Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Эпидемиология 12
1.1.1 Глобальное распространение вируса блютанга 12
1.1.2 Распространение блютанга на территории Российской Федерации 17
1.2 Структура вируса блютанга и его генома 19
1.3 Восприимчивые животные 30
1.4 Вирус блютанга в векторах переносчиках 32
1.5 Патогенез 36
1.6 Клинические симптомы и патологоанатомические изменения 38
1.7 Лабораторная диагностика блютанга 39
1.8 Использование молекулярно-генетических методов для
идентификации отдельных серотипов и вариантов вируса блютанга 42
1.9 Профилактика и меры борьбы 44
1.10 Мероприятия по ликвидации блютанга 46
1.11 Заключение по обзору литературы 48
2 Собственные исследования 51
2.1 Материалы 51
2.1.1 Вирусы 51
2.1.2 Специфические сыворотки крови 53
2.1.3 Культуры клеток 53
2.1.4 Животные 53
2.1.5 Патологический материал 53
2.1.6 Плазмиды и бактериальные штаммы 54
2.1.7 Реактивы 54
2.1.8 Лабораторное оборудование 55
2.2 Методы 55
2.2.1 Выделение вируса блютанга 55
2.2.1.1 Выделение вируса на куриных эмбрионах 56
2.2.1.2 Выделение вируса в культуре клеток 57
2.2.2 Типирование выделенного вируса блютанга в реакции
нейтрализации с типоспецифическими сыворотками 57
2.2.3 Определение инфекционной активности вируса блютанга в культуре клеток 58
2.2.4 Определение инфекционной активности вируса на куриных эмбрионах
2.2.5 Изучение вирулентных свойств вируса 59
2.2.6 Мониторинговые исследования 59
2.2.7 Исследование мокрецов 60
2.2.8 Иммуноферментный анализ 60
2.2.9 Подбор праймеров и зондов
2.2.10 Выделение нуклеиновых кислот 61
2.2.11 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза 61
2.2.12 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени 62
2.2.13 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР 63
2.2.14 Нуклеотидное секвенирование 64
2.2.15 Филогенетический анализ 65
2.2.16 Статистическая обработка результатов исследований 65
3 Результаты собственных исследований 66
3.1 Выявление и характеристика изолята «Г244/11» вируса блютанга, выделенного в 2011 г. на территории Смоленской области 66
3.1.1 Выделение и идентификация изолята «Г244/11» вируса блютанга 69
3.1.2 Изучение молекулярно-генетических характеристик выделенного в Смоленской области изолята «Г244/11» 71
3.1.3 Изучение биологических характеристик изолята «Г244/11» 77
3.2 Результаты мониторинговых исследований поголовья крупного и мелкого рогатого скота на наличие генома ВБ и антител к вирусу в Смоленской и Калужской областях 83
3.3 Исследование мокрецов рода Сulicoides на территории Смоленской и Калужской областей 85
3.4 Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга 14 серотипа 87
3.5 Разработка ОТ-ПЦР для идентификации нуклеотипов А, В, С
вируса блютанга 99
4 Обсуждение результатов исследований 109
5 Выводы 120
6 Практические предложения 121
7 Список сокращений и условных обозначений 122
8 Список литературы 124
- Распространение блютанга на территории Российской Федерации
- Культуры клеток
- Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени
- Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга 14 серотипа
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Блютанг или катаральная лихорадка овец -вирусная трансмиссивная инфекция жвачных, передающаяся кровососущими насекомыми рода Сulicoides, характеризующаяся поражением слизистой оболочки ротовой и носовой полостей, опуханием языка, отеком лицевой части головы, лихорадкой, поражением конечностей. У инфицированного крупного рогатого скота возможны аборты, рождение уродливого потомства (Сюрин В.Н. c cоавт., 1998 г.; Кухаркина О.В. с соавт., 2010 г.).
Заболевание вызывает вирус блютанга (ВБ), относящийся к роду Orbivirus, семейства Reoviridae. По данным на 2016 г. установлено 27 серотипов вируса блютанга. Определение серотипа ВБ является неотъемлемой процедурой в каждом случае его обнаружения для разработки плана мероприятий по ликвидации болезни, так как для каждого серотипа ВБ требуется своя вакцина (Schulz C.et al., 2016).
Геном вируса состоит из 10 сегментов двухцепочечной РНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, формируемый семью структурными белками. Серотип вируса детерминирован белком VP2, который кодируется 2 сегментом геномной РНК вируса блютанга (Maan S. et al., 2011).
Наиболее генетически близкие серотипы ВБ, имеющие от 29 % до 33 % нуклеотидных различий, были объединены в 12 различных групп - нуклеотипов, обозначающихся буквами A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L (Maan S. et al., 2007).
В настоящее время широко применяют диагностические тест-системы на основе различных вариантов ОТ-ПЦР для идентификации отдельных серотипов. Однако при выявлении вируса с серотипом, ранее не регистрируемым на данной территории, возникают сложности, связанные с трудоемкими процедурами постановки реакции нейтрализации. В частности, необходимо наличие полного набора референтных сывороток и пермиссивных к данному вирусу культуральных систем. Определение серотипа ВБ по идентификации геномных различий в областях, ответственных за экспрессию серотип-специфического белка VP2, с использованием метода ПЦР представляется наиболее перспективным направлением в диагностике блютанга.
Актуальность изучения блютанга для Российской Федерации (РФ) значительно возросла в 2006 г. с началом импорта племенного крупного рогатого скота (КРС) из стран Европейского Союза, в том числе из неблагополучных по блютангу государств – Германии, Голландии и др. (Караулов А.К. с соавт., 2008; Захаров В.М. с соавт., 2009, 2013; Макаров В.В. с соавт., 2013, 2014). Всего за период с 2006 по 2015 гг. было ввезено примерно 610 тыс. животных.
За период с 2008 по 2009 гг. сотрудниками лаборатории Диагностики и мониторинга ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии от импортированного КРС выделены, паспортизированы и депонированы в Государственную коллекцию микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии пять изолятов вируса блютанга 8 серотипа (Вялых И.В. с соавт., 2010).
Кроме того, в последние десятилетия наблюдается тенденция к расширению ареалов трансмиссивных инфекций, в том числе и блютанга, что делает актуальным вопрос изучения, как возбудителей данных болезней, так и их переносчиков. Сложившаяся ситуация усугубляется мировым изменением климатических условий, способствующих распространению векторов-переносчиков на новые территории и увеличению численности насекомых. Следствием этого может быть проникновение патогенов в умеренные климатические пояса обоих полушарий и рост количества вспышек в эндемических очагах (Спрыгин А.В. с соавт., 2015).
Указанные выше факты определяют актуальность выполненной работы.
1.2 Степень разработанности проблемы. За рубежом для идентификации серотипов ВБ с 2009 г. широко применяют средства на основе вариантов ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом электрофореза и в режиме реального времени (ОТ-ПЦР РВ) (Maan S. et al., 2007; Maan N.S. et al., 2012). Для проведения молекулярно-генетического анализа ВБ определяют нуклеотидные последовательности отдельных вариабельных сегментов генома или выполняют полногеномное секвенирование (Maan S. et al., 2007, 2008).
Отечественными учеными разработаны варианты ОТ-ПЦР для выявления генома ВБ и серотип-специфические ОТ-ПЦР для идентификации 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов вируса (Снетков К.А. с соавт., 2002, 2003; Гаврилова Е.А. с соавт.,
2009; Панферова А.В. с соавт., 2012).
В связи с обнаружением инфицированных животных на территории Смоленской области, актуальным является выделение и изучение биологических, молекулярно-генетических характеристик нового изолята вируса блютанга, и разработка ОТ-ПЦР РВ для идентификации эпизоотически значимого серотипа вируса. В России до настоящего времени не разработаны средства на основе ОТ-ПЦР для выявления нуклеотипов ВБ, позволяющие проводить типирование вновь выделенных изолятов вируса за более короткое время.
В настоящее время систематическое изучение ареалов и плотности популяции основных переносчиков трансмиссивных инфекций на территории России, к сожалению, проводится в рамках узких исследований и только в некоторых регионах. Это значительно затрудняет оценку риска заноса и распространения трансмиссивных инфекций в современных условиях. Поэтому, актуальным является выявление и исследование потенциальных переносчиков ВБ – кровососущих мокрецов рода Сulicoides.
1.3 Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение биологических и молекулярно-генетических характеристик изолята вируса блютанга, выделенного на территории Смоленской области, исследование потенциальных переносчиков данного вируса – кровососущих мокрецов рода Сulicoides, а также разработка тест-систем на основе ОТ-ПЦР для выявления генома вируса блютанга 14 серотипа и нуклеотипов А, В, С. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучить биологические свойства и молекулярно-генетические характеристики штамма «Г244/11» вируса блютанга 14 серотипа, выделенного на территории Российской Федерации.
-
Провести мониторинговые исследования на наличие вируса блютанга на территории Смоленской и Калужской областей.
-
Провести исследование видового состава потенциальных переносчиков вируса блютанга – кровососущих мокрецов рода Сulicoides на территории Смоленской и Калужской областей.
-
Разработать тест-систему для идентификации вируса блютанга 14
серотипа на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
-
Оценить возможность использования разработанной тест-системы для лабораторной диагностики вируса блютанга 14 серотипа методом ОТ-ПЦР РВ.
-
Разработать тест-системы для идентификации нуклеотипов А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы), В (3, 13, 16 серотипы) и С (6, 14 и 21 серотипы) вируса блютанга на основе ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом электрофореза.
1.4 Научная новизна результатов исследований. Впервые изучены
биологические свойства штамма «Г244/11» вируса блютанга, выделенного на
территории Смоленской области, определены нуклеотидные последовательности 2
(2922 п.о.) и 5 (1772 п.о.) сегментов этого штамма, что позволило отнести его к 14
серотипу и западному топотипу вируса.
В результате проведенных исследований подобраны оригинальные олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные 2 сегменту ВБ 14 серотипа, на основе которых разработана тест-система для идентификации 14 серотипа вируса блютанга методом ОТ-ПЦР РВ. Научная новизна подтверждена патентом на изобретение № 2499054 Бюл. № 32 от 20.11.2013 г.
Подобраны оригинальные олигонуклеотидные праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям 2 сегмента нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы), нуклеотипа В (3, 13, 16 серотипы) и нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) вируса блютанга, на основе которых разработаны тест-системы для идентификации этих нуклеотипов методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом электрофореза. Научная новизна подтверждена 3 патентами на изобретение (№ 2534358 Бюл. № 33 от 29.09.2014 г., № 2528745 Бюл. № 26 от 24.07.2014 г., № 2529955 Бюл. № 28 от 11.08.2014 г.).
Установлено присутствие на территории Смоленской и Калужской областей мокрецов C. pulicaris complex - потенциальных переносчиков вируса блютанга, и определен их видовой состав.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы. Нуклеотидные
последовательности 2 (2922 п.о.) и 5 (1772 п.о.) сегментов и соответствующие им
аминокислотные последовательности штамма «Г244/11» вируса блютанга 14
серотипа депонированы в международный банк данных GenBank (№ KR233814 и № KT869017).
На территории Смоленской и Калужской областей выявлены 4 вида мокрецов: C. pulicaris s.s., C.punctatus, C. impunctatus и C. grisescens, входящих в комплекс C. рulicaris. Кроме того, в пробах мокрецов был обнаружен геном ВБ.
Разработаны «Методические положения по применению набора препаратов для идентификации вируса блютанга 14 серотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени «ВБ-14/ОТ-ПЦР РВ/2», «Методические положения по применению набора препаратов для идентификации вируса блютанга нуклеотипа С методом ОТ-ПЦР «ВБ-С/ОТ-ПЦР/2», которые утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН 10.05.2013 г.
Разработаны «Методические положения по применению набора препаратов для идентификации вируса блютанга нуклеотипов А, В методом ОТ-ПЦР «ВБ-А/ОТ-ПЦР/2», «ВБ-В/ОТ-ПЦР/2», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 31.03.2014 г.
1.6 Степень достоверности и апробация результатов работы. Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений и стандартных отклонений результатов ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2012-2016 гг.).
Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на 6 Ежегодной Встрече EPIZONE ''Viruses on the move'' (Великобритания, 2012 г.), на Международной научно-практической конференции «Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС» (г. Санкт-Петербург, 2012 г.), на выездном заседании секции «Ветеринарной биотехнологии» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (г. Щелково, 2013 г.), на 8 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная
диагностика 2014» (г. Москва, 2014 г.), на IV Международной конференции по блютангу и орбивирусам (г. Рим, Италия, 2014 г.), на III Международной научной конференции молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2016 г.) и на 4 Международном конгрессе по ветеринарной диагностике EAVLD (г. Прага, Чехия, 2016 г.).
1.7 Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в
том числе 2 статьи в журналах «Биотехнология» и «Ветеринария», включенных в
перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки
Российской Федерации, получено 4 патента на изобретение.
1.8 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161
страницах и включает: введение, обзор литературы, результаты собственных
исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические
предложения, список литературы, приложения; иллюстрирована 25 рисунками и
16 таблицами.
Распространение блютанга на территории Российской Федерации
Вскоре после данного случая был выявлен ВБ 1 серотипа, который к концу 2008 года был обнаружен в нескольких странах Южной Европы, включая Испанию, Португалию и Францию (рисунок 4). В то же время, на территории Нидерландов и Германии был выявлен вирус блютанга 6 серотипа [87]. Вероятно, он был связан с модифицированными штаммами живой вакцины из Южной Африки [74, 87].
В 2008 году в Швейцарии был обнаружен новый вирус, который вызывал заболевание у коз и не принадлежал ни к одному из известных серотипов вируса блютанга. Вирус был назван Toggenburg, затем после проведения секвенирования и филогенетического анализа классифицирован как вирус блютанга 25 серотипа (рисунок 4) [88].
В 2012 году Прибалтийские государства и Польша сообщили о выявлении на их территориях животных, инфицированных вирусом блютанга. Литва, Латвия, Эстония и Польша при обращении в Комиссию ЕС в течение 2012 г. уведомляли о выявлении на территории страны животных, у которых обнаруживали атнитела к вирусу блютанга, у части данных животных в крови также детектировали геном вируса. Ни у одного из инфицированных животных не было клинических признаков блютанга. Референтная лаборатория в Пирбрайте (Великобритания) подтвердила инфицирование животных в Польше, Латвии и Литве вирусом блютанга 14 серотипа [20, 82].
В 2014 году на Корсике (регион Франции) был выявлен 27 серотип вируса блютанга. Для данного варианта вируса характерен большой процент гомологии с вирусом блютанга 25 серотипа из Швейцарии и вирусом блютанга 26 серотипа из Кувейта [41, 59, 136].
Причины внезапного распространения вируса блютанга в Европе до сих пор являются предметом дискуссий [120]. Однако несколько факторов, в том числе увеличение диапазона обитания векторов-переносчиков, изменение климата (особенно более умеренные температуры в зимний период), а так же эффективные механизмы зимовки вируса, вероятно, играют решающую роль в этом процессе. Кроме того, появление новых серотипов в различных регионах Европы может отражать быструю адаптацию вируса блютанга к новым условиям среды и доступным векторам переносчикам вируса (рисунки 1, 2, 3, 4). 1.1.2 Распространение блютанга на территории Российской Федерации
В нашей стране, до середины 20 века государственной ветеринарной службой, блютанг (катаральная лихорадка овец) считался актуальным только для стран Африки. Однако, в начале 70 годов, учёными ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии сделан прогноз о возможности заноса и циркуляции вируса на территории нашей страны. В 1971 г. было получено подтверждение неблагоприятным прогнозам - у овец в Нахичеванском районе Азербайджана были обнаружены антитела к вирусу блютанга, а затем был выделен сам вирус.
В 1987-1989 гг., в результате экспедиционных эпизоотологических обследований в южных приграничных территориях (Украина, Молдавия, Читинская область, республики Средней Азии) в отобранных пробах сывороток крови овец были обнаружены специфические антитела к вирусу блютанга.
Летом 1993 г. в республике Бурятия, в местности Тапхар установлена вспышка блютанга, которая характеризовалась средними показателями заболеваемости (58,3 %) и летальности (66,3 %). Выделенный из крови больной овцы вирус отнесен к 16 серотипу. Очаг болезни в том же году был ликвидирован, а в зонах наблюдения весь скот вакцинирован. С 1994 г. вспышек блютанга на территории РФ не было установлено, и страна считалась благополучной [6, 10, 11].
Актуальность изучения данной болезни значительно возросла с начала 2006 г., когда российскими внешнеторговыми организациями был начат импорт стельных нетелей крупного рогатого скота из стран Европейского Союза. Импортировался скот, в том числе и из неблагополучных по блютангу стран – Германии, Голландии. Так, за период с 2007 по 2015 гг. из стран ЕС было импортировано около 610 тыс. животных в хозяйства, расположенные на всей европейской территории РФ, а также Урале и в Алтайском крае [1, 2, 8, 9, 17, 18].
В результате выполнения лабораторных исследований крови от импортированного скота, были обнаружены серо- и ПЦР-положительные животные. Из крови КРС, импортированного из Нидерландов и Германии в хозяйства Курской, Калининградской и Нижегородской областей, Вялых И.В. и Федоровым Г.П. были выделены 5 изолятов вируса блютанга 8 серотипа. Выделенные штаммы вируса блютанга ФК/1-08, ФК/2-09, ФК/3-09, ФКл/4-09, ФН/5-09 паспортизированы и заложены в Государственную коллекцию микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии [5].
Случаи обнаружения инфицированных вирусом блютанга животных на территории России с 2007 по 2015 гг. по данным Россельхознадзора представлены на рисунке 5. За данный промежуток времени вирус (или антитела против ВБ) были детектированы в 23 различных субъектах РФ. Следует отметить, что случаи обнаружения фиксировали ежегодно, что подчеркивает важность проведения мониторинговых исследований среди импортированного и местного скота, а также актуальность данного заболевания для Российской Федерации [12, 16, 20, 38].
Культуры клеток
Два внутренних слоя капсида ВБ, окружающих кор, представляют собой транскрипционно активную коровую частицу, отвечающую за синтез РНК внутри инфицированной клетки хозяина [40, 152, 155, 157, 170, 178].
Внутренний слой состоит из 120 копий VP3 белка (110 кДа), кодируемого 3 сегментом. VP3 оболочка служит в качестве каркаса для крепления VP7, и вместе они образуют стабильные частици или core-likeparticles (CLP) [170, 173]. Исследования с использованием рентгеновской кристаллографии показали, что VP3 декамеры, которые напоминают чашеобразные структуры, вероятно, являются первыми промежуточными продуктами сборки вирионов и впоследствии будут связаны с VP1 и VP4 белками (Karetal., 2004; Nasonetal, 2004)[105, 108, 111] .
Анализ генетических различий в 3 сегменте генома позволяет разделить изоляты вируса на восточные и западные группы и определить их географическое происхождение (рисунок 8).
Поверхностный слой кора состоит из 780 копий белка VP7 (260 тримеров VP7), кодируемого 7 сегментом, который прикреплен к наружной поверхности субкоровой оболочки. VP7 (38 Ша) является группоспецифическим антигеном, т.е. проявляет высокую степень перекрестных реакций в серологических исследованиях между различными штаммами ВБ (независимо от серотипа или топотипа). В тоже время, в серологических реакциях с другими видами орбивирусов не имеет перекрестных взаимодействий [21]. В связи с этим VP7 является наиболее часто используемой мишенью для серологических тестов, используемых для идентификации ВБ [29, 30]. Также на основе олигонуклеотидных праймеров, комплементарных 7 сегменту, была разработана ОТ-ПЦР для идентификации генома ВБ [70].
Поверхностные белки кора непосредственно участвуют в проникновении вируса в клетку переносчиков (насекомых рода Culicoides). Было продемонстрировано, что VP7 белок участвует в связывании ВБ с мембраной клетки насекомых, а замены в последовательности 7 сегмента могут привести к уменьшению связывания и, следовательно, препятствуют проникновению вируса в клетки мокрецов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что VP7 представляет собой рецептор-связывающий белок в клетках насекомых [152, 170].
7 сегмент является третьим наиболее вариабельным сегментом генома ВБ (после 2 и 6). Нуклеотидные последовательности 7 сегмента группируют в несколько кладов, которые также имеют корреляцию с географическим происхождением изолятов вируса (рисунок 8) [21, 40, 154].
Кор вируса блютанга содержит три минорных белка: VP1, VP4 и VP6, которые необходимы для синтеза вирусной РНК и транскрипции и вместе формируют комплекс репликации, связанный с каждым из 10 сегментов генома [154, 156]. Двухцепочечная РНК никогда не покидает кор и, таким образом, остается защищенной от противовирусных защитных механизмов клетки [40].
Самый крупный из белков вируса блютанга VP1 (149,5 кДа) является РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRp), которая присутствует приблизительно в количестве 12 копий на вирусную частицу [191]. Структура VP1 не определена до сих пор, однако установлено наличие N-концевого домена (-373 а.о.), домена полимеразы (581-880 а.о.) и С-концевого домена. Репликазная активность связана с доменом полимеразы, но зависит также от двух других доменов [150].
1 сегмент, кодирующий VP1 белок, высоко консервативный не только среди различных вариантов ВБ, но и в целом для представителей рода Orbivirus. Кроме того, анализ нуклеотидных последовательностей гена полимеразы применялся для сравнения отдаленно связанных реовирусов, таким образом, возможно определение рода выделенного изолята внутри семейства Reoviridae [155, 157].
Копирующий фермент (метилтрансфераза) (VP4) кодируется 4 сегментом вирусного генома [186]. До начала трансляции, вновь синтезированные вирусные транскрипты должны быть кэпированы. Данный процесс протекает внутри кора и полностью обеспечивается деятельностью белка VP4. Белок содержит С-концевой домен (или GT-домен), обладающий АТФазной активностью, домен N7MTase и N-концевой домен, который содержит неполноценную киназу. Вероятно, киназа необходима для облегчения белок-белковых взаимодействий (с белками VP1 и/или VP3) во время сборки кора [43].
Самый маленький структурный белок (35,7 кДа) - вирусная хеликаза (VP6), которая действует в начале репликации вируса [126]. Данный белок может выступать в качестве РНК-зависимой АТФазы [44, 77, 83, 186]. Фермент участвует в транскрипции, посредством разматывания дуплекса РНК [77, 186]. Исследование, проведенное Kar с его коллегами, показало, что два консервативных мотива играют основную роль в способности VP6 “разматывать” дуплекс [110]. Все минорные коровые компоненты (VP1 (Pol), VP4 (СаР) и VP6 (Неї)) являются высоко консервативными белками [103]. Генетические различия в 1, 4 и 9 сегментах генома, которые их кодируют, также позволяют определить географическое происхождение изолятов вируса блютанга, позволяя разделить их на восточные и западные группы (рисунок 8).
Наиболее консервативные сегменты генома являются потенциальными мишенями для разработки различных вариантов ОТ-ПЦР. В настоящее время для обнаружения РНК ВБ, принадлежащих к восточным или западным топотипам, используют два варианта ОТ-ПЦР в режиме реального времени, в качестве мишени для амплификации выступает 1 сегмент генома ВБ [70].
Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени
Микроцентрифуга «Eppendorf» на 13400 об/мин для пробирок объемом 1,5 мл и 0,5 мл «Axygen»; автоматические дозаторы на 10 мкл, 20 мкл, 100 мкл и 1000 мкл «Gilson», «Ленпипет», «Eppendorf»; многоканальный амплификатор «Терцик МС-2» (Россия); термоциклер «Palm Cycler» («Corbett Research», Австралия); вортекс «Biosan» (Латвия); твердотельный термостат «Biosan» (Латвия); медицинский вакуумный отсасыватель с колбой ловушкой ОМ-1 (ЗАО «Утес») Россия); камера для горизонтального электрофореза («Helicon», Россия); система гельдокументирования «Biorad GelDoc XR» («Bio Rad», США); микроволновая печь VT-1681 («Vitek», Россия); амплификатор для ПНР РВ «IQ-5», «CFX-96» («BioRad», США) и «Rotor gene 6000» («Corbett Research», Австралия); ламинар 2-го класса безопасности («Ламинарные системы», Россия); ПНР-боксы с УФ-лампой («Ламинарные системы», Россия); спектрофотометр «Infinite F-200» («Тесап», Австрия); Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems», США); холодильники поддерживающие температуру + 4 С, - 20 С («ЗИЛ», «Бирюса», Россия).
Для выделения вируса использовали 10-12-суточные куриные эмбрионы. Их исследовали под овоскопом на жизнеспособность, помечали графитным карандашом кровеносный сосуд, который предполагалось использовать для введения материала. Используя бормашину с закрепленными в ней алмазным диском, высверливали в скорлупе на месте отметки треугольник на глубину, достаточную для удаления скорлупы без повреждения подскорлупной оболочки. Высверленный треугольник удаляли, используя стерильный скальпель, приподняв острием вершину. На оболочку наносили каплю минерального масла с целью ее осветления, делая «окошко» во внутреннюю часть яйца. Используя инсулиновый шприц, вводили 0,1 см3 материала при одновременном подсвечивании КЭ овоскопом, после чего иглу медленно удаляли. Правильность введения определяли по прерыванию кровотока при введении материала. Затем отверстие в скорлупе закрывали медицинским лейкопластырем.
Каждым разведением материала инокулировали не менее 4 эмбрионов. Зараженные куриные эмбрионы помещали в термостат при (33+0,5) С и выдерживали в течение 7 дней. В этот период эмбрионы ежедневно овоскопировали, погибшие в течение первых 24 час уничтожали (неспецифическая гибель), остальные эмбрионы после гибели и все оставшиеся живыми на 7 сутки после введения материала эмбрионы охлаждали в холодильнике 2-4 часа при (4+2) С, затем их вскрывали и исследовали зародыш на наличие макроскопических изменений. При выявлении характерных изменений (вишнево-красная окраска, многочисленные кровоизлияния на голове и туловище) из проб органов эмбрионов (печень без желчного пузыря, сердце, почки, мышечная ткань, головной мозг) готовили 10 % суспензию.
При сохранении жизнеспособности эмбрионов через 7 суток или отсутствии характерных изменений у погибших также готовили 10 % суспензию органов и проводили два последовательных пассажа на КЭ. 2.2.1.2 Выделение вируса в культуре клеток
10 % суспензией куриных эмбрионов или подготовленными пробами крови в разведении 10"1 и 10"2 инокулировали культуру клеток Vero, выращенную в культуральных пластиковых матрасах площадью 25 см2. В матрасы после удаления ростовой среды вносили по 1 см3 разведения исследуемого материала и равномерно распределяли его по монослою клеток. На каждое разведение материала использовали по 2 матраса, которые помещали в термостат на 1 час при температуре (37+0,5) С для адсорбции вирусных частиц. Затем монослой отмывали питательной средой для предотвращения токсического воздействия материала, после чего вносили поддерживающую среду в количестве 10 см3. Контролем служили матрасы с интактной культурой клеток, в которых ростовую среду заменяли на поддерживающую.
Зараженную культуру клеток инкубировали при (37+0,5) С. Для учета цитопатического действия вируса (ЦПД) проводили ежедневно микроскопические исследования культур в течение 7 дней.
Цитопатическое действие вируса в культуре клеток Vero, как правило, обнаруживали на 3-5день по наличию разрежения межклеточного пространства, округления клеток и отслоения их от стекла. Затем происходила полная дегенерация клеточного монослоя с разрушением клеточных оболочек. В контрольной не зараженной культуре цитопатические изменения отсутствовали.
В случае отсутствия ЦПД вируса в первом пассаже проводили последовательно до 4 слепых пассажей, используя для заражения материал предыдущего пассажа. Полученный культуральный вируссодержащий материал хранили при (4±2)С. В реакции использовали вирус с известной инфекционной активностью. Готовили серию десятикратных разведений вируса (от 10"1 до 10 8) на питательной среде без сыворотки.
Специфические против различных серотипов ВБ и отрицательные (против гетерологичных вирусов и от интактных животных) сыворотки предварительно инактивировали в водяной бане при 58-60 С в течение 30 мин. и далее использовали в разведении 1:10-1:20. Готовили в стерильных полистироловых 96-луночных планшетах смесь разведений вируса (0,1 см3) и сыворотки в рабочем разведении (0,1 см3), оставляли на контакт при (37± 0,5) С на 1 час. Вносили в 96-луночные культуральные полистироловые планшеты с монослоем культуры клеток (Vero и ВНК 21/13) по 0,1 см3 смеси, содержащей вирус и сыворотку. Одновременно ставили контроли вируса с нормальной сывороткой, контроль активности вируса, а также контроль интактной культуры клеток.
Учет реакции осуществляли на 3-5 сутки. Вначале высчитывали титр вируса в присутствии каждой специфической сыворотки и в присутствии нормальной сыворотки. Нейтрализующую активность исследуемых сывороток определяли вычислением индекса нейтрализации (ИН). ИН представляет частное от деления титра вируса в смеси с нормальной сывороткой на титр в смеси со специфической сывороткой. Логарифм ИН вычисляют по разности логарифмических показателей титра вируса в контроле и в присутствии специфической сыворотки. Положительной считали реакцию с логарифмом ИН 2 и более, а отрицательной -до 2.
Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга 14 серотипа
В последние десятилетия наблюдается тенденция к расширению ареала трансмиссивных инфекций, в том числе и блютанга, что делает актуальным вопрос изучения, как возбудителей данных болезней, так и их переносчиков. Сложившаяся ситуация усугубляется мировым изменением климатических условий, способствующих распространению векторов-переносчиков на новые территории и увеличению численности насекомых. Следствием этого может быть проникновение патогенов в умеренные климатические пояса обоих полушарий и рост количества вспышек в эндемических очагах.
Вирус блютанга «сохраняется» в природе в бесконечной серии чередующихся циклов репликации в насекомых рода Culicoides и в различных видах жвачных млекопитающих. Эксперименты показали, что способность вируса инфицировать и передаваться мокрецами рода Culicoides присуща относительно небольшому числу видов. Таким образом, карта распространения блютанга будет практически совпадать с ареалом распределения восприимчивых насекомых. Что свидетельствует о возможности возникновения эндемичных очагов инфекции в нашей стране.
В связи с тем, что мониторинговые исследования, проведенные среди крупного и мелкого рогатого скота Смоленской и Калужской областей, продемонстрировали широкое распространение вируса среди поголовья, дальнейшей целью нашей работы являлось выявление на данной территории и исследование потенциальных переносчиков – кровососущих мокрецов рода Сulicoides.
Отлов мокрецов проводили в весенне–осенний период в 2011-2012 годах, в радиусе 5, 20, 35 и 300 км от точки локализации инфицированных вирусом блютанга животных.
Насекомых собирали с помощью световых ловушек, развешанных у помещений с животными на тех же фермах, где были выявлены инфицированные или серопозитивные животные. Всего было собрано более 5000 мокрецов рода Сulicoides.
Определение видовой принадлежности мокрецов C. pulicaris complex (C. pulicaris s.s., C.punctatus, C. impunctatus, C. grisescens and C.newsteadi) проводили согласно методике, предложенной Nolan D.V. et al., 2007 [148]. Выявление и типирование вируса блютанга проводили с использованием тест-систем на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
В результате проведенных исследований были выявлены 4 вида мокрецов: C. pulicaris s.s., C.punctatus, C. impunctatus и C. Grisescens, входящих в комплекс C. Pulicaris (рисунок 19). Кроме того, в 3 пулах насекомых был обнаружен геном ВБ.
Электрофореграмма продуктов амплификации. Результаты выявления генома отдельных видов мокрецов, входящих в комплекс C. Pulicaris: А - анализ образцов с использованием специфических праймеров на вид C. Impunctatus; B - анализ образцов с использованием специфических праймеров на вид C.punctatus; C - анализ образцов с использованием специфических праймеров на вид C. pulicaris; D - анализ образцов с использованием специфических праймеров на вид C. grisescens: «К-» - отрицательный контроль реакции, 1-8 – образцы пулов насекомых. Таким образом, установлено присутствие на территории Смоленской и Калужской областей мокрецов C. pulicaris complex - потенциальных переносчиков вируса блютанга. Кроме того, наличие положительного результата ОТ-ПЦР при исследовании обнаруженных на данных территориях мокрецов рода Culicoides может свидетельствовать о персистенции вируса блютанга среди популяций данных насекомых. По данным Россельхознадзора в 2015 году в Смоленской области также были зарегистрированы случаи положительной серодиагностики среди местного скота. Что подтверждает вовлеченность местных видов мокрецов в инфекционный процесс. А также говорит о том, что необходимы повторные исследования по изучению видового состава мокрецов рода Culicoides, на территории данных областей.
Серотип-специфические варианты ОТ-ПЦР широко используются для идентификации серотипа вируса блютанга во всем мире. Ранее в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии были разработаны тест-системы на основе ОТ-ПЦР РВ для идентификации так называемых «европейских» серотипов (1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16) [21]. С учетом неблагополучной эпизоотической ситуации с блютангом в ряде областей России после 2011 г., и принадлежности выделенного вируса к 14 серотипу, было принято решение разработать тест-систему для идентификации данного серотипа методом ОТ-ПЦР.
Использование метода ОТ-ПЦР РВ, как наиболее специфичного и чувствительного, позволяет достоверно идентифицировать штаммы 14 серотипа и дифференцировать их от других серотипов. С помощью программы Сlustal W провели выравнивание имеющихся в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей 2 сегмента геномов ВБ различных серотипов.
В результате найден участок нуклеотидной последовательности размером 203 п.о., специфичный только для изолятов 14 серотипа ВБ (таблица 8). Для разработки ПЦР в режиме реального времени нами была выбрана технология гибридизационных зондов TaqMan, контролирующая кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции использовали комплементарный части амплифицируемого фрагмента зонд, несущий флуорофор и тушитель.