Введение к работе
Актуальность проблемы,
Альфа-фетопротеин (АФП) был впервые описан как основной компонент эмбриональной сыворотки млекопитающих, который синтезируется висцеральной энтодермой желточного мешка и клетками эмбриональной печени. Сразу после рождения уровень АФП в сыворотке снижается на несколько порядков. Синтез АФП возобновляется при возникновении опухолей печени и тератобластом, а также при химических и механических повреждениях печени, сопровождающихся регенерацией, и при остром вирусном гепатите. Изменение уровня АФП в сыворотке является важным диагностическим признаком и широко используется в клинической практике.
В свете изложенных выше фактов изучение молекулярных и клеточных механизмов, участвующих в регуляции синтеза АФП, представляется важной проблемой современной биологии. Ген АФП входит в семейство альбуминовых генов, все представители которого локализованы на одной хромосоме, причем гены сывороточного альбумина (СА), АФП и а-альбумина непосредственно примыкают друг к другу (РИС. 1) (Belanger, 1994). Возможно, кластерное расположение этих генов необходимо для координированной регуляции их экспрессии.
В настоящее время полностью клонированы и секвенированы как сам ген АФП, так и его 5'-регуляторный район, в котором выявлен ткане-специфический промотор, три независимых энхансера и сайленсер, по крайней мере частично определяющий падение экспрессии гена АФП во взрослой печени (РИС. 1). Идентифицированы связывающиеся в основном с промотором гена АФП общераспространенные и тканеспецифиче-ские транскрипционные факторы, в том числе так называемые гепатоци-тарные ядерные факторы (ГЯФ), участвующие в регуляции экспрессии большинства генов печени. Однако механизмы, определяющие значительные колебания уровня Синтеза АФП в процессе онтогенеза и при канцерогенезе, пока не ясны.
В настоящей работе моделью для изучения механизмов регуляции экспрессии гена АФП послужила коллекция клонов крысиной гепатомы McA-RH 7777, различающихся по уровню синтеза АФП, полученная в лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН Т.Л.Эрайзер. Мы исходили из предположения, что сравнительное исследование клонов, отобранных из одной клеточной линии по АФП-фенотипу, позволит вы-
явить минимальные различия, влияющие на уровень экспрессии исследуемого гена.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение молекулярных механизмов, участвующих в регуляции экспрессии гена АФП в опухолевых клетках путем сравнения АФП-продуцирующих (АФП*) и АФП-непродуцирующих (АФП) клонов крысиной гепатомы. Для этого предстояло решить следующие экспериментальные задачи:
-
Проанализировать уровни экспрессии мРНК АФП в описанных выше клонах и выбрать для дальнейшего изучения клоны с наиболее различающимися уровнями экспрессии.
-
Сравнить уровни метилирования 5'-регуляторного района гена АФП в АФП' и АФП клонах.
-
Сравнить уровни экспрессии мРНК репортерного гена, контролируемого регуляторными элементами гена АФП, в исследуемых клонах.
-
Изучить закономерности экспрессии генов, кодирующих гепатоцитарные ядерные факторы (HNF1, HNF3, HNF4), и попытаться выяснить их роль в поддержании АФП-фенотипа в различных клонах.
-
Провести слияние АФП' и АФП клонов для выяснения преобладающего механизма, определяющего различие уровней экспрессии гена АФП в клонах крысиной гепатомы.
Научная новизна.
Разработан новый эффективный метод трансфекции
эукариотических клеток. В ходе работы впервые проведен молекулярно-биологический анализ клонов с различным АФП-фенотипом, полученных из одной клеточной линии, и показано, что эти различия определяются на транскрипционном уровне. Исследованы уровни экспрессии генов АФП, сывороточного альбумина и ГЯФ в АФП' и АФП клонах. Впервые выявлена корреляция между уровнями экспрессии генов АФП и HNF4 в гепатомных клетках. Обнаружена также корреляция уровней экспрессии гена АФП и генов СА и HNF1 в исследованных клонах. Получены данные, указывающие на существование в АФП клонах регуляторных факторов, способных подавлять экспрессию гена АФП.
Практическая значимость.
В ходе работы получены новые данные о механизмах регуляции он-ко-эмбрионального маркера АФП, широко используемого в клинической практике. Клоны крысиной гепатомы, охарактеризованные а настоящем
исследовании, представляются многообещающей моделью для выявления новых транскрипционных факторов, определяющих уровень экспрессии гена АФП в опухолевых клетках. Предложенный новый метод транс-фекции может быть широко использован в молекулярно-биологических исследованиях, проводимых как на первичных культурах, так и на культурах опухолевых клеток.
Апробация работы.
Материалы исследований были представлены на XVIII и XIX конференциях Международного общества онкоэмбриональной биологии и медицины (Москва, 1990 и Сиена, 1991), международных конференциях "Молекулярные аспекты канцерогенеза в печени" (Дельфы, 1994), "Генные технологии в анализе и лечении злокачественных и наследственных заболеваний человека, связанных с развитием" (Санкт-Петербург, 1994), "Развитие, регуляция генов и болезни печени" (Аркашон, 1995), IV Всероссийском симпозиуме по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 1995), I Съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996).
Основные результаты работы изложены в 9 публикациях. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ и лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН.
Структура работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на страницах, содержит 2-?- рисунков и таблиц. Список литературы включает4'(5публикаций.