Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Общая характеристика IL-33, члена семейства цитокина IL-1 14
1.1.1. Структура гена и белка IL-33 14
1.1.2. Конститутивная и индуцируемая экспрессия IL-33 16
1.1.3. Регуляция активности IL-33 17
1.2. Сигнальный путь IL-33/ST2 21
1.3. Роль IL-33 в иммунной системе 23
1.3.1. Роль IL-33 во врожденном иммунитете 23
1.3.2. Роль IL-33 в адаптивном иммунитете 24
1.3.3. Роль IL-33 в канцерогенезе 25
1.3.4. Роль IL-33 в аллергических заболеваниях дыхательной системы на примере астмы 29
1.4. Однонуклеотидные полиморфизмы и подходы к их функциональной аннотации 33
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Поиск регуляторных элементов гена IL33 при помощи биоинформатических баз данных 39
2.2. Методы работы с эукариотическими клетками 39
2.2.1. Культивирование клеточной линии NCIH-196 39
2.2.2. Снятие прикрепленных клеток с культуральных флаконов и планшетов 40
2.2.3. Замораживание и размораживание эукариотических клеток 40
2.2.4. Трансфекция клеток NCIH-196 с использованием XremeGENE HP DNA Transfection Reagent и XremeGENE siRNA Transfection Reagent 41
2.2.5. Активация клеток NCIH-196 с иcпользованием TNF и кортизола 42
2.3. Молекулярно-биохимические и иммунологические методы 42
2.3.1. Создание люциферазных репортерных конструкций на основе вектора pGL3 basic 42
2.3.1.1. Амплификация регуляторных элементов гена IL33, содержащих различные варианты полиморфизмов rs928413 и rs4742170, и точечный мутагенез потенциальных сайтов связывания факторов транскрипции CREB1 и GR 44
2.3.1.2. Очистка фрагментов ДНК 48
2.3.1.3. Рестрикция и лигирование фрагментов ДНК 49
2.3.2. Получение компетентных бактериальных клеток E.coli 49
2.3.3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока 49
2.3.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК 50
2.3.5. Проверка собранных люциферазных конструкций 51
2.3.6. Тестирование активности конструкций с геном-репортером Firefly luciferase 51
2.3.7. Выделение РНК 53
2.3.8. Измерение концентрации РНК/ДНК в растворе 53
2.3.9. Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 54
2.3.10. Синтез первой цепи комплементарной ДНК (кДНК) 54
2.3.11. Измерение относительной экспрессии генов методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР с обратной транскрипцией, RT-PCR) 54
2.3.12. Анализ уровня белков методом Вестерн-блоттинг 57
2.3.13. Оценка связывания транскрипционных факторов CREB1 и GR с последовательностями регуляторных элементов гена IL33 методом DNA pull-down 58
2.3.14. Подавление экспрессии генов CREB1 и GR с использованием siRNA 62
2.4. Статистическая обработка данных 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Предположительные регуляторные элементы гена IL33, перекрывающиеся с полиморфизмами rs928413 и rs4742170, были идентифицированы с использованием биоинформатических ресурсов 64
3.2. Роль полиморфизма rs928413, ассоциированного с повышенным риском развития астмы, в регуляции промотора гена IL33 66
3.2.1. Присутствие "G" аллеля полиморфизма rs928413 коррелирует с повышением активности промотора гена IL33 66
3.2.2. "G" аллель полиморфизма rs928413 ассоциирован с предположительным сайтом связывания транскрипционного фактора CREB1 в промоторе гена IL33 67
3.2.3. TNF-опосредованная активация стимулирует фосфорилирование фактора CREB1 68
3.2.4. Рисковый "G" аллель полиморфизма rs928413 создает сайт связывания CREB1 в промоторе гена IL33 70
3.2.5. Активация фактора CREB1 ассоциирована с повышением активности промотора IL33 в клетках NCIH-196 72
3.3. Роль полиморфизма rs4742170, ассоциированного с развитием свистящего хрипа в дошкольном возрасте, в регуляции энхансера гена IL33 74
3.3.1. Предположительный энхансер, содержащий полиморфизм rs4742170, стимулирует активность промотора IL33 74
3.3.2. "Т" аллель полиморфизма rs4742170 ассоциирован с исчезновением предположительного сайта связывания фактора GR в энхансере гена IL33 76
3.3.3. Активация, опосредованная кортизолом, стимулирует фосфорилирование фактора GR 77
3.3.4. "Т" аллель полиморфизма rs4742170 разрушает сайт связывания транскрипционного фактора GR в энхансере гена IL33 79
3.3.5. Активация фактора GR ассоциирована с уменьшением активности промотора IL33 80
Заключение 83
Выводы 85
Список литературы 86
- Регуляция активности IL-33
- Однонуклеотидные полиморфизмы и подходы к их функциональной аннотации
- Оценка связывания транскрипционных факторов CREB1 и GR с последовательностями регуляторных элементов гена IL33 методом DNA pull-down
- Активация фактора GR ассоциирована с уменьшением активности промотора IL33
Регуляция активности IL-33
По сравнению с классическими цитокинами, IL-33 не секретируется традиционным путем через эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи, а пассивно выделяется клетками под влиянием механического стресса и повреждения (Kakkar et al., 2012), в результате некроза (Moussion, Ortega, Girard, 2008) и некроптоза (Metcalf et al., 2014), а также в ходе патологического заживления ран и фиброза (Mchedlidze et al., 2013)(Molofsky et al., 2015). Таким образом, внеклеточный IL-33 предупреждает иммунную систему о наличии повреждения клеток и тканей (Moussion, Ortega, Girard, 2008). IL-33 выделяется клетками в виде белка-предшественника (Рис.3). Несмотря на то, что полноразмерный цито-кин функционален сам по себе, в воспалительных условиях его активность возрастает в десятки раз в результате расщепления протеазами нейтрофилов (протеиназа 3, катепсин G и эластаза) (Lefrancais et al., 2012) и тучных клеток (химаза, триптаза и гранзим В) (Lefrancais et al., 2014), а также под воздействием протеаз, обнаруженных в потенциальных аллергенах, таких как грибы, насекомые, растения и бактерии (трипсин, папаин, суб-тилизин) (Cayrol et al., 2018). При этом образуются зрелые гиперактивные формы белка массой 18-21 кДа, которые утратили сигнал ядерной локализации (Bartemes et al., 2012). Подобное разнообразие протеаз, способных к расщеплению и активации IL-33 предшественника, позволяет предположить, что процессинг является ключевым этапом регуляции биологической активности цитокина. Кроме того, данный механизм образования гиперактивных форм IL-33 может играть ключевую роль в ситуациях, когда полноразмерный цитокин присутствует в среде в низкой концентрации, либо отличается пониженной активностью.
Биологическая активность IL-33, как и других аларминов, требует надежного контроля для ограничения воспалительной реакции, вызванной повреждением клеток. Главным механизмом регуляции IL-33 в нормальных условиях, по всей видимости, является его ядерная локализация (Рис.4А). В частности, на мышиной модели было показано, что делеция N-концевого домена, содержащего NLS, стимулирует постоянное высвобождение IL-33 и последующее развитие множественных очагов воспаления, а также смерть организма в возрасте трех месяцев (Bessa et al., 2015). Кроме того, было продемонстрировано, что повышенная секреция IL-33 в кератиноцитах трансгенных мышей провоцирует разви тие у последних спонтанного кожного воспаления (Kurow et al., 2017). Таким образом, локализация IL-33 в ядрах клеток-продуцентов необходима для предотвращения нежелательной активности цитокина и поддержания нормального функционирования организма.
Результаты множества исследований показали, что максимальная концентрация IL-33 наблюдается во внеклеточном пространстве спустя пару часов после начала высвобождения, но практически не детектируется через 6 часов (Gadani et al., 2015)(Cohen et al., 2015)(Gonzalez-de-Peredo et al., 2012). Известно, что одним из главных механизмов регуляции для данного цитокина являются посттрансляционные модификации: ограниченный протеолиз и окисление по остаткам цистеина. Изначально предполагалось, что наряду с другими членами IL-1 семейства (IL-1, IL-18), полноразмерный IL-33 созревает в результате расщепления каспазой-1, которая функционирует в составе инфламмасомы (белкового комплекса, обеспечивающего протеолитическую активацию провоспалительных цито-кинов) (Schmitz et al., 2005). Позднее оказалось, что цитокин способен полноценно функционировать в виде молекулы-предшественника (Lefrancais et al., 2012), как и IL-1 (Dinarello, 2009), и не является субстратом ни для каспазы-1, ни для других провоспали-тельных каспаз (-4 и -5) (Talabot-Ayer et al., 2009)(Brumatti et al., 2009). В то же время было продемонстрировано, что в ходе апоптоза IL-33 расщепляется эффекторными каспаза-ми -3 и -7 с образованием двух неактивных фрагментов (Brumatti et al., 2009)(Lamkanfi, Dixit, 2009) (Рис.4Б). Стоит отметить, что активированные тучные клетки способны выделять каспазу-3 при IgE-опосредованной стимуляции антигеном (Garcia-Faroldi et al., 2013). Таким образом, данная каспаза может стимулировать деградацию IL-33 и во внеклеточном пространстве, подавляя избыточную активность цитокина при воспалении (Zorn et al., 2013).
Воспалительные протеазы так же могут быть вовлечены в инактивацию IL-33. Например, химаза тучных клеток принимает участие в деградации IL-33 у мышей (Waern et al., 2013). Протеиназа-3 (протеаза нейтрофилов) способна как активировать, так и инги-бировать IL-33 (Bae et al., 2012). Вероятно, деградация цитокина, опосредованная воздействием протеаз, может играть важную роль для ограничения активности IL-33 in vivo.
Относительно недавно был открыт еще один способ ингибирования активности IL-33. Оказалось, что внеклеточный цитокин может быть быстро инактивирован в результате окисления четырех остатков цистеина в С-концевом домене (Cys208, Cys227, Cys232, Cys259) (Рис.4В). Данная реакция приводит к образованию дисульфидных мостиков, вызывающих конформационные изменения, которые предотвращают связывание цитокина со своим рецептором (Cohen et al., 2015). Подобная инактивация занимает несколько минут и может происходить быстрее, чем деградация белка. В аналогичных условиях в С-концевом домене некоторых других членов IL-1 семейства (IL-18, IL-1, IL-36 и IL-36) также образуются дисульфидные связи (Cohen et al., 2015)(Yamamoto et al., 2004). Авторы предполагают, что окисление по остаткам цистеина может являться важным механизмом регуляции активности для цитокинов семейства IL-1.
Ограничение активности внеклеточного IL-33 может происходить также за счет связывания с растворимым рецептором sST2 (Рис.4Г), о котором будет рассказано в следующем разделе.
Однонуклеотидные полиморфизмы и подходы к их функциональной аннотации
Индивидуальные различия последовательности ДНК в геноме представителей одного вида обусловлены структурными вариациями в участках геномных повторов, а также полиморфизмами, возникающими вследствие мутаций. Полиморфизмом называют одновременное существование в популяции нескольких аллельных вариантов одного гена, причем частота встречаемости редких алелей должна составлять не менее 1%. Простейшим и самым распространенным вариантом полиморфизма является однонуклеотидная замена, или SNP (single-nucleotide polymorphism) (Shastry, 2002). В геноме человека подобные полиморфизмы встречаются в среднем через каждые 300 - 1000 пар оснований. Некоторые из них обуславливают возникновение фенотипических различий между людьми, включая морфологические, физиологические и поведенческие признаки, а также предрасположенность к заболеваниям.
На данный момент существует целый спектр полномасштабных исследований – GWAS (Genome-Wide Association Studies), направленных на идентификацию SNP и сравнение частот их аллелей у людей в исследуемой и контрольной группах. Данные исследования ориентированы на поиск функционально значимых SNP – полиморфизмов, для которых подтверждена статистически достоверная ассоциация с развитием определенных признаков и заболеваний. Примеры клинически значимых SNP в генах, обеспечивающих функциональность иммунной системы, приведены в таблице 1.
Функционально значимые SNP ожидают найти в первую очередт в экзонах, где изменения аминокислотной последовательности соответствующих белков могут оказывать прямое или косвенное воздействие на фенотип (Lohrer & Tangen, 2000). Однако, более 90% клинически значимых SNP локализованы в некодирующих участках генов – предсказанных цис- и транс-регуляторных элементах. Определение данных областей обычно происходит посредством оценки доступности хроматина (с помощью методов DNase-seq, FAIRE-seq, ATAC-seq, или MNase-seq), связывания транскрипционных факторов и присутствия характерных модификаций гистонов H3K27ac, H3K4me1 и H3K4me3 (Maurano et al., 2012)(Schaub et al., 2012). Поскольку механизмы контроля транскрипции достаточно сложны, однозначное определение генов-мишеней для регуляторных элементов может быть затруднено (Edwards et al., 2013).
Предполагается, что ассоциация функционально значимых некодирующих SNP с развитием заболеваний обусловлена их влиянием на активность регуляторных элементов и последующим изменением экспрессии генов. В пользу данной гипотезы свидетельствует обнаружение рисковых аллелей SNP в геномных локусах eQTL (expression quantitative trait loci) (Albert, Kruglyak, 2015). Данные области содержат нуклеотидные варианты, связанные с изменениями экспрессии одного или нескольких генов. Помимо воздействия на активность регуляторных элементов, SNP могут изменять экспрессию генов, влияя на сплайсинг и стабильность мРНК (Pai, Pritchard, Gilad, 2015). Кроме того, некоторые исследования указывают на ассоциацию полиморфизмов с изменением уровня метилирования ДНК (Kaplow et al., 2015) и чувствительности к ДНКазе (Degner et al., 2012).
Для проверки функциональности регуляторных элементов, содержащих интересующие SNP, могут быть использованы различные методы. Стандартный подход подразумевает in silico анализ, оценивающий влияние SNP на связывание транскрипционных факторов с сайтами. Альтернативный подход заключается в функциональном тестировании кандидатных регуляторных областей, включающих как рисковые, так и протективные аллели полиморфизмов. Для этого широко используются тесты с геном-репортером, проводимые in vitro: регуляторные элементы клонируют в вектор с репортерным геном, транс-фецируют полученными конструкциями релевантную клеточную линию и сравнивают активность регуляторных элементов с альтернативными аллелями SNP (Gallagher, Chen-Plotkin, 2018).
Репортерная тест-система полезна для изучения роли SNP в экспрессии генов, но имеет некоторые ограничения. Во-первых, при таком анализе детектируется определенный уровень транскрипционного шума, следовательно, его результаты не всегда воспроизводимы (Brown, Mangravite, Engelhardt, 2013). Во-вторых, небольшие различия в репор-терной активности могут быть результатом различий в количестве, трансфецируемых плазмид, неизбежно возникающих даже при очень точном измерении коцентрации ДНК. В-третьих, уровень транскрипционной активности определяется в контексте плазмидной ДНК, а не нативного генома, в котором исследуемые аллели действительно существуют (Inoue, Ahituv, 2015). Подобный анализ может давать ложноотрицательные и ложнополо-жительные результаты из-за сложной взаимосвязи между ДНК, гистонами, транскрипционными факторами, некодирующими РНК и дистанционным взаимодействием участков хроматина. Несмотря на существующие ограничения, преимущество данного подхода заключается в возможности исследования изолированного эффекта конкретных аллелей SNP.
C 2005 года проведено более четырех тысяч GWAS и выявлено огромное множество локусов, ассоциированных с заболеваниями. Тем не менее, наблюдается острая нехватка исследований, описывающих функциональные механизмы наблюдаемых ассоциаций (Gallagher, Chen-Plotkin, 2018). В таблице 2 приведены примеры данных исследований.
Установлено, что локус гена IL33 включает однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs), ассоциированные с повышенным риском развития астмы в различных популяциях (Gudbjartsson et al., 2009)(Torgerson et al., 2011)(Bonnelykke et al., 2014), а также с возникновением определенных фенотипов при заболеваниях дыхательной системы (Moffatt et al., 2010). Объектами нашего исследования стали два SNPs: rs928413 (A/G) и rs4742170 (С/T), локализованные в 5 области и во втором интроне гена IL33, соответственно. Известно, что носители минорного «G» аллеля полиморфизма rs928413 более чувствительны к развитию астмы в раннем возрасте (Bonnelykke et al., 2014), а также к развитию атопической астмы (Chen et al., 2015). Наличие rs928413(G) также коррелирует со снижением легочной функции и с повышением уровня сывороточного IgE у пациентов-астматиков, указывая на возможную связь данного аллеля с обострением симптомов астмы (Chen et al., 2015). В то же время для rs928413 продемонстрирована ассоциация с повышенным риском развития сенной лихорадки (Schrder et al., 2016), что свидетельствует о возможном участии данного SNP в аллергическом воспалении.
В свою очередь, рисковый «Т» аллель полиморфизма rs4742170 коррелирует с возникновением свистящего хрипа в детском возрасте (Savenije et al., 2014). Согласно исследованиям Savenije и соавторов, данный тип хрипа ассоциирован с появлением повышенной чувствительности к аллергенам и возможно влияет на последующее развитие астмы у детей (Savenije et al., 2014).
Таким образом, выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов rs928413 и rs4742170 с повышенным риском развития астмы, является практически важной и интересной задачей. В представленной работе мы предложили возможное механистическое объяснение негативной роли обоих полиморфизмов в индукции аллергических расстройств дыхательной системы.
Оценка связывания транскрипционных факторов CREB1 и GR с последовательностями регуляторных элементов гена IL33 методом DNA pull-down
Для выявления зависимости связывания факторов CREB1 и GR с промотором и эн-хансером гена IL33 от определенных вариантов полиморфизмов rs928413 и rs4742170 использовали метод DNA pull-down. Применение данного метода в нашей задаче подразумевало проведение следующих этапов: смешивание фрагментов промотора/энхансера IL33 с ядерными экстрактами из активированных клеток легочной карциномы NCIH-196, добавление антител к рCREB1/pGR и последующая преципитация ДНК-белковых комплексов на магнитных шариках (Рис.11). Измерение уровня целевой ДНК в пробах после осаждения осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени.
На первом этапе с использованием ранее созданных вариантов промотора и энхансера/Z33 (п. 2.3.1.1) были амплифицированы фрагменты длиной 200 п.н. (по отношению к сайту старта транскрипции гена IL33 расположены в пределах позиций -2500/-2300 и +27776/+27976, соответственно):
участок промотора, содержащий rs928413(А) и оригинальный сайт связывания CREB1
участок промотора, содержащий rs928413(G) и оригинальный сайт связывания CREB1
участок промотора, содержащий rs928413(А) и мутированный сайт связывания CREB1
участок промотора, содержащий rs928413(G) и мутированный сайт связывания CREB1
участок энхансера, содержащий rs4742170 (С) и оригинальный сайт связывания GR
участок энхансера, содержащий rs4742170 (Т) и оригинальный сайт связывания GR
участок энхансера, содержащий rs4742170 (С) и мутированный сайт связывания GR
участок энхансера, содержащий rs4742170 (Т) и мутированный сайт связывания GR
Кроме того, в качестве контроля мы амплифицировали участок ДНК, не содержащий сайтов связывания CREB1 и GR (проверено с помощью онлайн-сервиса Jaspar). Наряду с остальными апликонами, он участвовал во всех этапах эксперимента. Последовательности праймеров для амплификации исследуемых фрагментов:
На следующем этапе проводили выделение ядерных экстрактов, являющихся источником факторов CREB1и GR, из клеток NCIH-196, активированных TNF либо кортизо-лом. Центрифугировали клетки в количестве 25 млн (140g, 5 мин, 4C) и промывали охлажденным буфером PBS. Затем ресуспендировали осадок в сахарозном буфере А (0,32 M сахароза, 10 мM Tris-HCl pH 8.0, 3 мM CaCl2, 2 мM ацетат магния, 0,1 мM ЭДТА, 1 мM DTT, 0,5 мM PMSF, 0,5% NP-40, раствор ингибиторов протеаз SIGMA FAST S8820) из расчета 1 мл буфера на 10-12 млн клеток (приблизительно 5:1 по объему первичного осадка), после чего перемешивали на вортексе (5-10 секунд) и лизировали на льду (5 минут). Центрифугировали смесь (13200g ,15 сек, 4C) и удаляли супернатант. Гелеобразный осадок (осажденные ядра клеток) ресуспендировали в буфере B с низкой ионной силой (20 мM HEPES pH 7,9, 25% глицерин, 1,5 мM MgCl2, 0,2 мM ЭДТА, 0,02 M KCl, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF, раствор ингибиторов протеаз SIGMA FAST S8820) в объемном соотношении 1:1. К полученной смеси добавляли буфер С с высокой ионной силой (20 мM HEPES pH 7,9, 25% глицерин, 1,5 мM MgCl2, 0,8 M KCl, 0,2 мM ЭДТА, 1% NP-40, 0,5 мM DTT, 0,5 мM PMSF, раствор ингибиторов протеаз SIGMA FAST S8820) в объемном соотношении 2:1 и инкубировали 10-15 мин на льду, а затем центрифугировали (13200g, 20 мин, 4C). На льду помещали аликвоты супернатанта в криопробирки (по 100 мкл), после чего хранили в жидком азоте.
К 200 мкл буфера для инкубации (60 мM KCl, 12 мM HEPES pH 8.0, 4 мM Tris HCl pH 8.0, 0.5 мM ЭДТА, 5% глицерин), содержащего также 5 мкг конкурентной одноцепочечной ДНК из спермы лосося, раствор ингибиторов протеаз SIGMA FAST S8820 и 1 мМ DTT, добавляли 100 нг ДНК-ампликонов гена IL33/контрольного фрагмента и 10 мкл ядерных экстрактов (50 мкг белка). На данном этапе добавляли контрольную пробу, не содержащую ядерных экстрактов. Инкубировали на льду в течение часа, после чего добавляли 2 мкг антител к pCREB1/pGR (ab32096 и ab55189, Abcam) или соответствующее количество неспецифических IgG антител кролика в качестве изотипного контроля и инкубировали пробы (1 час, 4C) при вертикальном перемешивании. На данной стадии также добавляли контрольную пробу, не содержащую антител.
Далее осуществляли подготовку магнитных шариков с протеином-А к последующей инкубации с образцами: промывали 2-3 раза в буфере RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА pH 8,0, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, ингибиторы протеаз SIGMA FAST S8820), удаляя буфер после каждой промывки. Затем для предотвращения неспецифического связывания добавляли по 0,1 мкг БСА и по 75 нг од-ноцепочечной ДНК из спермы лосося на 1 мкл шариков, а также RIPA буфер в объемном соотношении 1:1, после чего инкубировали при вертикальном перемешивании (30 мин, 25C) и промывали шарики RIPA буфером.
На следующем этапе проводили иммунопреципитацию ДНК-белковых комплексов: к пробам, содержащим ДНК-ампликоны, ядерные экстракты и антитела, добавляли по 60 мкл магнитных шариков с протеином-А и проводили инкубацию при вертикальном перемешивании (16-18 часов, +4oC). Полученные комплексы осаждали центрифугированием (2000g, 1 мин), удаляли супернатант. Далее проводили трехэтапную промывку шариков с использованием следующих буферов:
1) низкосолевой буфер (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 150 мМ NaCl, 0,1% SDS, 2 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100);
2) высокосолевой буфер (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 500 мМ NaCl, 0,1% SDS, 2 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100);
3) буфер, содержащий LiCl (10 мМ Tris-HCl pH 8.0, 0,25 М LiCl, 1% NP-40, 1% дез-оксихолат натрия, 1 мМ ЭДТА);
После каждого этапа промывания осаждали комплексы с помощью магнитного штатива и удаляли супернатант.
На заключительном этапе эксперимента добавляли к образцам по 120 мкл буфера для элюции фрагментов ДНК (100 мМ NaHCO3 pH 8.0, 1% SDS) и инкубировали при вертикальном перемешивании (15 мин, 30оС). Затем осаждали центрифугированием (2000g, 1 мин), помещали супернатант в чистую микропробирку и добавляли по 4,8 мкл 5 М раствора NaCl. Проводили инкубацию при вертикальном перемешивании (16-18 часов, 65C), после чего добавляли по 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и РНКазы А (10 мг/мл) и снова инкубировали при вертикальном перемешивании (1 час, 45C). В конце проводили очистку ДНК-фрагментов с помощью набора реагентов GeneJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).
Для анализа уровня ДНК в полученных образцах использовали метод ПЦР в реальном времени (см. п. 2.3.11). Значения для каждой экспериментальной пробы, были нормализованы на значение для контрольного фрагмента ДНК после вычитания значений всех используемых контролей (реакции осаждения ДНК без ядерных экстрактов, без антител к pCREB/pGR, а также реакции с изотипным контролем в виде неспецифических IgG антител).
Активация фактора GR ассоциирована с уменьшением активности промотора IL33
Заключительным этапом нашего исследования стало определение роли транскрипционного фактора GR в регуляции активности промотора гена IL33. В данном эксперименте были использованы люциферазные репортерные конструкции, содержащие промотор IL33, а также энхансер с одним из вариантов SNP rs4742170 в сочетании с оригиналь ным или мутированным сайтом связывания фактора GR. В качестве дополнительного контроля была использована плазмида с промотором IL33 и нерелевантным участком.
Функциональная активность данных репортерных конструкций была проверена с помощью теста люциферазной активности. Мы проводили эксперимент в нормальных условиях и в контексте активации кортизолом (50 нг/мл) в течение 24 часов, либо при siRNA-опосредованной супрессии GR. На рисунке 21 показан нормированный результат измерения активности люциферазы Firefly в клеточных лизатах, полученный в 5 независимых экспериментах.
Согласно полученным данным, стимуляция фактора GR, опосредованная кортизо-лом, не влияет на активность промотора IL33 как в отсутствие энхансерного элемента, так и при наличии в нем мутированного сайта связывания GR. Конструкции с энхансером, содержащим рисковый rs4742170(Т) аллель, либо точечные мутации сайта GR, отличались повышенным уровнем активности промотора IL33 и были нечувствительны к воздействию кортизола. В то же время, активность промотора IL33 в конструкции с rs4742170(С) алле-лем и функциональным сайтом связывания GR была снижена, особенно при наличии кор-тизола в системе. Эффект подавления активности промотора IL33, обусловленный стимуляцией фактора GR кортизолом был нейтрализован добавлением GR-специфичных siRNA. Исходя из результатов данного эксперимента, мы сделали вывод, что отсутствие сайта связывания фактора GR опосредует нечувствительность энхансера IL33 к подавляющему воздействию кортизола и приводит к увеличению активности промотора IL33 в клетках NCIH-196. Подобный эффект может обуславливать повышенный риск возникновения свистящего хрипа, ассоциированного с последующим развитием астмы у детей, являющихся носителями “Т” аллеля однонуклеотидного полиморфизма rs4742170.
Векторные конструкции содержали ген люциферазы Firefly под контролем промотора IL33, а также контрольный участок либо энхансер с одним из вариантов SNP rs4742170. Для определения уровня активности промотора в клеточных лизатах активность люциферазы Firefly нормировали на активность люциферазы Renilla, после чего полученные значения были нормированы на активность пробы «IL33 промотор + контроль». Для стимуляции активности фактора GR к клеткам был добавлен кортизол (50 нг/мл, 24 ч). Для нокдауна гена GR клетки были трансфецированы специфичной siRNA за 24 часа до трансфекции репортерных конструкций. Представлен результат пяти независимых экспериментов. P 0.01.