иммуностимулирующее и обезболивающее действие. Совместно с НИИЗ.,1 лм.Н.Ф.Г;:-
.чалеи РАЛІ на один из препаратов альфа-2 интерферона местно-ре-эорбтивного действия (товарный знак "Кнтергєн") разработаны пакети научно-технической документации (экспериментально-производственный регламент, временная фармакопейная статья, программа Государственных испытаний и др.), переданные в ЖЖ им.Д.А.Тара-севича и Фармакологический комитет Минздрава РФ, и проведены Государственные испытания препарата при хронической рецидивиру щей герпетической инфекции на клинических базах москвы и Санкт-Петербурга, показавшие его высокую эффективность.
Предложены способы усиления профилактической эффективности гриппозных вакцин с помощьп офацинальных препаратов, обладающих свойством индуцировать в организме человека выработку гамма-интерферона, что дало возможность осуществлять у людей эффективную профилактику гриппозной инфекции вне зависимости от антигенной изменчивости вируса гриппа. Предложенные методические разработки (получено 4 удостоверения на рационализаторские предложения) использованы в работе НИИ гриппа МЗ РФ.
Разработаны и внедрены в практику работы вирусологических лабораторий Таллиннского НИИ эпидемиологии, шкробиологии и гигис ны J Эстонии и НИИ гриппа РАШ методические рекомендации "Микро-методы лабораторной оценки безвредности и иммуногеяной активности гриппозных вакцин и неспецифической резистентности к вирусам гриппа в наблюдениях на детях" (Таллинн, 1983).
Разработаны показания для назначения иммуномодуляторов, а также тесты, гарантирунцие безопасность их использования.
Положения, выносимые на защиту.
Расширен спектр препаратов, обладащих интерферониндуцирую-щей активностью и отобранных в процессе скрининга среди веществ растительного а микробного происхождения, а также полученных путем синтеза. Исследованы профилактический и терапевтический эффекты отобранных препаратов при гриппозной инфекции. Выявлено наличие интерфероногенного и противовирусного действия у новых фитопрепаратов, созданных на основе культур тканей растений семейства аралиевых.
Установлено противовирусное действие нового типа индукторов интерферона, разработанных на основе нового вида лекарственного растительного сырья, содержащего помимо биологически активных веществ растительного происхождения синтетические соединения, обладающие йнтерферониндуцирующим действием.
Разработана новая лекарственная форма человеческого реком-бинантного альфа-2 интерферона - мази, и с использованием предложенной технологий создан ряд высокоэффективных иммуностиму-лирущих препаратов местно-резорбтивного действия, имсщипцах длительный срок хранения и обладапцах выраженными противовирусным и обезболивавшим эффектами.
Установлено наличие антидепрессивяого действия у интерферс—. нов эндогенного и экзогенного происхождения по отношению к функциональному состоянию систем интерферона и клеточного иммунитета, на которые вирус гриппа оказывает депрессивное воздействие.
Разработана новая концепция борьбы с вирусными инфекциями и свойственными им интерферондефицитным и иммунодефицитным синдромами, заключавшаяся в целенаправленной коррекции функционального состояния систем интерферона и иммуногенеза с помощью иммуномодуляторов, способствующих предотвращению развития этих синдромов.
Обоснован новый подход к борьбе с вирусными инфекциями, позволивших разработать схемы повышения профилактической эффективности гриппозных вакцин, используя которые можно создать перекрестный иммунитет между штаммами вируса гриппа типа А, чего не удается достигнуть при введении вакцин без иммуномодуляторов.
Впервые наряду с экспериментальными препаратами для усиления профилактической эффективности гриппозных вакцин использованы официнальнне препараты, отобранные в процессе скрининга и обладавшие свойством индуцировать в организме человека выработку гамма-интерферона, оказывающего антидепрессивное действие. Это позволит осуществить у людей эффективную профилактику гриппозной инфекции вне зависимости от антигенной разновидности эпидемического штамма вируса гриппа, чего не удается достичь при использовании современных гриппозных вакцин.
Показано тесное взаимодействие гамма-интерферона с одным из основных медиаторов иммунитета интерлейкнном-2, который не только значительно усиливает его продукции в ответ на введение Т-ми-тогена, но и сам является индуктором гамма-интерферона в культуре человеческих лимфоцитов. Эта результаты были использованы при разработке показаний и противопоказаний, для назначения модулирующих препаратов, з том числе и при их применении в сочетании с гриппозными вакцинами, а также при разработке тестов, гарантирующих безопасность использования этих препаратов.
- о -
Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и положения диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Вирусы человека и животных" (Рига, 1981); на заседаниях Ленинградского отделения Всероссийского научного общества эпидемиологов и микробиологов (1982 - 2 доклада; 1987; 1988 - 2 доклада; 1989); на У Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ (Рига, 1983), на Всесоюзном симпозиуме "Комплексная профилактика гриппа и других вирусных острых респираторных заболеваний у детей" (Таллинн, 1983); на П Меадународном симпозиуме до элеутерококку (Москва,
1984 - 2 доклада); на И Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995).
Основные положения диссертации отражены в I авторском свидетельстве на изобретение, I методических рекомендациях и 24 опуб ликованных научных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах машинописного текста, включая 71 таблицу и 10 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включает 85 отечественных и 306 иностранных источников.